本發(fā)明涉及系統(tǒng)生物學(xué)，具體涉及一種裂殖壺菌酶約束模型的構(gòu)建方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
1、二十碳五烯酸(epa)是一種必需的omega-3多不飽和脂肪酸(pufa)，可以預(yù)防中風(fēng)和高血壓等心血管疾病，具有抗炎和抗癌特性。epa的應(yīng)用范圍涵蓋各個領(lǐng)域，包括保健食品、制藥、動物飼料和食品等，市場需求量極大。裂殖壺菌是一種單細(xì)胞的海洋異養(yǎng)真菌，培養(yǎng)要求簡單，發(fā)酵周期短，脂質(zhì)積累顯著，用于發(fā)酵生產(chǎn)epa有巨大潛力。然而，由于其復(fù)雜的代謝網(wǎng)絡(luò)阻礙了能夠提高epa產(chǎn)生的基因的發(fā)現(xiàn)，導(dǎo)致其代謝物產(chǎn)量較低，極大限制各種產(chǎn)物的產(chǎn)業(yè)化。因此，需要系統(tǒng)地探究裂殖壺菌的生理代謝特性，為發(fā)酵條件的優(yōu)化和提高代謝物產(chǎn)量提供依據(jù)。
2、gsmm(基因組規(guī)模代謝網(wǎng)絡(luò)模型)可以用于預(yù)測和分析微生物的生長情況，從而為提高微生物發(fā)酵生產(chǎn)代謝產(chǎn)物提供有效依據(jù)隨著研究的不斷深入，傳統(tǒng)的gsmm主要是通過對底物的利用作為約束條件進(jìn)行預(yù)測模擬，但只能夠在低吸收速率下保證預(yù)測結(jié)果的精確性。隨著吸收速率的不斷增加，預(yù)測結(jié)果與實驗值的偏差將越來越大。因此，為了提高結(jié)果的精確性，需要在傳統(tǒng)的gsmm的基礎(chǔ)上，整合其他方法。
3、隨著科研的不斷深入，人們逐漸意識到，細(xì)胞的代謝通量不僅受碳源和氧氣供應(yīng)的限制，更受到酶利用效率的制約。為了更準(zhǔn)確地預(yù)測代謝產(chǎn)物的生成，研究者們開始將酶學(xué)參數(shù)融入模型之中，發(fā)展出了諸如fbawmc、ioma、rba和gecko等多種酶限制模型構(gòu)建方法。通過將酶豐度和周轉(zhuǎn)率相關(guān)聯(lián)合并到反應(yīng)化學(xué)計量矩陣s中，gecko使模型能夠直接整合定量蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)。這種酶約束的模型提供了的預(yù)測細(xì)胞表型的能力，超出了傳統(tǒng)的gsmm，顯著降低了代謝反應(yīng)內(nèi)的通量差異性，為研究人員提供了更準(zhǔn)確的代謝過程和酶利用情況。此外，截至目前尚未見到構(gòu)建裂殖壺菌酶約束模型及對其發(fā)酵過程預(yù)測和提高epa產(chǎn)量的相關(guān)報道。
技術(shù)實現(xiàn)思路
1、本發(fā)明的目的是為了克服現(xiàn)有技術(shù)存在的裂殖壺菌發(fā)酵生產(chǎn)epa(二十碳五烯酸)產(chǎn)量較低問題，提供一種裂殖壺菌酶約束模型的構(gòu)建方法和應(yīng)用，該裂殖壺菌酶約束模型具有提供更清晰的代謝途徑和內(nèi)部酶利用情況，預(yù)測和優(yōu)化發(fā)酵條件的功能，為提高epa(二十碳五烯酸)的產(chǎn)量及工業(yè)化生產(chǎn)提供可行依據(jù)。
2、為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明第一方面提供一種裂殖壺菌酶約束模型的構(gòu)建方法，該構(gòu)建方法包括以下步驟：
3、s1、獲取裂殖壺菌的基因組規(guī)模代謝網(wǎng)絡(luò)模型，構(gòu)建裂殖壺菌酶粗模型；
4、s2、獲取酶數(shù)據(jù)并篩選最大kcat值，通過培養(yǎng)實驗獲得裂殖壺菌的蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)；
5、s3、對粗模型中缺失的代謝反應(yīng)進(jìn)行填充、對重復(fù)和錯誤的代謝反應(yīng)進(jìn)行刪除，構(gòu)建酶約束模型；
6、s4、對所述酶約束模型進(jìn)行驗證與分析。
7、優(yōu)選地，步驟s1中所述裂殖壺菌的基因組規(guī)模代謝網(wǎng)絡(luò)模型從web?of?science獲得；
8、步驟s2中所述獲取酶數(shù)據(jù)篩選最大kcat值的過程包括：使用python工具包從brenda和kegg網(wǎng)站檢索相關(guān)酶數(shù)據(jù)，通過網(wǎng)站、公式計算或文獻(xiàn)獲得kcat值，并進(jìn)行比較獲得；所述蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)包含酶豐度信息；
9、步驟s3中所述構(gòu)建酶約束模型采用gecko工具箱；
10、步驟s4中所述驗證與分析的過程包括：使用具備cobra?3.0工具箱的matlab平臺模擬微生物在特定條件下的代謝情況，并與文獻(xiàn)資料中的實驗觀察值進(jìn)行比較。
11、進(jìn)一步優(yōu)選地，所述裂殖壺菌為裂殖壺菌artp誘變菌，更優(yōu)選為裂殖壺菌schizochytrium?sp.atcc?20888的artp誘變菌。
12、本發(fā)明第二方面提供如前所述的方法構(gòu)建的裂殖壺菌酶約束模型在提高二十碳五烯酸產(chǎn)量中的應(yīng)用。
13、本發(fā)明第三方面提供一種提高裂殖壺菌中二十碳五烯酸產(chǎn)量的基因靶點庫，該基因靶點庫包含多個上調(diào)基因靶點和多個下調(diào)基因靶點；
14、所述上調(diào)基因靶點選自aurli1_12987、aurli1_141707、aurli1_138585、aurli1_139580、aurli1_138925、aurli1_139962、aurli1_42771、aurli1_10496、aurli1_81423、aurli1_139044、aurli1_138890、aurli1_82670、aurli1_85731、aurli1_47444中的至少10個；
15、所述下調(diào)基因靶點包含aurli1_43130、aurli1_116966、aurli1_140748、aurli1_81189、aurli1_44258、aurli1_139023中的至少3個。
16、以上靶點可從美國能源部聯(lián)合基因組研究所數(shù)據(jù)庫查詢。
17、優(yōu)選地，所述基因靶點庫的獲得過程包括：將如前所述的方法構(gòu)建的裂殖壺菌酶約束模型，利用蛋白質(zhì)需求性分析獲得裂殖壺菌中提高二十碳五烯酸產(chǎn)量的基因靶點。
18、本發(fā)明第四方面提供一種提高二十碳五烯酸產(chǎn)量的方法，該方法控制裂殖壺菌的氮源吸收速率為0.35-3.5mmol/gdw/h，控制裂殖壺菌的氧氣吸收速率為0.1-7mmol/gdw/h。
19、優(yōu)選地，所述氮源吸收速率和氧氣吸收速率利用如前所述的方法構(gòu)建的裂殖壺菌酶約束模型中的魯棒性分析程序進(jìn)行模擬控制。
20、本發(fā)明第五方面提供一種提高二十碳五烯酸產(chǎn)量的發(fā)酵生產(chǎn)方法，該生產(chǎn)方法包括：將二十碳五烯酸生產(chǎn)菌進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，其中，所述發(fā)酵培養(yǎng)的培養(yǎng)基中酵母粉含量為4-10g/l，玉米漿含量為2-5g/l，硫酸銨含量為1.6-4g/l。
21、優(yōu)選地，所述發(fā)酵培養(yǎng)的培養(yǎng)基組分還含有：硫酸鈉10-15g/l，七水硫酸鎂1-3g/l，氯化鉀0.1-1g/l，硫酸鉀0.2-1g/l，氯化鈣0.1-0.2g/l，味精8-12g/l，蘋果酸0.2-1g/l，葡萄糖40-50g/l，磷酸二氫鉀0.5-1.5g/l。
22、優(yōu)選地，所述二十碳五烯酸生產(chǎn)菌為裂殖壺菌。
23、優(yōu)選地，所述發(fā)酵生產(chǎn)的反應(yīng)條件包括：轉(zhuǎn)速為300-380rpm，通氣速率為2-4vvm，接種量為10-15體積％。
24、優(yōu)選地，所述發(fā)酵培養(yǎng)的過程包括：在所述發(fā)酵培養(yǎng)開始20-24h后將發(fā)酵液的ph調(diào)節(jié)至6.3-6.5，發(fā)酵培養(yǎng)的總時間為100-120h。
1.一種裂殖壺菌酶約束模型的構(gòu)建方法，其特征在于，所述構(gòu)建方法包括以下步驟：
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的構(gòu)建方法，其特征在于，步驟s1中所述裂殖壺菌的基因組規(guī)模代謝網(wǎng)絡(luò)模型從web?of?science獲得；
3.權(quán)利要求1或2所述的方法構(gòu)建的裂殖壺菌酶約束模型在提高二十碳五烯酸產(chǎn)量中的應(yīng)用。
4.一種提高裂殖壺菌中二十碳五烯酸產(chǎn)量的基因靶點庫，其特征在于，所述基因靶點庫包含多個上調(diào)基因靶點和多個下調(diào)基因靶點；
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的基因靶點庫，其特征在于，所述基因靶點庫的獲得過程包括：將權(quán)利要求1或2所述的方法構(gòu)建的裂殖壺菌酶約束模型利用蛋白質(zhì)需求性分析獲得裂殖壺菌中提高二十碳五烯酸產(chǎn)量的基因靶點。
6.一種提高二十碳五烯酸產(chǎn)量的調(diào)控方法，其特征在于，所述方法控制裂殖壺菌的氮源吸收速率為0.35-3.5mmol/gdw/h，控制裂殖壺菌的氧氣吸收速率為0.1-7mmol/gdw/h。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所述氮源吸收速率和氧氣吸收速率利用權(quán)利要求1或2所述的方法構(gòu)建的裂殖壺菌酶約束模型中的魯棒性分析程序進(jìn)行模擬控制。
8.一種提高二十碳五烯酸產(chǎn)量的發(fā)酵生產(chǎn)方法，其特征在于，該生產(chǎn)方法包括：將二十碳五烯酸生產(chǎn)菌進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，其中，所述發(fā)酵培養(yǎng)的培養(yǎng)基中酵母粉含量為4-10g/l，玉米漿含量為2-5g/l，硫酸銨含量為1.6-4g/l。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，所述發(fā)酵培養(yǎng)的培養(yǎng)基組分還含有：硫酸鈉10-15g/l，七水硫酸鎂1-3g/l，氯化鉀0.1-1g/l，硫酸鉀0.2-1g/l，氯化鈣0.1-0.2g/l，味精8-12g/l，蘋果酸0.2-1g/l，葡萄糖40-50g/l，磷酸二氫鉀0.5-1.5g/l；
10.根據(jù)權(quán)利要求8或9所述的方法，其特征在于，所述發(fā)酵培養(yǎng)的過程包括：在所述發(fā)酵培養(yǎng)開始20-24h后將發(fā)酵液的ph調(diào)節(jié)至6.3-6.5，發(fā)酵培養(yǎng)的總時間為100-120h。