本發(fā)明涉及開發(fā)用于生物制藥蛋白質(zhì)生產(chǎn)的細(xì)胞系的方法，特別是用于確定或預(yù)測(cè)克隆細(xì)胞系的生產(chǎn)穩(wěn)定性的方法和系統(tǒng)，以及用于選擇克隆細(xì)胞系的方法和系統(tǒng)。
背景技術(shù)：
1、完全人類抗體可以使用多種方法來獲得(例如使用能夠產(chǎn)生人類抗體組庫的基于酵母的文庫或轉(zhuǎn)基因動(dòng)物(例如小鼠))。在其表面呈現(xiàn)與感興趣的抗原結(jié)合的人類抗體的酵母可以使用基于facs(熒光激活細(xì)胞分選)的方法或通過使用標(biāo)記的抗原在珠上捕獲來選擇。已經(jīng)被修飾以表達(dá)人免疫球蛋白基因的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物可以用感興趣的抗原免疫并使用b細(xì)胞分選技術(shù)分離抗原特異性人類抗體。然后可以表征使用這些技術(shù)生產(chǎn)的人類抗體的期望性質(zhì)，例如親和力、可開發(fā)性和選擇性。
2、哺乳動(dòng)物細(xì)胞系被用作細(xì)胞工廠，以創(chuàng)建生產(chǎn)治療性蛋白質(zhì)的克隆細(xì)胞系。將編碼感興趣蛋白質(zhì)的核酸序列克隆到表達(dá)載體中，然后轉(zhuǎn)染到宿主細(xì)胞系中。轉(zhuǎn)染的池被脹大，分選單細(xì)胞，并使這些分選的單細(xì)胞生長(zhǎng)，然后對(duì)克隆細(xì)胞系生產(chǎn)感興趣的蛋白進(jìn)行評(píng)估?？寺〖?xì)胞系根據(jù)其產(chǎn)物濃度進(jìn)行排序，并經(jīng)過一系列分類事件，直到選擇約50個(gè)克隆細(xì)胞系進(jìn)入生產(chǎn)穩(wěn)定性評(píng)估。
3、此類哺乳動(dòng)物細(xì)胞系的示例包括鼠骨髓瘤細(xì)胞(ns0)、幼倉鼠腎細(xì)胞(bhk)、人胚胎腎細(xì)胞(hek293)和中國倉鼠卵巢細(xì)胞(cho)。目前批準(zhǔn)的重組蛋白中超過80％是在cho細(xì)胞中生產(chǎn)的(butler&spearman,2014；walsh,2018)。cho細(xì)胞廣泛使用的原因包括它們?cè)诮邮蘸捅磉_(dá)外源dna方面相對(duì)容易、生長(zhǎng)速度快、它們的蛋白質(zhì)折疊機(jī)制的可靠性、它們對(duì)無血清懸浮培養(yǎng)的適應(yīng)性，以及它們生產(chǎn)具有類人類翻譯后修飾的蛋白質(zhì)的能力。
4、然而，已知細(xì)胞系(例如cho細(xì)胞)具有高水平的染色體和基因組異質(zhì)性(wurm&wurm,2017)。由于這種遺傳可塑性，細(xì)胞系可能表現(xiàn)出生產(chǎn)不穩(wěn)定性，由此在長(zhǎng)期培養(yǎng)期間觀察到重組蛋白數(shù)量和質(zhì)量的下降(dahodwala&lee,2019)。
5、因此，生物制藥制造商必須向監(jiān)管機(jī)構(gòu)證明，用于治療性產(chǎn)物生產(chǎn)的細(xì)胞隨著時(shí)間的推移保持穩(wěn)定的蛋白質(zhì)質(zhì)量。細(xì)胞系生產(chǎn)穩(wěn)定性試驗(yàn)通常設(shè)計(jì)有跨越60至80個(gè)細(xì)胞系世代的3或4個(gè)評(píng)估點(diǎn)。在這些穩(wěn)定性試驗(yàn)中測(cè)試的細(xì)胞系在其表現(xiàn)出重組蛋白濃度下降小于30％時(shí)通常被定義為穩(wěn)定(dahodwala&lee,2019)。在這一標(biāo)準(zhǔn)下，據(jù)估計(jì)，在生產(chǎn)穩(wěn)定性試驗(yàn)中評(píng)估的所有cho細(xì)胞系中高達(dá)63％被分類為不穩(wěn)定(dahodwala&lee,2019)。
6、在整個(gè)制造期不維持產(chǎn)物濃度的情況下，工藝產(chǎn)率可能會(huì)對(duì)時(shí)間線具有重大影響，因?yàn)橹圃鞎r(shí)間表通常提前至少一年預(yù)訂。因此，出乎意料的低產(chǎn)物產(chǎn)率可導(dǎo)致對(duì)調(diào)度具有巨大影響和對(duì)產(chǎn)物分布產(chǎn)生連鎖反應(yīng)的重復(fù)制造運(yùn)行。因此，這些穩(wěn)定性試驗(yàn)對(duì)制造商來說代表重要但耗時(shí)且資源密集型的工作。
7、在軟傳感器領(lǐng)域的背景下，建模技術(shù)通常已應(yīng)用于工業(yè)過程監(jiān)控(ramaker等,2005；camacho等,2008；gunther等,2008)。軟傳感器可以將諸如溫度、ph和溶解氧(do)的過程變量的在線測(cè)量納入到模型中以預(yù)測(cè)輸出變量。例如，gunther等人使用在線過程變量測(cè)量來預(yù)測(cè)產(chǎn)物滴度。然而，在軟傳感器領(lǐng)域尚未實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞系生產(chǎn)穩(wěn)定性的重要質(zhì)量的令人滿意預(yù)測(cè)。因此，細(xì)胞系生產(chǎn)穩(wěn)定性試驗(yàn)仍然是耗時(shí)且昂貴的任務(wù)。
8、因此，目前需要減少在細(xì)胞系生產(chǎn)穩(wěn)定性試驗(yàn)期間花費(fèi)的時(shí)間量和資源的方法。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
1、根據(jù)第一方面，提供了一種選擇用于生產(chǎn)治療性蛋白質(zhì)的克隆細(xì)胞系的方法，該方法包括：對(duì)于多個(gè)克隆細(xì)胞系，測(cè)量每個(gè)克隆細(xì)胞系的產(chǎn)物濃度；基于產(chǎn)物濃度，確定每個(gè)克隆細(xì)胞系的產(chǎn)物濃度圖譜(profile)數(shù)據(jù)；將產(chǎn)物濃度圖譜數(shù)據(jù)輸入到包括建?？蚣艿膶W(xué)習(xí)模型中；其中建?？蚣馨ǘ嘧兞繚撛谧兞拷?、多向分析結(jié)構(gòu)和演化模型結(jié)構(gòu)；使用學(xué)習(xí)模型，生成指示每個(gè)克隆細(xì)胞系的生產(chǎn)穩(wěn)定性的輸出；以及基于該輸出，選擇用于生產(chǎn)治療性蛋白質(zhì)產(chǎn)物的克隆細(xì)胞系。
2、根據(jù)第二方面，提供了一種用于產(chǎn)生治療性蛋白質(zhì)的方法，該方法包括：對(duì)于多個(gè)克隆細(xì)胞系，測(cè)量每個(gè)克隆細(xì)胞系的產(chǎn)物濃度；基于產(chǎn)物濃度，確定每個(gè)克隆細(xì)胞系的產(chǎn)物濃度圖譜數(shù)據(jù)；將產(chǎn)物濃度圖譜數(shù)據(jù)輸入到包括建?？蚣艿膶W(xué)習(xí)模型中；其中建模框架包括多變量潛在變量建模、多向分析結(jié)構(gòu)和演化模型結(jié)構(gòu)；使用學(xué)習(xí)模型，生成指示每個(gè)克隆細(xì)胞系的生產(chǎn)穩(wěn)定性的輸出；基于該輸出，選擇用于生產(chǎn)治療性蛋白質(zhì)產(chǎn)物的克隆細(xì)胞系。
3、根據(jù)進(jìn)一步的方面，提供了一種用于確定克隆細(xì)胞系生產(chǎn)穩(wěn)定性或選擇克隆細(xì)胞系的系統(tǒng)，該系統(tǒng)包括：(a)用于接收克隆細(xì)胞系產(chǎn)物濃度圖譜數(shù)據(jù)的輸入；(b)用于確定克隆細(xì)胞系生產(chǎn)穩(wěn)定性或選擇克隆細(xì)胞系的學(xué)習(xí)模型，學(xué)習(xí)模型包括建?？蚣?，建?？蚣馨ǘ嘧兞繚撛谧兞拷?、多向分析結(jié)構(gòu)和演化模型結(jié)構(gòu)；(c)用于利用學(xué)習(xí)模型處理克隆細(xì)胞系產(chǎn)物濃度圖譜數(shù)據(jù)的一個(gè)或多個(gè)處理器；以及(d)用于基于通過學(xué)習(xí)模型對(duì)克隆細(xì)胞系產(chǎn)物濃度圖譜數(shù)據(jù)的處理，提供克隆細(xì)胞系生產(chǎn)穩(wěn)定性的指示的輸出。
4、根據(jù)進(jìn)一步的方面，提供了一種計(jì)算機(jī)程序，其包括指令，當(dāng)程序由計(jì)算機(jī)或一個(gè)或多個(gè)數(shù)據(jù)處理器執(zhí)行時(shí)使計(jì)算機(jī)執(zhí)行根據(jù)本文描述的方法的操作。
5、根據(jù)進(jìn)一步的方面，提供了一種計(jì)算機(jī)可讀介質(zhì)，其包括指令，當(dāng)由計(jì)算機(jī)或(一個(gè)或多個(gè))數(shù)據(jù)處理器執(zhí)行時(shí)使計(jì)算機(jī)執(zhí)行根據(jù)本文描述的方法的操作。
6、根據(jù)進(jìn)一步的方面，提供了一種計(jì)算機(jī)可讀數(shù)據(jù)載體，其上存儲(chǔ)有本文所描述的計(jì)算機(jī)程序。
7、本公開的方法和系統(tǒng)是有利的，因?yàn)樗鼈冇兄诳寺〖?xì)胞系生產(chǎn)穩(wěn)定性的早期穩(wěn)健預(yù)測(cè)。特別地，將克隆細(xì)胞系產(chǎn)物濃度圖譜測(cè)量結(jié)果納入到本文所描述的建?？蚣苤刑峁┝思夹g(shù)優(yōu)勢(shì)，因?yàn)榕c其他方法相比，克隆細(xì)胞系生產(chǎn)穩(wěn)定性可以以更高的準(zhǔn)確性和效率預(yù)測(cè)，以幫助在生物制藥開發(fā)過程期間選擇克隆細(xì)胞系。通過在細(xì)胞系開發(fā)(cld)期的早期階段應(yīng)用此方法，有可能更早地分類預(yù)測(cè)為生產(chǎn)不穩(wěn)定的克隆細(xì)胞系，從而增加cld能力并減少化學(xué)、制造和控制(cmc)時(shí)間線。
8、本發(fā)明的一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方案的細(xì)節(jié)在以下所附描述中闡述。從說明書和權(quán)利要求書中，本發(fā)明的其它特征、目的和優(yōu)點(diǎn)將是顯而易見的。
1.一種選擇用于生產(chǎn)治療性蛋白質(zhì)的克隆細(xì)胞系的方法，所述方法包括：
2.一種用于生產(chǎn)治療性蛋白質(zhì)的方法，所述方法包括：
3.如權(quán)利要求1或2所述的方法，其中所述多變量潛在變量建模包括以下中的至少一個(gè)：對(duì)潛在結(jié)構(gòu)的投影(pls)和主成分分析(pca)。
4.如權(quán)利要求3所述的方法，其中所述pls包括以下中的至少一個(gè)：pls判別分析(pls-da)、pls支持向量機(jī)(pls-svm)、pls神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)(pls-nn)、pls邏輯回歸(pls-lr)、pls-k-最近鄰(pls-knn)、pls決策樹(pls-dt)、pls樸素貝葉斯(pls-nb)、pls隨機(jī)森林(pls-rf)和pls梯度提升(pls-gb)。
5.如前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述克隆細(xì)胞系的產(chǎn)物濃度圖譜數(shù)據(jù)包括以下中的一個(gè)或多個(gè)：平均產(chǎn)物濃度、標(biāo)準(zhǔn)偏差、偏度、峰度、差值、最大產(chǎn)物濃度和最大-最小梯度。
6.如前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其中對(duì)于多個(gè)克隆細(xì)胞系，測(cè)量每個(gè)克隆細(xì)胞系的產(chǎn)物濃度包括跨多個(gè)生產(chǎn)運(yùn)行測(cè)量每個(gè)克隆細(xì)胞系的產(chǎn)物濃度。
7.如前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其中測(cè)量每個(gè)克隆細(xì)胞系的產(chǎn)物濃度包括測(cè)量每個(gè)克隆細(xì)胞系的產(chǎn)物濃度至多達(dá)150代的世代數(shù)。
8.如權(quán)利要求6或7所述的方法，還包括獲得每個(gè)生產(chǎn)運(yùn)行的世代數(shù)分布。
9.如前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述演化模型結(jié)構(gòu)包括分析連續(xù)生產(chǎn)運(yùn)行的產(chǎn)物濃度圖譜數(shù)據(jù)。
10.如前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述克隆細(xì)胞系是哺乳動(dòng)物細(xì)胞系。
11.如權(quán)利要求10所述的方法，其中所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞系是cho細(xì)胞系。
12.如前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述產(chǎn)物濃度以多個(gè)生物反應(yīng)器規(guī)模測(cè)量。
13.如前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，還包括使用所選擇的克隆細(xì)胞系來產(chǎn)生所述治療性蛋白質(zhì)。
14.如前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述產(chǎn)物濃度包括單克隆抗體的濃度。
15.一種用于確定克隆細(xì)胞系生產(chǎn)穩(wěn)定性或選擇克隆細(xì)胞系的系統(tǒng)，所述系統(tǒng)包括：
16.一種計(jì)算機(jī)程序，包括指令，當(dāng)所述程序由計(jì)算機(jī)或數(shù)據(jù)處理器執(zhí)行時(shí)，使所述計(jì)算機(jī)執(zhí)行根據(jù)如權(quán)利要求1-14中任一項(xiàng)所述的方法的操作。
17.一種計(jì)算機(jī)可讀介質(zhì)，包括指令，當(dāng)由計(jì)算機(jī)或數(shù)據(jù)處理器執(zhí)行時(shí)，使所述計(jì)算機(jī)執(zhí)行根據(jù)如權(quán)利要求1-14中任一項(xiàng)所述的方法的操作。
18.如權(quán)利要求16所述的程序或如權(quán)利要求17所述的介質(zhì)，其中所述指令在執(zhí)行時(shí)實(shí)施(a)學(xué)習(xí)模型和/或任何相關(guān)函數(shù)和/或(b)預(yù)測(cè)克隆細(xì)胞系生產(chǎn)穩(wěn)定性的系統(tǒng)。
19.如權(quán)利要求16、17或18所述的程序或介質(zhì)，其中所述指令在執(zhí)行時(shí)輸出具有克隆細(xì)胞系生產(chǎn)穩(wěn)定性的指示的輸出。
20.一種計(jì)算機(jī)可讀數(shù)據(jù)載體，其上存儲(chǔ)有如權(quán)利要求16所述的計(jì)算機(jī)程序。