本發(fā)明設(shè)計涉及生物，具體涉及一種傳遞外泌體的水凝膠組分及其制備方法。

背景技術(shù)：

1、目前市場上現(xiàn)有的傳遞外泌體水凝膠雖然在組織工程和再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域展現(xiàn)出一定的應(yīng)用前景，但仍面臨著諸多亟待解決的技術(shù)瓶頸，這些問題嚴(yán)重制約了其臨床轉(zhuǎn)化的進(jìn)程。

2、最為突出的挑戰(zhàn)之一是水凝膠傳遞外泌體的水凝膠組分在細(xì)胞內(nèi)還原環(huán)境無法很好響應(yīng)，這嚴(yán)重限制了其作為藥物遞送系統(tǒng)的應(yīng)用潛力。首先，在缺乏還原環(huán)境響應(yīng)性的情況下，水凝膠無法實現(xiàn)精準(zhǔn)的時空控制釋放，導(dǎo)致藥物遞送過程中的釋放動力學(xué)不可預(yù)測且難以調(diào)控。這種不可控性使得活性藥物可能在到達(dá)靶向部位前過早釋放，或在細(xì)胞內(nèi)滯留時間過長，兩種情況均會降低治療效率。其次，無法響應(yīng)細(xì)胞內(nèi)特異性還原環(huán)境的水凝膠組分難以區(qū)分正常細(xì)胞和病理細(xì)胞，導(dǎo)致靶向性不足，增加了對健康組織的潛在毒性風(fēng)險。另外，這類不響應(yīng)性水凝膠往往需要額外的復(fù)雜修飾或共遞送系統(tǒng)來彌補(bǔ)功能缺陷，增加了制備工藝的復(fù)雜性和成本，同時可能引入新的生物相容性問題。此外，不響應(yīng)性水凝膠往往表現(xiàn)出有限的生物降解性，可能在體內(nèi)長期累積，引發(fā)免疫反應(yīng)或炎癥反應(yīng)。最后，在缺乏細(xì)胞內(nèi)還原觸發(fā)機(jī)制的情況下，外泌體中的生物活性分子(如蛋白質(zhì)、核酸等)難以高效釋放，無法充分發(fā)揮其治療潛力。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、(1)要解決的技術(shù)問題

2、本發(fā)明的目的在于提供一種傳遞外泌體的水凝膠組分及其制備方法，用以解決傳遞外泌體的水凝膠組分在細(xì)胞內(nèi)還原環(huán)境無法很好釋放的問題。

3、(2)技術(shù)方案

4、為實現(xiàn)上述目的，一方面，本發(fā)明提供了一種傳遞外泌體的水凝膠組分，為核殼結(jié)構(gòu)，由外層殼和核心區(qū)域組成，所述外層殼包括羧基化硫酸軟骨素-瓜爾豆膠復(fù)合材料、二硫鍵-二丙烯酸酯修飾肝素-殼寡糖復(fù)合材料和納米級羥基磷灰石，所述核心區(qū)域包括外泌體、透明質(zhì)酸鈉、聚乙二醇、白蛋白、蠶絲膠蛋白、植物提取物和動物臍帶提取物，所述植物提取物包括積雪草提取物、甘草提取物和母菊花提取物。

5、進(jìn)一步地，一種傳遞外泌體的水凝膠組分，按重量分?jǐn)?shù)計，所述外層殼包括如下重量份原料：羧基化硫酸軟骨素-瓜爾豆膠復(fù)合材料20～40份、二硫鍵-二丙烯酸酯修飾肝素-殼寡糖復(fù)合材料30～50份和納米級羥基磷灰石10～30份；所述核心區(qū)域包括如下重量份原料：外泌體1～5份、透明質(zhì)酸鈉15～30份、聚乙二醇20～40份、白蛋白20～35份、蠶絲膠蛋白10～25份、植物提取物5～15份和動物臍帶提取物5～15份，所述植物提取物包括如下重量份原料：積雪草提取物1～5份、甘草提取物2～5份和母菊花提取物2～5份。

6、進(jìn)一步地，所述羧基化硫酸軟骨素-瓜爾豆膠復(fù)合材料的制備方法包括：

7、s11.將硫酸軟骨素加入去離子水中，得到硫酸軟骨素溶液，在硫酸軟骨素溶液中滴加1mol/l?naoh溶液將ph調(diào)整至8～8.5，得到調(diào)節(jié)ph后的硫酸軟骨素溶液；

8、s12.在調(diào)節(jié)ph后的硫酸軟骨素溶液中于0～4℃加入氯乙酸，并攪拌10～15min，得到混合溶液a，在混合溶液a中加入6mol/l?naoh溶液，并攪拌30～40min，得到混合溶液b，將混合溶液b升溫至60～70℃，并保持4～5h，得到溶液c，將溶液c冷卻至室溫，得到冷卻后的溶液c，在冷卻后的溶液c中加入無水乙醇，得到混合溶液d，將混合溶液d于4000～5000rpm離心10～15min，得到沉淀物，用80％乙醇洗滌沉淀物3～4次，得到洗滌后的沉淀物，將洗滌后的沉淀物于40～50℃真空干燥24～48h，得到羧基化硫酸軟骨素；

9、s13.將瓜爾豆膠加入到去離子水中，并升溫至70～80℃攪拌2～3h，得到瓜爾豆膠溶液；

10、s14.將羧基化硫酸軟骨素加入ph?7.4的pbs緩沖液中，得到混合溶液e，在混合溶液e中加入瓜爾豆膠溶液，并攪拌2～3h，得到混合溶液f，將混合溶液f倒入平底培養(yǎng)皿中，厚度控制在約3～5mm，得到混合培養(yǎng)皿，將混合培養(yǎng)皿置于-20～-10℃冰箱冷凍12～24h，得到冷凍后的樣品，將冷凍后的樣品放入冷凍干燥機(jī)中，在-50～-40℃、10～20pa條件下凍干48～56h，得到干燥后的樣品；

11、s15.將干燥后的樣品浸入1％ph?7.4的戊二醛pbs溶液中，并在4～6℃條件下交聯(lián)12～24h，得到交聯(lián)后的樣品，用大量pbs和去離子水依次洗滌交聯(lián)后的樣品，得到洗滌后的樣品，將洗滌后的樣品冷凍干燥24～48h，得到羧基化硫酸軟骨素-瓜爾豆膠復(fù)合材料。

12、進(jìn)一步地，所述二硫鍵-二丙烯酸酯修飾肝素-殼寡糖復(fù)合材料的制備方法包括：

13、s21.將肝素鈉溶于去離子水中，得到肝素鈉溶液，將肝素鈉溶液通過裝有dowex50wx8離子交換樹脂的柱子，得到樹脂，然后用去離子水洗滌樹脂至中性ph，得到混合溶液a，將混合溶液a過濾，得到濾液，將濾液冷凍干燥24～48h，得到肝素酸粉末；

14、s22.將肝素酸粉末加入ph?6.0的pbs緩沖液中，得到混合溶液b，在混合溶液b中加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺和n-羥基丁二酰亞胺，得到混合溶液c，將混合溶液c在室溫下攪拌1～2h，得到攪拌后的混合溶液c，將雙(2-甲基丙烯)乙氧基二硫溶于二甲基亞砜中，得到混合溶液d，將混合溶液d加入混合溶液c中，得到混合溶液e，將混合溶液e在氮氣保護(hù)下，室溫攪拌24～48h，得到反應(yīng)混合物，將反應(yīng)混合物裝入透析袋中，對去離子水透析48～56h，得到透析后的溶液，將透析后的溶液冷凍干燥24～48h，得到二硫鍵-二丙烯酸酯修飾肝素；

15、s23.將殼聚糖加入乙酸溶液中，得到殼聚糖溶液，在殼聚糖溶液中加入30％過氧化氫，得到混合溶液f，將混合溶液f在60～70℃下反應(yīng)3～4h，得到混合溶液h，將混合溶液h冷卻至室溫，然后用氫氧化鈉調(diào)節(jié)ph至7.0，得到混合物，將混合物裝入透析袋中，對去離子水透析48～56h，得到透析后的混合液，將透析后的混合液冷凍干燥24～48h，得到殼寡糖；

16、s24.稱取二硫鍵-二丙烯酸酯修飾肝素加入ph?7.4的pbs溶液中，得到二硫鍵-二丙烯酸酯修飾肝素溶液，將殼寡糖加入ph?7.4的pbs溶液中，得到殼寡糖溶液，將殼寡糖溶液緩慢滴加到二硫鍵-二丙烯酸酯修飾肝素溶液，并室溫攪拌2～3h，得到混合溶液i，在混合溶液i中加入偶氮二異丁腈，得到混合溶液j，將混合溶液j轉(zhuǎn)移到模具中，在氮氣環(huán)境下，將模具升溫至65～80℃，反應(yīng)6～8h，得到反應(yīng)液，將反應(yīng)液冷卻至室溫，得到冷卻后的反應(yīng)物，將冷卻后的反應(yīng)物浸泡在pbs中24～48h，得到浸泡后的反應(yīng)物，將浸泡后的反應(yīng)物到-20～-10℃冰箱中冷凍12～24h，得到凍結(jié)的反應(yīng)物，將凍結(jié)的反應(yīng)物放入冷凍干燥機(jī)中，在-50～-40℃、10～20pa條件下凍干48～56h，得到二硫鍵-二丙烯酸酯修飾肝素-殼寡糖復(fù)合材料。

17、另一方面，基于同一發(fā)明構(gòu)思，本發(fā)明還提供了一種傳遞外泌體的水凝膠組分的制備方法，應(yīng)用于所述的一種傳遞外泌體的水凝膠組分，包括以下步驟：

18、s31.將透明質(zhì)酸鈉加入去離子水中，得到透明質(zhì)酸鈉溶液，將聚乙二醇加入ph7.4的pbs溶液中，得到聚乙二醇溶液，將人白蛋白加入ph?7.4的pbs溶液中，得到白蛋白溶液，將蠶絲膠蛋白加入ph?7.4的pbs溶液中，得到蠶絲膠蛋白溶液，將積雪草提取物、甘草提取物和母菊花提取物加入ph?7.4的pbs溶液中，得到植物提取物混合溶液；將動物臍帶提取物加入ph?7.4的pbs溶液中，得到動物臍帶提取物溶液；

19、s32.將透明質(zhì)酸鈉溶液、聚乙二醇溶液、白蛋白溶液、蠶絲膠蛋白溶液、植物提取物混合溶液和動物臍帶提取物溶液混合，然后在室溫下攪拌1～2h，得到混合溶液a，在混合溶液a中加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺和n-羥基丁二酰亞胺，得到混合溶液b，將混合溶液b在ph?5.5～6.0，4～5℃攪拌反應(yīng)4～5h，得到混合溶液c，將混合溶液c調(diào)節(jié)ph至7.0，得到調(diào)節(jié)ph后的混合溶液c，在調(diào)節(jié)ph后的混合溶液c中緩慢加入外泌體溶液，并輕柔混合30～40min，得到混合物，將混合物于25～30℃靜置1～2h，形成核心水凝膠前體；

20、s33.將羧基化硫酸軟骨素-瓜爾豆膠復(fù)合材料加入ph?7.4的pbs溶液中，得到羧基化硫酸軟骨素-瓜爾豆膠溶液，將二硫鍵-二丙烯酸酯修飾肝素-殼寡糖復(fù)合材料加入ph7.4的pbs溶液中，得到二硫鍵-二丙烯酸酯修飾肝素-殼寡糖溶液，將納米級羥基磷灰石加入去離子水中，然后超聲處理30～40min，得到納米級羥基磷灰石懸浮液；

21、s34.將二硫鍵-二丙烯酸酯修飾肝素-殼寡糖溶液緩慢加入到羧基化硫酸軟骨素-瓜爾豆膠溶液中，然后攪拌2～3h，得到混合溶液d，在混合溶液d中緩慢加入納米級羥基磷灰石懸浮液，繼續(xù)攪拌2小時，得到混合溶液e，在混合溶液e中加入光引發(fā)劑irgacure2959，避光攪拌30～40min，得到外層材料；

22、s35.將核心水凝膠前體注入同心圓模具(內(nèi)徑5mm，外徑15mm)的內(nèi)腔，將外層材料注入外腔，然后使用紫外燈照射10～20min，得到核殼水凝膠，將核殼水凝膠在pbs中浸泡4～5h，得到浸泡后的核殼水凝膠，將浸泡后的核殼水凝膠轉(zhuǎn)移到-20～-10℃冰箱冷凍12～24h，得到凍結(jié)后的核殼水凝膠，將凍結(jié)后的核殼水凝膠置于冷凍干燥機(jī)中，在-50～-40℃、10～20pa條件下凍干24～48h，得到水凝膠組分。

23、上述原料組分的作用機(jī)制如下：

24、羧基化硫酸軟骨素-瓜爾豆膠復(fù)合材料：這種復(fù)合材料在水凝膠外層殼中提供了基本的骨架結(jié)構(gòu)，其中羧基化硫酸軟骨素富含羧基和硫酸基團(tuán)，能夠通過靜電相互作用與其他組分形成穩(wěn)定復(fù)合物，同時瓜爾豆膠增強(qiáng)了復(fù)合材料的粘彈性和水合性。

25、二硫鍵-二丙烯酸酯修飾肝素-殼寡糖復(fù)合材料：該復(fù)合材料是水凝膠系統(tǒng)的核心響應(yīng)性成分，其中二硫鍵結(jié)構(gòu)對細(xì)胞內(nèi)還原環(huán)境(如高濃度谷胱甘肽)具有特異性響應(yīng)能力，當(dāng)進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)還原環(huán)境時會被選擇性切斷，導(dǎo)致水凝膠結(jié)構(gòu)部分降解，從而實現(xiàn)外泌體的可控釋放；同時，肝素的高度硫酸化結(jié)構(gòu)能夠特異性結(jié)合多種生長因子和細(xì)胞因子，有助于保護(hù)外泌體中的生物活性分子不被降解，而二丙烯酸酯修飾提供了光交聯(lián)能力，使水凝膠在制備過程中能夠形成穩(wěn)定的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。

26、納米級羥基磷灰石：這種無機(jī)組分在水凝膠外層殼中主要提供機(jī)械強(qiáng)度增強(qiáng)作用，通過與有機(jī)高分子材料的復(fù)合增強(qiáng)水凝膠的機(jī)械性能；同時，其具有優(yōu)良的生物活性和骨傳導(dǎo)性，能夠促進(jìn)細(xì)胞附著和增殖；此外，還可能參與形成配位交聯(lián)點，與其他組分協(xié)同構(gòu)建穩(wěn)定的水凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，并通過鈣離子的釋放參與細(xì)胞信號傳導(dǎo)過程。

27、外泌體：作為水凝膠核心區(qū)域的主要功能性成分，外泌體是由細(xì)胞分泌的納米級膜泡，內(nèi)含豐富的蛋白質(zhì)、核酸(包括mrna、mirna等)和脂質(zhì)等生物活性分子，能夠介導(dǎo)細(xì)胞間通訊并調(diào)節(jié)多種生物學(xué)過程，如免疫調(diào)節(jié)、血管生成、抗炎和組織修復(fù)等；在該水凝膠系統(tǒng)中，外泌體在細(xì)胞內(nèi)還原環(huán)境觸發(fā)的控釋機(jī)制下能夠被有效釋放，從而發(fā)揮其治療作用。

28、透明質(zhì)酸鈉：作為核心區(qū)域的重要組成部分，透明質(zhì)酸鈉具有優(yōu)異的保濕性和粘彈性，能夠提供一個高度水合的微環(huán)境，保護(hù)外泌體的完整性和活性；同時，其作為細(xì)胞外基質(zhì)的天然成分，可以促進(jìn)細(xì)胞遷移和增殖，參與組織修復(fù)過程。

29、聚乙二醇：在核心區(qū)域中，聚乙二醇主要發(fā)揮水合性增強(qiáng)和免疫隱形作用，其親水性能夠增強(qiáng)水凝膠的吸水能力和穩(wěn)定性。

30、白蛋白：作為核心區(qū)域的蛋白質(zhì)成分，白蛋白具有優(yōu)良的生物相容性和生物降解性，能夠提供營養(yǎng)支持和滲透壓調(diào)節(jié)功能。

31、蠶絲膠蛋白：這種天然蛋白質(zhì)在核心區(qū)域中主要提供機(jī)械支持和結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性，其獨特的氨基酸組成和二級結(jié)構(gòu)賦予了水凝膠良好的機(jī)械性能和生物相容性。

32、動物臍帶提取物：作為核心區(qū)域的生物活性組分，動物臍帶提取物富含多種生長因子、細(xì)胞因子、膠原蛋白、透明質(zhì)酸和小分子營養(yǎng)物質(zhì)，能夠促進(jìn)細(xì)胞增殖、遷移和分化。

33、積雪草提取物：作為植物來源的生物活性成分，積雪草提取物主要含有三萜類化合物(如積雪草苷、羥基積雪草苷和馬德卡索酸等)，具有顯著的抗氧化、抗炎和促進(jìn)膠原蛋白合成的作用。

34、甘草提取物：該植物提取物富含甘草甜素、甘草查爾酮、甘草黃酮等生物活性成分，在核心區(qū)域中主要發(fā)揮抗炎、抗氧化和免疫調(diào)節(jié)作用。

35、母菊花提取物：作為水凝膠核心區(qū)域的植物活性成分之一，母菊花提取物含有芹菜素、槲皮素和蘆丁等多種黃酮類化合物以及多酚類物質(zhì)，具有強(qiáng)大的抗氧化能力，能夠清除自由基，減輕氧化應(yīng)激對外泌體和細(xì)胞的損傷。

36、(3)有益效果

37、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是：

38、1.本發(fā)明設(shè)計的傳遞外泌體的水凝膠組分通過獨特的核殼結(jié)構(gòu)和二硫鍵響應(yīng)性機(jī)制，解決了傳統(tǒng)水凝膠在細(xì)胞內(nèi)還原環(huán)境中外泌體釋放不足的問題。其中，外層殼的二硫鍵-二丙烯酸酯修飾肝素-殼寡糖復(fù)合材料對細(xì)胞內(nèi)高濃度谷胱甘肽等還原劑具有特異性響應(yīng)能力，實現(xiàn)了外泌體在特定細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的可控釋放，提高了治療效果和靶向性。

39、2.本發(fā)明的水凝膠組分通過羧基化硫酸軟骨素-瓜爾豆膠復(fù)合材料與二硫鍵-二丙烯酸酯修飾肝素-殼寡糖復(fù)合材料，形成了既具有足夠機(jī)械強(qiáng)度又保持響應(yīng)性的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。這種結(jié)構(gòu)不僅提供了外泌體的穩(wěn)定保護(hù)環(huán)境，還通過豐富的負(fù)電荷分布增強(qiáng)了與外泌體表面正電荷蛋白質(zhì)的相互作用，提高了外泌體的穩(wěn)定性，解決了傳統(tǒng)載體系統(tǒng)中外泌體活性降低的問題。