本發(fā)明屬于基因工程和酶催化合成,具體涉及以糖基轉(zhuǎn)移酶結(jié)構(gòu)為基礎(chǔ),通過(guò)半理性設(shè)計(jì)和分子模擬進(jìn)行突變體設(shè)計(jì),利用糖基轉(zhuǎn)移酶ugt76g1多位點(diǎn)突變體高效合成萊鮑迪苷m,該方法對(duì)于天然代糖萊鮑迪苷m產(chǎn)量的提高具有重要意義。
背景技術(shù):
1、由于高熱量糖類(lèi)的過(guò)量攝入導(dǎo)致世界范圍內(nèi)嚴(yán)重的過(guò)度肥胖、糖尿病、高血壓和心腦血管等疾病,為了減少高熱量糖的攝入,低熱量甜味劑應(yīng)運(yùn)而生。其中,來(lái)源于甜葉菊的天然甜味劑甜菊糖苷因其具有穩(wěn)定安全、高甜低熱的特點(diǎn)而受到廣泛關(guān)注。含量較為豐富的甜菊苷和萊鮑迪苷a口感較差,苦澀后味影響其應(yīng)用和推廣,而萊鮑迪苷m不僅甜度高(大約是蔗糖的350倍),而且沒(méi)有苦澀后味,口感極佳,被認(rèn)為是理想的高熱量糖的替代品。但是,萊鮑迪苷m僅占甜葉菊葉片干重的0.4%-0.5%,這就阻礙了從甜葉菊葉片中提取萊鮑迪苷m進(jìn)行大規(guī)模應(yīng)用。目前,已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了甜葉菊來(lái)源的糖基轉(zhuǎn)移酶ugt76g1可以催化萊鮑迪苷d生成萊鮑迪苷m,該方法具有專(zhuān)一性強(qiáng)、轉(zhuǎn)化效率高、反應(yīng)條件溫和、綠色無(wú)污染等優(yōu)點(diǎn),但是其催化效率低仍然是萊鮑迪苷m工業(yè)化制備的瓶頸。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
1、為解決上述糖基轉(zhuǎn)移酶ugt76g1催化萊鮑迪苷d合成萊鮑迪苷m效率低的問(wèn)題,本發(fā)明基于蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的半理性設(shè)計(jì)對(duì)糖基轉(zhuǎn)移酶ugt76g1進(jìn)行定點(diǎn)突變構(gòu)建多位點(diǎn)突變體,提高其催化活性以滿(mǎn)足萊鮑迪苷m的工業(yè)化制備,從而實(shí)現(xiàn)了萊鮑迪苷m的高效生物合成。
2、本發(fā)明的第一個(gè)目的是提供一種高效的糖基轉(zhuǎn)移酶突變體,利用基因工程手段,對(duì)糖基轉(zhuǎn)移酶進(jìn)行定點(diǎn)突變,所述突變體為將seq?id?no.1所示的糖基轉(zhuǎn)移酶ugt76g1第88位的甲硫氨酸突變?yōu)楫惲涟彼?,?99位的異亮氨酸突變?yōu)榱涟彼幔?00位的亮氨酸突變?yōu)楸彼?,同時(shí)將第284位的蘇氨酸突變?yōu)榻z氨酸。
3、在一種實(shí)施方式中,編碼所述糖基轉(zhuǎn)移酶ugt76g1的核苷酸序列為seq?id?no:1所示,氨基酸序列如seq?id?no:2所示;所述糖基轉(zhuǎn)移酶突變體的氨基酸序列如seq?id?no:3所示。
4、本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供一種在最適反應(yīng)溫度和ph下用高效液相法表征糖基轉(zhuǎn)移酶ugt76g1突變體活性的方法。
5、本發(fā)明的第三個(gè)目的提供上述糖基轉(zhuǎn)移酶突變體的基因。
6、本發(fā)明的第四個(gè)目的是提供攜帶編碼上述糖基轉(zhuǎn)移酶突變體的基因的表達(dá)載體。
7、本發(fā)明的第五個(gè)目的是提供一種催化合成萊鮑迪苷m的方法,所述方法為以reb?d為底物,以u(píng)dpg為第二底物,在ph為8.0,溫度為47℃的搖床中,使用純化得到的糖基轉(zhuǎn)移酶ugt76g1突變體進(jìn)行催化反應(yīng),生物合成萊鮑迪苷m。
8、在一種實(shí)施方式中,所述催化反應(yīng)的條件為:以1mmol/l?reb?d、1mmol/l?udpg、5mmol/lkpi緩沖液、47℃的環(huán)境,反應(yīng)30min。
9、所述突變體的構(gòu)建方法,包括如下步驟:
10、(1)通過(guò)分子對(duì)接、分子模擬等技術(shù)手段對(duì)糖基轉(zhuǎn)移酶ugt76g1的結(jié)構(gòu)進(jìn)行半理性設(shè)計(jì),設(shè)計(jì)定點(diǎn)突變的突變引物進(jìn)行pcr,構(gòu)建含編碼突變體的基因的質(zhì)粒載體;所述突變體質(zhì)粒載體為pet32a(+);
11、(2)將突變體質(zhì)粒轉(zhuǎn)化進(jìn)大腸桿菌宿主細(xì)胞中。
12、(3)挑取單克隆,進(jìn)一步轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細(xì)胞c41中,搖瓶擴(kuò)大培養(yǎng),通過(guò)親和層析提取、離子交換層析純化,獲得去除鹽離子的高純度糖基轉(zhuǎn)移酶ugt76g1。
13、本發(fā)明還提供了所述糖基轉(zhuǎn)移酶突變體在制備萊鮑迪苷m中的應(yīng)用。
14、與現(xiàn)有技術(shù)相比,本發(fā)明的有益效果如下:
15、本發(fā)明將糖基轉(zhuǎn)移酶ugt76g1的氨基酸序列進(jìn)行定點(diǎn)突變,得到
16、ugt76g1-m88i/i199l/l200a/t284s最優(yōu)突變體,顯著提高糖基轉(zhuǎn)移酶ugt76g1在以u(píng)dpg為糖基供體,催化reb?d生物合成reb?m的效率,kcat/km提升至0.44(s-1·mm-1),相對(duì)酶活能達(dá)到野生型ugt76g1酶的6倍。
1.一種基于分子對(duì)接構(gòu)建的催化活性較高的糖基轉(zhuǎn)移酶突變體,其特征在于將seq?idno.1所示的糖基轉(zhuǎn)移酶ugt76g1第88位的甲硫氨酸突變?yōu)楫惲涟彼?,將?99位的異亮氨酸突變?yōu)榱涟彼?,將?00位的亮氨酸突變?yōu)楸彼幔瑫r(shí)將第284位的蘇氨酸突變?yōu)榻z氨酸。
2.在最適反應(yīng)溫度和ph下用高效液相法表征權(quán)利要求1中所述糖基轉(zhuǎn)移酶突變體酶活性。
3.一種糖基轉(zhuǎn)移酶ugt76g1表達(dá)載體的構(gòu)建與制備方法,其特征在于以大腸桿菌為宿主,以pet-32a為載體,表達(dá)權(quán)利要求1所述糖基轉(zhuǎn)移酶突變體。
4.一種提高糖基轉(zhuǎn)移酶催化活力的方法,其特征在于,將氨基酸序列如seq?id?no.1所示的糖基轉(zhuǎn)移酶ugt76g1的第88位的甲硫氨酸突變?yōu)楫惲涟彼?,將?99位的異亮氨酸突變?yōu)榱涟彼?,將?00位的亮氨酸突變?yōu)楸彼幔瑫r(shí)將第284位的蘇氨酸突變?yōu)榻z氨酸。
5.根據(jù)權(quán)利要求5所述的催化合成產(chǎn)物萊鮑迪苷m的方法,其特征在于,向含有1mm/l底物萊鮑迪苷d和1mm/l底物udpg的反應(yīng)體系中,添加權(quán)利要求4所述的糖基轉(zhuǎn)移酶,反應(yīng)制備得到萊鮑迪苷m。