專利名稱：乙肝拉米夫定用藥療效檢測的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及分子生物學(xué)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，更具體的，本發(fā)明涉及一種檢測個體乙肝拉 米夫定用藥療效的試劑盒，通過檢測拉米夫定用藥靶向位點(diǎn)RT基因多態(tài)性位點(diǎn)來評估個 體乙肝拉米夫定用藥療效。
背景技術(shù)：
乙型病毒性肝炎是由乙型肝炎病毒引起的一種世界性疾病，發(fā)展中國家發(fā)病率 高。據(jù)統(tǒng)計(jì)全球慢性乙型肝炎病毒(HBV)感染者多達(dá)3.6億，我國占1.2億。感染者多數(shù)無癥狀，其中1/3出現(xiàn)肝損害的臨床表現(xiàn)。特點(diǎn)為起病較緩，以亞臨床 型及慢性型較常見。慢性感染者中約50% -75%有活躍的病毒復(fù)制和肝臟炎癥改變，部分 慢性肝炎可進(jìn)展為肝硬化、肝衰竭或原發(fā)性肝癌，是主要的疾病死亡因素之一。無黃疸型HBsAg持續(xù)陽性者易慢性化。本病主要通過血液及日常生活密切接觸傳 播，另一方式為母嬰傳播。乙肝疫苗的應(yīng)用是控制和預(yù)防乙型肝炎的根本措施。慢性乙型肝炎病毒感染的自然病程漫長，可持續(xù)30-50年，并且多在青壯年時期 發(fā)病。期間可分為免疫耐受期、免疫清除期、殘留期(低復(fù)制或無復(fù)制期)或終末肝病期。 在免疫清除期，機(jī)體免疫系統(tǒng)和病毒反復(fù)相互作用，導(dǎo)致慢性乙型肝炎病情持續(xù)進(jìn)展，因而 是急需接受治療的重要時期?？挂倚透窝撞《局委熓遣≡委煟彩歉镜闹委煼椒?，這已達(dá)成國際共識。然而 由于病毒、宿主、發(fā)病機(jī)制等諸多尚未闡明的復(fù)雜因素，目前已經(jīng)批準(zhǔn)用于臨床的抗病毒治 療藥物有限，療效還未能達(dá)到令人滿意的程度，病人經(jīng)有效的治療后尚有一定比例的復(fù)發(fā) 率，治療失敗或復(fù)發(fā)的病人需要經(jīng)過一個或多個周期的再治療。P基因區(qū)是HBV DNA中最大的一個開放讀碼框，基因全長約2. 6kb，編碼由850個 左右的氨基酸殘基組成的蛋白質(zhì)，具有逆轉(zhuǎn)錄酶活性。P基因變異主要見于RT基因片段(349 692aa，即rtl rt344)。在拉米夫定治 療中，最常見的是酪氨酸-蛋氨酸-天門冬氨酸-天門冬氨酸(YMDD)變異，即由YMDD變異 為YIDD (rtM204I)或YVDD (rtM204V)，并常伴有rtL180M變異，且受藥物選擇而逐漸成為對 拉米夫定耐藥的優(yōu)勢株。拉米夫定為核苷類似物抗病毒藥，可競爭性抑制HBV DNA聚合酶，使HBV DNA延長 終止，從而抑制HBV-DNA的復(fù)制。拉米夫定治療相關(guān)的變異多發(fā)生于HBV DNA聚合酶的活 性區(qū)域，即YMDD位點(diǎn)附近，并可涉及附近區(qū)域(第501、528、545位氨基酸的區(qū)段)。野生株YMDD部位呈緩和口袋型，有利于核苷酸和拉米夫定結(jié)合，rtM204位點(diǎn)的變 異使側(cè)鏈變短，柔性降低，并在HBV聚合酶和拉米夫定三磷酸鹽之間形成空間位阻，導(dǎo)致與 拉米夫定三磷酸鹽的結(jié)合力下降，從而不可繼續(xù)合成HBV-DNA。拉米夫定是近年來新合成的二脫氧胞嘧啶核苷類似物。最早用于治療AIDS。以 后發(fā)現(xiàn)對HBV和HIV混合感染病人，有明顯的抗HBV作用，可迅速降低患者血清HBV DNA水 平。它的作用機(jī)理是在體內(nèi)通過磷酸化成為三磷酸核苷類似物后，可以抑制病毒的DNA多
3聚酶和逆轉(zhuǎn)錄酶的活性；并可與核苷競爭性摻入病毒的DNA鏈，終止DNA鏈的延長和合成， 使病毒的復(fù)制受到抑制而發(fā)揮抗病毒作用。在拉米夫定治療過程中，HBV P區(qū)編碼的DNA聚 合酶基因發(fā)生突變，致使其編碼的HBV逆轉(zhuǎn)錄酶活性部位-YMDD功能區(qū)的甲硫氨酸(M)變 異為纈氨酸(V)或異亮氨酸(I)，即由YMDD變異為YIDD (rtM204I)或YVDD (rtM204V)，導(dǎo)致 逆轉(zhuǎn)錄酶亞結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，在HBV聚合酶和拉米夫定三磷酸鹽之間形成空間位阻，妨礙了 與拉米夫定的結(jié)合，從而造成HBV對拉米夫定敏感性下降。據(jù)報(bào)道，在體外YMDD變異株對 拉米夫定的敏感性比野生株降低10000倍。

發(fā)明內(nèi)容
基于拉米夫定用藥靶向位點(diǎn)RT基因多態(tài)性可用來評估個體乙肝拉米夫定用藥療 效的基礎(chǔ)上，本發(fā)明提供一種檢測個體乙肝拉米夫定用藥療效的試劑盒。該試劑盒包括檢測拉米夫定用藥靶向位點(diǎn)RT基因多態(tài)性位點(diǎn)的特異性引物對及特異性熒光探 針對；熒光定量PCR反應(yīng)組件(包括Taq酶、dNTP混合液、MgCl2溶液、反應(yīng)緩沖液、去離 子水等)。本試劑盒中所述的特異性熒光探針對是能夠輕易完成設(shè)計(jì)的，特異性熒光探針對 可用常規(guī)的探針合成技術(shù)進(jìn)行合成。本發(fā)明試劑盒的組分和含量包括10X熒光定量PCR反應(yīng)緩沖液1 Pi，25mM dNTP 混合液 0. 1 u 1,25mM MgC12 溶液 0. 6 ii 1， 5units/ u 1 Taq DNA 聚合酶 0. 025 u 1,20iiM特異性引物對每條引物各0. 225 iil，10 uM特異性熒光探針對每條探針各0. 25 ill，去離子水 5. 325ii 1。本試劑盒供一人份檢測應(yīng)用，試劑盒的保存溫度為-20°C。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn) 方法，通常按照常規(guī)條件，或按照廠商所建議的條件。實(shí)施例檢測試劑盒的使用步驟1:DNA模板的抽取用硅膠吸附法抽提口腔上皮細(xì)胞的基因組DNA。步驟2 熒光定量PCR反應(yīng)使用檢測試劑盒中的熒光定量PCR套裝，進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)，反應(yīng)的體系為總 體積10 u 1，包含濃度為20ng/ yl的DNA模板2 ill、1 ill 10X熒光定量PCR反應(yīng)緩沖液、 0. 1 u 1 25mM dNTP 混合液、0. 6 u 1 25mMMgCl2 溶液、0. 025 u 1 (5units/ u 1) Taq DNA 聚合 酶、20 y M的有義引物和反義引物各0. 225 iU、10 y M的帶VIC熒光探針和帶FAM熒光探針各 0. 25ii 1，去離子水 5. 325 u 1。在PCR擴(kuò)增儀上進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)條件為50°C、2分鐘，95°C、10分鐘，進(jìn)行60個循環(huán) 的95°C、30秒，60°C、1分鐘。反應(yīng)結(jié)束后在熒光定量PCR儀上讀取樣品熒光量。步驟4 基因型分析根據(jù)試劑盒使用說明書標(biāo)示的基因分型圖示對SNP位點(diǎn)進(jìn)行基因型分析。熟悉熒光定量PCR技術(shù)的本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠通過辨識熒光定量PCR儀上顯示 的最終樣品熒光量，根據(jù)不同序列探針熒光信號的強(qiáng)弱即可確定所檢測的SNP位點(diǎn)的基因 型。
權(quán)利要求
一種檢測個體乙肝拉米夫定用藥療效的試劑盒，其特征在于包括檢測拉米夫定用藥靶向位點(diǎn)RT基因多態(tài)性位點(diǎn)的特異性引物對及特異性熒光探針對、Taq酶、dNTP混合液、MgCl2溶液、熒光定量PCR反應(yīng)緩沖液、去離子水。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于試劑盒的組分和含量包括 IOX熒光定量PCR反應(yīng)緩沖液1 μ 1，25mM dNTP 混合液 0· 1 μ 1,25mM MgCl2 溶液 0. 6 μ 1，5units/ μ 1 Taq DNA 聚合酶 0. 025 μ 1,，20 μ M特異性引物對每條引物各0. 225 μ 1，，10 μ M特異性熒光探針對每條探針各0. 25 μ 1，去離子水5. 325 μ 1。本試劑盒供一人份檢測應(yīng)用，試劑盒的保存溫度為-20°C。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種檢測個體乙肝拉米夫定用藥療效的試劑盒。該試劑盒包括檢測拉米夫定用藥靶向位點(diǎn)RT基因多態(tài)性位點(diǎn)的特異性引物對及特異性熒光探針對、熒光定量PCR常規(guī)組件等。本發(fā)明的試劑盒通過檢測拉米夫定用藥靶向位點(diǎn)RT基因多態(tài)性位點(diǎn)來評估個體乙肝拉米夫定用藥療效。
文檔編號G01N21/64GK101928763SQ200910053958
公開日2010年12月29日 申請日期2009年6月26日 優(yōu)先權(quán)日2009年6月26日
發(fā)明者馮哲民, 鄒祖燁 申請人:上海主健生物工程有限公司