本發(fā)明屬于植物病害領(lǐng)域，更具體地，涉及發(fā)光標(biāo)記重組菌xap-lux及其構(gòu)建方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
1、桃細(xì)菌性穿孔病是桃普遍發(fā)生的重要病害之一。該病主要由黃單胞桿菌侵染引起，危害桃葉片及果實，形成穿孔斑?；瘜W(xué)藥劑防治是治療該病的有效方法之一，因此，篩選和應(yīng)用高效的藥劑是防治該病最經(jīng)濟(jì)有效的措施。
2、已報道的植物病原細(xì)菌的檢測方法主要通過平板菌落計數(shù)法、生理生化法及核酸定量法等，而對藥劑的篩選方法多以平板抑菌圈法等，這些方法雖然不依賴癥狀等進(jìn)行病原細(xì)菌的定量分析，但繁瑣、昂貴、耗時，不適合高通量測定或大規(guī)模定量篩查。生物發(fā)光是一種基于熒光素酶催化熒光素底物的酶促反應(yīng)，利用生物發(fā)光基因lux對生物體進(jìn)行標(biāo)記已逐漸應(yīng)用到植物與病原細(xì)菌的互作中，以監(jiān)測其生長和組織內(nèi)分布以及檢測特定基因的表達(dá)。
3、早期研究利用轉(zhuǎn)座子載體將不含啟動子元件的lux基因插入卷心菜黃單胞菌基因組以表達(dá)lux，用于監(jiān)測田間黃單胞菌種群及其在植物中的生長。但這種方法制備出的重組菌其表型會發(fā)生變化且發(fā)光穩(wěn)定性也受到影響。
技術(shù)實現(xiàn)思路
1、為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明的目的在于提供發(fā)光標(biāo)記重組菌xap-lux及其構(gòu)建方法和應(yīng)用。
2、為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下：
3、本發(fā)明提供了發(fā)光標(biāo)記重組菌xap-lux，是將luxcdabe操縱子整合到桃細(xì)菌性穿孔病病原菌基因組上獲得的。
4、本發(fā)明通過將組成型卡那霉素啟動子控制的luxcdabe操縱子插入xap菌株的基因組，構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)的組成型發(fā)光標(biāo)記重組菌xap-lux。利用吸光值測定和生物發(fā)光測定法，對發(fā)光標(biāo)記重組菌xap-lux的生長和致病力進(jìn)行分析顯示luxcdabe操縱子的插入并未影響菌株的生長和致病力。進(jìn)一步基于細(xì)菌生物發(fā)光值對發(fā)光標(biāo)記重組菌xap-lux進(jìn)行抑菌藥劑篩選。發(fā)現(xiàn)發(fā)光標(biāo)記重組菌xap-lux可用于桃細(xì)菌性穿孔病菌的快速定量以及在藥劑篩選中的高通量檢測，為桃細(xì)菌性穿孔病的防治等研究奠定基礎(chǔ)。
5、本發(fā)明還提供了所述發(fā)光標(biāo)記重組菌xap-lux的構(gòu)建方法，包括以下步驟：
6、s1、將luxcdabe操縱子與被ecor?i酶切的pme6012質(zhì)粒連接，獲得質(zhì)粒pme6012-luxcdabe；
7、s2、通過電擊轉(zhuǎn)化法將質(zhì)粒pme6012-luxcdabe導(dǎo)入xap感受態(tài)中得到轉(zhuǎn)化子；
8、s3、通過電擊轉(zhuǎn)化法將質(zhì)粒pme6012-luxcdabe導(dǎo)入桃細(xì)菌性穿孔病病原菌中得到轉(zhuǎn)化子并篩選，獲得所述發(fā)光標(biāo)記重組菌xap-lux。
9、進(jìn)一步的，所述電擊轉(zhuǎn)化的條件為：電壓2000～2100v，電擊杯間隙1～2mm。
10、進(jìn)一步的，所述篩選轉(zhuǎn)化子的條件為將轉(zhuǎn)化子涂在含10～20μg/ml四環(huán)素的kb培養(yǎng)基平板上，28℃培養(yǎng)2～3d。
11、本發(fā)明還提供所述的發(fā)光標(biāo)記重組菌xap-lux在制備抑菌劑篩選產(chǎn)品中的應(yīng)用，所述抑菌劑用于抑制桃細(xì)菌性穿孔病病原菌。
12、本發(fā)明還提供一種高通量篩選抑菌劑的方法，所述方法包括以下步驟：向上述的發(fā)光標(biāo)記重組菌xap-lux給予待測藥物并共培養(yǎng)，共培養(yǎng)結(jié)束后檢測所述發(fā)光標(biāo)記重組菌xap-lux的生物發(fā)光值，與不給予待測藥物的空白對照相比，所述生物發(fā)光值的降低指示待測藥物對桃細(xì)菌性穿孔病病原菌有抑制作用。
13、進(jìn)一步的，所述共培養(yǎng)條件為25～28℃、190～210rpm培養(yǎng)30～36h。
14、進(jìn)一步的，通過多功能酶標(biāo)儀檢測生物發(fā)光值，測定波長為450～500nm。
15、本發(fā)明具有以下有益效果：
16、本發(fā)明通過將組成型啟動子控制發(fā)光桿菌photorhabdus?luminescens的luxcdabe操縱子，插入到桃細(xì)菌性穿孔病菌的基因組中，構(gòu)建出表型和發(fā)光性穩(wěn)定的發(fā)光細(xì)菌xap-lux。該方法可基于生物發(fā)光值對細(xì)菌數(shù)量進(jìn)行方便、快速、可靠的評價。對此，進(jìn)一步大規(guī)模定量測定了不同藥劑中xap-lux的生物發(fā)光值，對不同藥劑的抑菌效果進(jìn)行評價，并利用常規(guī)方法佐證了該菌株的應(yīng)用及測定方法的可靠性。
1.發(fā)光標(biāo)記重組菌xap-lux，其特征在于，是將luxcdabe操縱子整合到桃細(xì)菌性穿孔病病原菌(xanthomonas?arboricola?pv.pruni)基因組上獲得的。
2.權(quán)利要求1所述發(fā)光標(biāo)記重組菌xap-lux的構(gòu)建方法，其特征在于，包括以下步驟：
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的發(fā)光標(biāo)記重組菌xap-lux的構(gòu)建方法，其特征在于，所述電擊轉(zhuǎn)化的條件為：電壓2000～2100v，電擊杯間隙1～2mm。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的發(fā)光標(biāo)記重組菌xap-lux的構(gòu)建方法，其特征在于，所述篩選是將轉(zhuǎn)化子涂在含10～20μg/ml四環(huán)素的kb培養(yǎng)基平板上，28℃培養(yǎng)2～3d。
5.權(quán)利要求1所述的發(fā)光標(biāo)記重組菌xap-lux在制備抑菌劑篩選產(chǎn)品中的應(yīng)用，其特征在于，所述抑菌劑用于抑制桃細(xì)菌性穿孔病病原菌。
6.一種高通量篩選抑菌劑的方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟：向權(quán)利要求1所述的發(fā)光標(biāo)記重組菌xap-lux給予待測藥物并共培養(yǎng)，共培養(yǎng)結(jié)束后檢測所述發(fā)光標(biāo)記重組菌xap-lux的生物發(fā)光值，與不給予待測藥物的空白對照相比，所述生物發(fā)光值的降低指示待測藥物對桃細(xì)菌性穿孔病病原菌有抑制作用。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所述共培養(yǎng)條件為25～28℃、190～210rpm培養(yǎng)30～36h。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，通過多功能酶標(biāo)儀檢測生物發(fā)光值，測定波長為450～500nm。