本發(fā)明屬于生物，具體涉及一種胃腺癌模型的構(gòu)建方法。

背景技術(shù)：

1、胃癌（gc）是全球最常見的惡性腫瘤之一，截至2020年，其發(fā)病率排名第五，死亡率排名第四。僅在2020年，就有超過100萬的新診斷病例和大約77萬例死亡歸因于該疾病。隨著胃癌精準(zhǔn)診療時代的到來，靶向治療、免疫治療等逐漸占據(jù)胃癌治療的主流地位，大量胃癌精準(zhǔn)診療的相關(guān)基礎(chǔ)及轉(zhuǎn)化研究正在進行。然而精準(zhǔn)診療意味著需要對胃癌進行更精準(zhǔn)分型，缺乏能夠更精準(zhǔn)的刻畫腫瘤微環(huán)境成分及功能的動物模型是關(guān)鍵問題。經(jīng)典的胃癌模型包括人來源腫瘤異種移植(patient-derived?tumor?xenograft,?pdx)模型、人源腫瘤細胞系異種移植（cell?derived?xenograft,?cdx)模型，大多種植于免疫缺陷鼠的肋腹部，無法反映胃癌原位腫瘤的微環(huán)境特征。而雙人源化免疫小鼠，即采用重度缺陷小鼠，構(gòu)建人源化免疫系統(tǒng)的小鼠模型（如ncg-hil15）（中國專利文獻cn114786479a），雖能部分模擬免疫微環(huán)境，但存在nk細胞存活率低，影響藥效評價的準(zhǔn)確性、成本極高、無法創(chuàng)帶的問題。而目前市面上僅有的小鼠胃癌細胞系為mfc胃鱗癌細胞系，胃鱗癌在胃癌患者中占比僅0.04%-1%，無法反應(yīng)目前絕大多數(shù)胃癌患者病理類型即胃腺癌的特征。因此，亟待建立胃腺癌模型并構(gòu)建胃腺癌細胞系。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明第一方面的目的，在于提供一種胃腺癌模型的構(gòu)建方法。

2、本發(fā)明第二方面的目的，在于提供一種胃腺癌細胞的制備方法。

3、本發(fā)明第三方面的目的，在于提供一種胃腺癌細胞。

4、本發(fā)明第四方面的目的，在于提供一種胃腺癌動物模型的構(gòu)建方法。

5、本發(fā)明第五方面的目的，在于提供本發(fā)明第一方面的構(gòu)建方法得到的胃腺癌模型或其子代、本發(fā)明第三方面的胃腺癌細胞、本發(fā)明第四方面的構(gòu)建方法得到的胃腺癌動物模型或其子代的應(yīng)用。

6、為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明所采取的技術(shù)方案是：

7、本發(fā)明的第一個方面，提供一種胃腺癌模型的構(gòu)建方法，包含如下步驟：將anxa10-cre/+動物或其子代，與lsl-krasg12d/+;tp53?r172h/+動物或其子代進行繁殖，得到lsl-krasg12d/+;tp53?r172h/+；anxa10-cre/+動物。

8、在一些實施方式中，所述方法包含如下步驟：將anxa10-cre/+動物的子代，與lsl-krasg12d/+;tp53?r172h/+動物的子代進行繁殖，得到lsl-krasg12d/+;tp53?r172h/+；anxa10-cre/+動物。

9、在一些實施方式中，所述lsl-krasg12d/+;tp53?r172h/+動物的構(gòu)建方法包含如下步驟：將lsl-krasg12d/+動物或其子代，與tp53?r172h/+動物或其子代進行繁殖，得到lsl-krasg12d/+;tp53?r172h/+動物。

10、在一些實施方式中，所述lsl-krasg12d/+;tp53?r172h/+動物的構(gòu)建方法包含如下步驟：將lsl-krasg12d/+動物的子代，與tp53?r172h/+動物的子代進行繁殖，得到lsl-krasg12d/+;tp53?r172h/+動物。

11、在一些實施方式中，所述anxa10-cre/+動物的子代的構(gòu)建方法包含如下步驟：采用anxa10-cre/+動物與野生型動物進行繁殖，得到anxa10-cre/+動物的子代。

12、在一些實施方式中，所述lsl-krasg12d/+;tp53?r172h/+動物的子代的構(gòu)建方法包含如下步驟：采用lsl-krasg12d/+;tp53?r172h/+動物與野生型動物進行繁殖，得到lsl-krasg12d/+;tp53?r172h/+動物的子代。

13、在一些實施方式中，所述lsl-krasg12d/+動物的子代的構(gòu)建方法包含如下步驟：采用lsl-krasg12d/+動物與野生型動物進行繁殖，得到lsl-krasg12d/+動物的子代。

14、在一些實施方式中，所述tp53?r172h/+動物的子代的構(gòu)建方法包含如下步驟：采用tp53?r172h/+動物與野生型動物進行繁殖，得到tp53?r172h/+動物的子代。

15、在一些實施方式中，所述anxa10-cre/+動物為anxa10-creert2/+動物。

16、在一些實施方式中，所述構(gòu)建方法還包含如下步驟：向lsl-krasg12d/+;tp53r172h/+；anxa10-cre/+動物施用n-甲基-n-亞硝基脲。

17、在一些實施方式中，所述n-甲基-n-亞硝基脲通過飲用水（優(yōu)選自由飲水）的方式施用。

18、在一些實施方式中，所述n-甲基-n-亞硝基脲的施用方法為：每周施用2-7天，施用8-18周；進一步為每周施用2-4天，施用8-10周；更進一步為每周施用3天，施用8周。

19、在一些實施方式中，所述構(gòu)建方法還包含如下步驟：向lsl-krasg12d/+;tp53r172h/+；anxa10-cre/+動物施用基因敲除激活劑。

20、在一些實施方式中，施用基因敲除激活劑在施用n-甲基-n-亞硝基脲之前進行，即先用基因敲除激活劑，然后施用n-甲基-n-亞硝基脲。

21、在一些實施方式中，所述基因敲除激活劑為他莫昔芬。

22、在一些實施方式中，所述基因敲除激活劑的施用時間為4-6天。

23、在一些實施方式中，所述基因敲除激活劑的施用量為50-100mg/kg.d。

24、在一些實施方式中，所述基因敲除激活劑的施用方式為注射（優(yōu)選為腹腔注射）。

25、本發(fā)明的第二個方面，提供一種胃腺癌細胞的制備方法，包含如下步驟：分離本發(fā)明第一個方面的構(gòu)建方法得到的胃腺癌模型或其子代中的胃腺腫瘤組織并進行體外培養(yǎng)，得到胃腺癌細胞。

26、在一些實施方式中，所述制備方法還包含如下步驟：對所述胃腺癌細胞進行永生化處理。

27、在一些實施方式中，所述永生化處理的方法包含如下步驟：采用sv40過表達病毒（優(yōu)選慢病毒）感染所述胃腺癌細胞。

28、本發(fā)明的第三個方面，提供一種胃腺癌細胞，所述胃腺癌細胞通過本發(fā)明第二個方面的制備方法得到。

29、一種胃腺癌細胞，所述胃腺癌細胞的名稱為st-yc19，分類命名為小鼠胃腺癌細胞系，于2025年4月3日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為cgmcc?no.46342，保藏地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號的中國科學(xué)院微生物研究所。

30、本發(fā)明的第四個方面，提供一種胃腺癌動物模型的構(gòu)建方法，將本發(fā)明第三個方面的胃腺癌細胞接種至動物。

31、在一些實施方式中，所述接種的方式為注射，例如可以是原位注射、靜脈注射、腹腔注射、皮下注射、皮內(nèi)注射或肌肉注射。

32、本發(fā)明的第五個方面，提供a1）-a2）任一項應(yīng)用：

33、a1)本發(fā)明第三個方面的胃腺癌細胞在b1)-b6)任一項中的應(yīng)用：

34、b1)構(gòu)建胃腺癌動物模型；

35、b2)篩選用于預(yù)防和/或治療胃腺癌的藥物；

36、b3)研究胃腺癌發(fā)病機制、發(fā)展和/或轉(zhuǎn)移機理；

37、b4)構(gòu)建胃腺癌細胞模型；

38、b5)篩選胃腺癌相關(guān)生物標(biāo)志物、或診斷和/或治療靶點；

39、b6)制備產(chǎn)品，所述產(chǎn)品用于b1)-b5)任一項；

40、a2)本發(fā)明第一個方面的構(gòu)建方法得到的胃腺癌模型或其子代、和/或本發(fā)明第四個方面的構(gòu)建方法得到的胃腺癌動物模型或其子代在b2)-b6)任一項中的應(yīng)用：

41、b2)篩選用于預(yù)防和/或治療胃腺癌的藥物；

42、b3)研究胃腺癌發(fā)病機制、發(fā)展和/或轉(zhuǎn)移機理；

43、b4)構(gòu)建胃腺癌細胞模型；

44、b5)篩選胃腺癌相關(guān)生物標(biāo)志物、或診斷和/或治療靶點；

45、b6)制備產(chǎn)品，所述產(chǎn)品用于b2)-b5)任一項。

46、在一些實施方式中，所述產(chǎn)品包含試劑、試劑盒。

47、在一些實施方式中，所述應(yīng)用不涉及疾病的診斷、治療。

48、在本發(fā)明中，所述動物為非人動物。

49、在一些實施方式中，所述非人動物包含非人類哺乳動物；進一步包含非人靈長類動物、嚙齒動物、牛（例如，牛、公牛、水牛）、鹿、豬、羊（例如，綿羊、山羊）、犬、兔、雞、貓、雪貂、馬中的至少一種；進一步為嚙齒動物。

50、在一些實施方式中，所述非人靈長類動物包含猩猩、猿、猴（例如，狨猴、恒河猴）中的至少一種。

51、在一些實施方式中，所述嚙齒動物包含小鼠、大鼠、倉鼠、豚鼠中的至少一種；進一步為小鼠、大鼠中的至少一種。

52、在一些實施方式中，所述嚙齒動物選自鼠家族；進一步選自麗倉鼠科（例如小鼠樣倉鼠）、倉鼠科（例如倉鼠、新世界大鼠和小鼠、田鼠）、鼠總科（真小鼠和大鼠、沙鼠、刺毛鼠、冠毛大鼠)、馬島鼠科（登山小鼠、巖小鼠、有尾大鼠、馬達加斯加大鼠和小鼠）、刺睡鼠科（例如多刺睡鼠）和鼴形鼠科（例如摩爾大鼠、竹大鼠和鼢鼠）家族。

53、在一些實施方式中，所述嚙齒動物是c57bl品系的小鼠，所述c57bl品系選自c57bl/a、c57bl/an、c57bl/grfa、c57bl/kalwn、c57bl6、?c57bl/10、c57bl10scsn、c57bl/10cr和c57bl/ola。在一些實施方式中，小鼠是選自129/j、129/rej、129/olahsd、129/sv、129/svj、129/re、129/rrj、129/sv-ter/+的129品系。這些小鼠描述于例如festing?etal.,?revised?nomenclature?for?strain?129?mice,?mammalian?genome?10:?836(1999);?auerbach?et?al.,?establishment?and?chimera?analysis?of?129/svev-?andc57bl/6-derived?mouse?embryonic?stem?cell?lines?(2000)，上述文獻相關(guān)內(nèi)容通過引用整體并入本文。在一些實施方式中，小鼠是129品系和c57bl/6品系的雜交。在一些實施方式中，小鼠是129品系的雜交，或bl/6品系的雜交。在一些實施方式中，小鼠是balb品系，例如balb/c品系。在一些實施方式中，小鼠是balb品系和另一品系的雜交。在一些實施方式中，小鼠來自雜交系（例如，50%?balb/c-50%?12954/sv；或50%?c57bl/6-50%?129）。在一些實施方式中，非人動物是嚙齒動物。在一些實施方式中，非人動物是具有balb/c、balb/chean、balb/cj、balb/crl、balb/cwt、c57bl/10、c57bl/10scsn、c57bl（c57bl/10cr和c57bl/ola）、c58、cba/br、cba/ca、cba/j、cba/st或cba/h品系的小鼠及nod、nod/scid、nod-prkdcscid?il-2rgnull背景的小鼠。

54、在本發(fā)明中，lsl-krasg12d/+動物表示具有krasg12d突變型和野生型的雜合型動物；類似地，tp53?r172h/+動物表示具有tp53?r172h突變型和野生型的雜合型動物；anxa10-cre/+動物表示具有突變型（插入anxa10-cre）和野生型的雜合型動物；lsl-krasg12d/+;tp53?r172h/+動物表示具有krasg12d突變型和野生型、和tp53?r172h突變型和野生型的雜合型動物；lsl-krasg12d/+;tp53?r172h/+；anxa10-cre/+動物表示具有krasg12d突變型和野生型、tp53?r172h突變型和野生型、和突變型（插入anxa10-cre）和野生型的雜合型動物。

55、在本發(fā)明中，所述繁殖為交配。

56、在本發(fā)明中，所述胃腺癌細胞包含其子代細胞。

57、本發(fā)明的有益效果是：

58、本發(fā)明提供了一種胃腺癌模型的構(gòu)建方法，包含如下步驟：將anxa10-cre/+動物或其子代，與lsl-krasg12d/+;tp53?r172h/+動物或其子代進行繁殖，得到lsl-krasg12d/+;tp53?r172h/+；anxa10-cre/+動物，該方法得到的胃腺癌模型病理類型確定為腺癌。

59、進一步地，該構(gòu)建方法還包含施用n-甲基-n-亞硝基脲的步驟，從而進一步縮短成瘤周期（約2.5個月），提高成瘤率（21/21，或100%）。

60、本發(fā)明提供了一種胃腺癌細胞，該細胞可實現(xiàn)體內(nèi)成瘤，且其為腺癌，同時，其增殖能力強、侵襲和/或遷移能力強。