一、本發(fā)明為一種不同年齡小鼠體外腸道炎癥模型的建立方法及其應用，涉及生物。
背景技術(shù)：
0、二、背景技術(shù)
1、動物模型是研究腸道疾病發(fā)病機制與臨床干預的核心工具，嚙齒類動物是動物模型的最佳選擇，一般常用c57bl小鼠模型造模。然而傳統(tǒng)方法存在顯著缺陷：動物造模周期長、成本高，且受遺傳背景、飲食、微生物組等多因素干擾，難以實現(xiàn)標準化；多數(shù)研究采用單一年齡動物模型，聚焦成年動物，忽視幼年、老年等關鍵生長階段的腸道功能差異，難以解析年齡相關腸道疾病(如炎癥性腸病、代謝綜合征)的分子機制。而二維細胞模型如caco-2，無法模擬腸道三維微環(huán)境，細胞間相互作用受限，缺乏體內(nèi)動態(tài)生理條件，如免疫調(diào)控、微生物互作，導致研究結(jié)果與真實病理生理存在偏差。本專利提出一種創(chuàng)新方法：通過il-1β誘導不同年齡小鼠腸道組織體外培養(yǎng)，構(gòu)建tlr4介導的炎癥模型，以克服傳統(tǒng)模型缺陷。直接利用小鼠腸道組織(空腸、回腸或結(jié)腸)進行體外培養(yǎng)，保留腸道上皮屏障、免疫細胞及微生物互作的天然結(jié)構(gòu)，提供真實三維環(huán)境；同步構(gòu)建幼年、成年、中年、老年小鼠模型，多年齡覆蓋，解析年齡依賴性腸道炎癥機制；基于tlr4/myd88/nf-κb信號通路的核心作用，結(jié)合il-1β刺激模擬炎癥級聯(lián)反應，精準模擬病理狀態(tài)。
2、tlr4是先天免疫模式識別受體家族的一員，主要負責傳遞細胞跨膜信號，特異性識別腸道微生物代謝產(chǎn)物lps，激活myd88/nf-κb通路，驅(qū)動il-1β表達，破壞腸屏障完整性，誘發(fā)機體產(chǎn)生炎癥免疫反應，與炎癥性腸病、肥胖相關腸炎密切相關，有望成為一個防治腸炎的新型作用靶點。作為nf-κb信號通路的下游重要的促炎癥細胞因子，il-1β通過自分泌/旁分泌誘導il-8，mcp-1等釋放，招募免疫細胞浸潤，加劇炎癥損傷。老年腸道中tlr4表達上調(diào)及il-1β敏感性增強，導致慢性低度炎癥即“炎性衰老”，與代謝紊亂、免疫衰老直接關聯(lián)。通過定量檢測tlr4通路活性(nf-κb核轉(zhuǎn)位)、腸屏障標志物(zo-1、occludin)、促炎和炎癥因子(il-1β、il-8、mcp-1)及組織病理學變化，可實現(xiàn)模型標準化評估。
3、本發(fā)明可用于解析tlr4在年齡依賴性腸炎、肥胖相關腸屏障損傷中的動態(tài)調(diào)控機制，揭示新型治療靶點；篩選tlr4抑制劑、il-1β拮抗劑或天然抗炎化合物，加速炎癥性腸病、代謝綜合征治療藥物研發(fā)；通過多年齡模型評估個體化干預策略，為兒童、老年炎性腸病提供精準治療方案；模型可擴展至其他tlr家族(如tlr2/5)或疾病場景(如腸道菌群失調(diào)、腸-腦軸調(diào)控)，推動腸道免疫研究范式革新，有很好的轉(zhuǎn)化潛力。此技術(shù)為腸道炎癥機制解析、藥物研發(fā)及年齡特異性治療策略提供了革命性工具，具有顯著的學術(shù)與商業(yè)價值。
技術(shù)實現(xiàn)思路
0、三、
技術(shù)實現(xiàn)要素：
1、技術(shù)問題
2、本發(fā)明的目的是提供一種不同年齡小鼠體外腸道炎癥模型的建立方法及其應用，選擇不同年齡野生型(wt)小鼠和tlr4基因缺失型(tlr4-/-)小鼠，通過檢測其腸道屏障(生物屏障、化學屏障，機械屏障和免疫屏障)，檢測生長發(fā)育及tlr4在其中發(fā)揮的作用。此外，構(gòu)建體外腸道炎癥模型，通過檢測腸道炎癥和通透性的變化，確定tlr4在調(diào)節(jié)腸道屏障中的靶向作用，可為調(diào)節(jié)腸道屏障功能障礙所帶來的疾病提供新的藥物靶點和治療方法。
3、技術(shù)方案：
4、為實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：
5、1)造模動物的選擇：選擇c57bl野生型(wt)(如c57bl/6j品系)和tlr4基因缺失型(tlr4-/-)(c57bl/10scnjgpt品系)小鼠，tlr4-/-小鼠為c57bl/10scn缺失等位基因tlr4lps-del，導致mrna和蛋白的缺失。分別選用幼年(4-9天)、成年(2-4月)、中年(7-9月)、老年(16-19月)的小鼠，來構(gòu)建體外腸道炎癥模型。
6、2)檢測不同年齡腸道屏障：針對小鼠腸道四大屏障(生物屏障，化學屏障，機械屏障和免疫屏障)，對其腸道菌群及其代謝產(chǎn)物、粘蛋白、腸道緊密連接蛋白和腸道促炎因子和炎癥因子及其相關信號通路進行檢測，進一步探究生長發(fā)育對其的影響。
7、3)體外腸道炎癥模型構(gòu)建：取不同年齡新鮮結(jié)腸組織，用1ml?opti-mem減血清培養(yǎng)基無酚紅(20ng/ml重組鼠表皮生長因子、200nm氫化可的松、1％青霉素-鏈霉素)置于37℃，5％co2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1h。加入終濃度1ng/mi的il-1β繼續(xù)刺激結(jié)腸組織2h，得到體外腸道炎癥模型。
8、4)體外腸道炎癥模型的應用：不同年齡wt和tlr4-/-小鼠的體外腸道炎癥模型應用于對炎癥性腸病等腸道慢性疾病有預防和治療作用的食品、藥物或前導活性物質(zhì)、營養(yǎng)品、保健品、飲料等的篩選和效果評價，并驗證其是否通過tlr4靶點達到調(diào)節(jié)腸道屏障的功效。肥胖模型與糖尿病模型小鼠的應用：wt和tlr4-/-肥胖模型與糖尿病模型小鼠應用于對肥胖、糖尿病等代謝性疾病有預防和治療作用的食品(配方)、藥物或前導活性物質(zhì)、營養(yǎng)品、保健品、飲料等的篩選和效果評價，并驗證其是否通過tlr4靶點達到調(diào)節(jié)糖脂代謝的功效。
9、有益效果：
10、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下特點：
11、1)本發(fā)明建立的模型所選小鼠為c57bl實驗小鼠和c57bl/10scnjgpt品系(tlr4-/-)小鼠，均可購買，并且c57bl/10scn缺失等位基因tlr4lps-del，進行繁育的次代品系也為基因缺失型小鼠，建模方法簡單易行，可操作性強，采用il-1β刺激建立體外腸道炎癥模型，規(guī)避傳統(tǒng)動物模型耗時、高成本的局限，為高通量藥物篩選提供高效低成本標準化平臺。
12、2)目前對于腸道屏障功能的研究多集中在年輕或老年群體，研究群體比較單一，并不能廣泛代表各個年齡階段群體和起到對照的效果。本發(fā)明對不同年齡階段的腸道屏障功能展開深入研究，突破年齡維度，首次整合多年齡段腸道體外模型，填補年齡相關腸道疾病研究的空白。
13、3)tlr4在腸道屏障的研究上多作為重要靶點，敲除tlr4可以導致腸道屏障功能的一系列改變。本發(fā)明采用tlr4-il-1β靶向設計，通過tlr4通路與il-1β級聯(lián)的精準調(diào)控，實現(xiàn)病理炎癥的可控模擬，可解析tlr4在年齡依賴性腸炎、肥胖相關腸屏障損傷中的動態(tài)調(diào)控機制，揭示新型治療靶點，應用于對炎癥性腸病等疾病有預防和治療作用的食品、藥物或前導活性物質(zhì)、保健品、營養(yǎng)品等的篩選和效果評價。
1.一種不同年齡小鼠體外腸道炎癥模型的建立方法及其應用，包括了以下步驟：
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種不同年齡小鼠體外腸道炎癥模型的建立方法及其應用，其特征在于：c57bl野生型小鼠(wt)為c57bl/6j品系，tlr4基因缺失型小鼠(tlr4-/-)為c57bl/10scnjgpt品系，即c57bl/10scn缺失等位基因tlr4lps-del，導致mrna和蛋白的缺失。所選不同年齡小鼠，幼年為4-9天，成年為2-4月，中年為7-9月，老年為16-19月。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種不同年齡小鼠體外腸道炎癥模型的建立方法及其應用，其特征在于：針對生物屏障，化學屏障，機械屏障和免疫屏障，包括腸道菌群及其代謝產(chǎn)物、粘蛋白、腸道緊密連接蛋白和腸道促炎因子和炎癥因子及其相關信號通路進行檢測，進一步探究生長發(fā)育以及tlr4在其中發(fā)揮的作用。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種不同年齡小鼠體外腸道炎癥模型的建立方法及其應用，其特征在于：針對小鼠腸道四大屏障(生物屏障，化學屏障，機械屏障和免疫屏障)，對其腸道菌群及其代謝產(chǎn)物、粘蛋白、腸道緊密連接蛋白、腸道促炎因子和炎癥因子及其相關信號通路進行檢測，進一步探究生長發(fā)育對其的影響。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種不同年齡小鼠體外腸道炎癥模型的建立方法及其應用，其特征在于：取不同年齡新鮮結(jié)腸組織體外培養(yǎng)，采用1ml?opti-mem減血清培養(yǎng)基無酚紅(20ng/ml重組鼠標egf、200nm氫化可的松、1％青霉素-鏈霉素)置于37℃，5％co2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1h；il-1β誘導體外腸道炎癥模型，加入的il-1β終濃度為1ng/ml，刺激結(jié)腸組織2h，得到體外腸道炎癥模型。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種不同年齡小鼠體外腸道炎癥模型的建立方法及其應用，其特征在于：構(gòu)建的不同年齡wt和tlr4-/-小鼠的體外腸道炎癥模型可應用于對炎癥性腸病等腸道慢性疾病有預防和治療作用的食品、藥物或前導活性物質(zhì)、營養(yǎng)品、保健品、飲料等的篩選和效果評價，并驗證其是否通過tlr4靶點達到調(diào)節(jié)腸道屏障的功效。