本發(fā)明涉及生物純化，尤其涉及一種肝素鈉粗品的提純精制方法。
背景技術(shù)：
1、肝素鈉作為一種重要的抗凝血藥物，在醫(yī)療領(lǐng)域具有不可替代的作用。它主要從動(dòng)物組織，尤其是豬小腸粘膜中提取得到，廣泛應(yīng)用于抗凝血治療和血栓性疾病的預(yù)防。由于肝素鈉的臨床需求日益增長，開發(fā)一種高效、經(jīng)濟(jì)、可規(guī)?；奶峒兙乒に囎兊糜葹橹匾?/p>
2、直接從豬小腸粘膜中提取得到的肝素鈉粗品中含有蛋白質(zhì)、核酸、無機(jī)鹽等雜質(zhì)，效價(jià)為10-150iu/mg，不能作為醫(yī)藥用途的肝素鈉原料藥，必須經(jīng)過純化才能具有醫(yī)藥用途。很多生產(chǎn)企業(yè)在將肝素鈉粗品提純時(shí)，就因?yàn)樯a(chǎn)工藝落后，收率低，生產(chǎn)成本高等原因而無法進(jìn)一步生產(chǎn)高效價(jià)且分子結(jié)構(gòu)完整的肝素鈉。因此，由肝素鈉粗品生產(chǎn)單位效價(jià)大于180iu/mg且結(jié)構(gòu)完整的精品肝素鈉，就成為行業(yè)內(nèi)的研究重點(diǎn)。
3、目前國內(nèi)外純化肝素鈉粗品的的方法都存在一定的局限性，一方面，傳統(tǒng)方法通常依賴于長時(shí)間的鹽析或酸解過程，這些方法提取效率較低，無法滿足大規(guī)模生產(chǎn)的需求。為了克服上述問題，近年來是用雙氧水氧化法精制肝素鈉，工藝操作簡便，回收率高。但是工藝過程中最難解決的問題是過濾除去酸性雜蛋白，如何保證收率及效價(jià)是關(guān)鍵。因此，研究更合理的工藝方法，提高精制肝素鈉的質(zhì)量，尤其是在提高單位效價(jià)至大于180iu/mg的基礎(chǔ)上，保持肝素鈉分子結(jié)構(gòu)完整，是提高肝素鈉原料藥產(chǎn)品質(zhì)量的重要因素。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
1、基于背景技術(shù)中存在的技術(shù)問題，本發(fā)明提出了一種肝素鈉粗品的提純精制方法，實(shí)現(xiàn)了肝素鈉的分離純化和高效提取同時(shí)，提高了肝素鈉純品的回收率和效價(jià)，生產(chǎn)出了符合藥典標(biāo)準(zhǔn)的肝素鈉原料藥。
2、本發(fā)明提出的一種肝素鈉粗品的提純精制方法，包括如下步驟：
3、s1、將肝素鈉粗品加入氯化鈉溶液中，溶解完全后，得到肝素鈉粗品溶液；
4、s2、向肝素鈉粗品溶液中加入胰蛋白酶，酶解后，滅活，得到酶解溶液；
5、s3、向酶解溶液中加入過氧化氫，第一次氧化后，醇沉，得到第一次沉淀物；
6、s4、將第一次沉淀物加入氯化鈉溶液中，加入陰離子交換樹脂，吸附后，過濾，洗脫，醇沉，得到第二次沉淀物；
7、s5、將第二次沉淀物加入氯化鈉溶液中，加入過氧化氫，第二次氧化后，過濾，凍干，粉碎，得到肝素鈉純品。
8、本發(fā)明中，針對肝素鈉中含有其它粘多糖，也含有大量未除盡的蛋白質(zhì)和核酸類物質(zhì)，通過兩次雙氧水氧化法精制肝素鈉，最大限度地去除與肝素結(jié)合緊密的蛋白質(zhì)、核酸等雜質(zhì)，提高提取效率，并保持肝素鈉的活性，最終獲得高純度和高品質(zhì)的肝素鈉產(chǎn)品。
9、優(yōu)選地，步驟s1中，將肝素鈉粗品加入2-3wt％的氯化鈉溶液中，升溫至55-60℃后攪拌4-5h，得到肝素鈉粗品溶液。
10、優(yōu)選地，步驟s2中，向肝素鈉粗品溶液中加入胰蛋白酶，胰蛋白酶的加入量為肝素鈉粗品質(zhì)量的0.5-2％，調(diào)節(jié)ph為8.0-8.5，升溫至55-60℃，酶解2-3h后，升溫至80-85℃，滅活攪拌20-30min，得到酶解液。
11、優(yōu)選地，步驟s3中，將酶解液降至30℃以下，調(diào)節(jié)ph為10.0-10.5，加入過氧化氫溶液，過氧化氫溶液的加入量為酶解液體積的2-3％，氧化12-18h，得到第一次氧化液。
12、優(yōu)選地，步驟s3中，還包括將第一次氧化液進(jìn)行熱變性；
13、優(yōu)選地，所述熱變性包括：向第一次氧化液中加入氯化鈣和亞硫酸鈉，氯化鈣的加入量為肝素鈉粗品質(zhì)量的5-10％，亞硫酸鈉的加入量為肝素鈉粗品質(zhì)量的0.5-1％，調(diào)節(jié)ph為8.0-8.5，升溫至85-95℃，熱變性15-20min，過濾后，向所得濾液加入無水碳酸鈉，無水碳酸鈉的加入量和氯化鈣一致，調(diào)節(jié)ph為9.0-10.0，過濾，得到濾液；
14、優(yōu)選地，所述醇沉包括：向?yàn)V液中加入95％的乙醇，乙醇的體積為濾液體積的0.7-1倍，室溫下靜置4-6h。
15、優(yōu)選地，步驟s4中，將第一次沉淀物加入2-3wt％的氯化鈉溶液中，再加入陰離子交換樹脂，陰離子交換樹脂的加入量為肝素鈉粗品質(zhì)量的1-3％，調(diào)節(jié)ph為7.0-8.0，升溫至55-60℃后攪拌吸附4-6h，過濾，收集樹脂，向樹脂中加入完全浸沒樹脂量的5-7wt％的氯化鈉溶液，升溫至55-60℃后攪拌0.5-1h，濾干，得到洗滌后樹脂，再加入完全浸沒洗滌后樹脂量的20-25wt％的氯化鈉溶液，升溫至55-60℃后攪拌3-4h后，分離樹脂，收集洗脫液，重復(fù)加入完全浸沒洗滌后樹脂量的20-25wt％的氯化鈉溶液一次，將兩次洗脫液合并，加入95％乙醇，乙醇的體積為洗脫液體積的1-1.5倍，得到第二次沉淀物。
16、優(yōu)選地，所述陰離子交換樹脂是聚乙烯吡咯烷酮改性大孔堿性陰離子交換樹脂；
17、所述聚乙烯吡咯烷酮改性大孔堿性陰離子交換樹脂是將大孔氯烷基化聚苯乙烯-二乙烯基苯共聚珠體經(jīng)溶劑溶脹后，加入叔氨基丙烯酸酯單體進(jìn)行季銨鹽化反應(yīng)，再與n-乙烯吡咯烷酮進(jìn)行共聚反應(yīng)得到；
18、優(yōu)選地，所述大孔氯烷基化聚苯乙烯-二乙烯基苯共聚珠體為大孔氯甲基化聚苯乙烯-二乙烯基苯共聚珠體；所述叔氨基丙烯酸酯單體為甲基丙烯酸二甲氨基乙酯。
19、本發(fā)明中，所述陰離子交換樹脂，一方面屬于一種季銨鹽型大孔堿性陰離子交換樹脂，其可以對強(qiáng)電荷聚陰離子的肝素鈉進(jìn)行良好吸附，另一方面，其接枝的聚乙烯吡咯烷酮具有良好的親水性，進(jìn)一步增強(qiáng)了對多糖類的肝素鈉的吸附，由該陰離子交換樹脂用于吸附樹脂時(shí)，吸收效果好，經(jīng)過低濃度鹽溶液洗滌即可有效清除其中的粘多糖，之后通過高濃度鹽溶液進(jìn)行和樹脂置換，得到肝素鈉，進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)了肝素鈉高效純化分離。
20、優(yōu)選地，步驟s5中，將第二次沉淀物加入2-3wt％的氯化鈉溶液中，調(diào)節(jié)ph為10.0-10.5，加入過氧化氫溶液，過氧化氫溶液的加入量為溶液體積的1-2％，氧化6-12h，得到第二次氧化液。
21、優(yōu)選地，步驟s5中，將第二次氧化脫色液過濾后，加入凍干機(jī)進(jìn)行凍干處理，粉碎后，得到肝素鈉純品。
22、本發(fā)明還提出一種肝素鈉原料藥，其包括上述提純精制方法得到的肝素鈉純品。
23、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果：
24、本發(fā)明采用肝素鈉粗品作為原料制備肝素鈉純品：在基于過氧化氫二次氧化法實(shí)現(xiàn)了肝素鈉分離純化的同時(shí)，使用胰蛋白酶酶解和樹脂吸附進(jìn)一步除去肝素鈉粗品中含有的雜質(zhì)，如此使得肝素鈉效價(jià)有了明顯增大。此外，使用氯化鈣對堿性蛋白進(jìn)行加速吸附沉淀，亞硫酸鈉對肝素鈉有保護(hù)作用；再有就是通過陰離子交換樹脂吸附肝素，效價(jià)回收率高，動(dòng)態(tài)分離效果好，連續(xù)化程度高。
1.一種肝素鈉粗品的提純精制方法，其特征在于，包括如下步驟：
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述肝素鈉粗品的提純精制方法，其特征在于，步驟s1中，將肝素鈉粗品加入2-3wt％的氯化鈉溶液中，升溫至55-60℃后攪拌4-5h，得到肝素鈉粗品溶液。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述肝素鈉粗品的提純精制方法，其特征在于，步驟s2中，向肝素鈉粗品溶液中加入胰蛋白酶，胰蛋白酶的加入量為肝素鈉粗品質(zhì)量的0.5-2％，調(diào)節(jié)ph為8.0-8.5，升溫至55-60℃，酶解2-3h后，升溫至80-85℃，滅活攪拌20-30min，得到酶解液。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述肝素鈉粗品的提純精制方法，其特征在于，步驟s3中，將酶解液降至30℃以下，調(diào)節(jié)ph為10.0-10.5，加入過氧化氫溶液，過氧化氫溶液的加入量為酶解液體積的2-3％，氧化12-18h，得到第一次氧化液。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述肝素鈉粗品的提純精制方法，其特征在于，步驟s3中，還包括將第一次氧化液進(jìn)行熱變性；
6.根據(jù)權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)所述肝素鈉粗品的提純精制方法，其特征在于，步驟s4中，將第一次沉淀物加入2-3wt％的氯化鈉溶液中，再加入陰離子交換樹脂，陰離子交換樹脂的加入量為肝素鈉粗品質(zhì)量的1-3％，調(diào)節(jié)ph為7.0-8.0，升溫至55-60℃后攪拌吸附4-6h，過濾，收集樹脂，向樹脂中加入完全浸沒樹脂量的5-7wt％的氯化鈉溶液，升溫至55-60℃后攪拌0.5-1h，濾干，得到洗滌后樹脂，再加入完全浸沒洗滌后樹脂量的20-25wt％的氯化鈉溶液，升溫至55-60℃后攪拌3-4h后，分離樹脂，收集洗脫液，重復(fù)加入完全浸沒洗滌后樹脂量的20-25wt％的氯化鈉溶液一次，將兩次洗脫液合并，加入95％乙醇，乙醇的體積為洗脫液體積的1-1.5倍，得到第二次沉淀物。
7.根據(jù)權(quán)利要6所述肝素鈉粗品的提純精制方法，其特征在于，所述陰離子交換樹脂是聚乙烯吡咯烷酮改性大孔堿性陰離子交換樹脂；
8.根據(jù)權(quán)利要1-7任一項(xiàng)所述肝素鈉粗品的提純精制方法，其特征在于，步驟s5中，將第二次沉淀物加入2-3wt％的氯化鈉溶液中，調(diào)節(jié)ph為10.0-10.5，加入過氧化氫溶液，過氧化氫溶液的加入量為溶液體積的1-2％，氧化6-12h，得到第二次氧化液。
9.根據(jù)權(quán)利要求1-8任一項(xiàng)所述肝素鈉粗品的提純精制方法，其特征在于，步驟s5中，將第二次氧化脫色液過濾后，加入凍干機(jī)進(jìn)行凍干處理，粉碎后，得到肝素鈉純品。
10.一種肝素鈉原料藥，其特征在于，其包括權(quán)利要求1-9任一項(xiàng)所述提純精制方法得到的肝素鈉純品。