本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥，尤其是涉及一種具有抗腫瘤效果的活菌遞送的銅-伊立替康金屬納米藥物及其制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、乳腺癌是全球女性中最常見的惡性腫瘤之一，每年新增病例超過200萬，死亡病例超過60萬，嚴(yán)重威脅女性健康。盡管治療手段不斷進步，乳腺癌的治療仍面臨諸多挑戰(zhàn)，包括內(nèi)分泌治療耐藥、靶向治療復(fù)發(fā)以及化療效果有限等問題。近年來，研究表明，腫瘤內(nèi)微生物群(intratumoral?microbiota)在腫瘤進展中發(fā)揮重要作用。腫瘤內(nèi)細(xì)菌的存在可促進腫瘤細(xì)胞增殖和存活或加速腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移。此外，腫瘤內(nèi)細(xì)菌還會抑制cd4+和cd8+t細(xì)胞的活性，削弱抗腫瘤免疫反應(yīng)，降低免疫治療效果。sting(stimulator?of?interferongenes)通路是先天免疫的核心調(diào)控因子，其激活能夠誘導(dǎo)i型干擾素的產(chǎn)生，促進樹突狀細(xì)胞(dc)成熟和t細(xì)胞活化，從而增強抗腫瘤免疫反應(yīng)。然而，腫瘤內(nèi)細(xì)菌的存在會限制sting通路的激活。光熱療法(photothermal?therapy,ptt)作為一種局部治療手段，能夠通過產(chǎn)生局部高溫破壞細(xì)菌膜，加速銅離子進入細(xì)菌內(nèi)發(fā)揮抗菌作用，同時實現(xiàn)腫瘤消融。

2、因此，結(jié)合抗菌治療、光熱療法和sting通路激活，有望通過消除微生物屏障和增強免疫細(xì)胞功能，抑制腫瘤轉(zhuǎn)移。

3、cn114617975b公開了一種銅離子-單寧酸共組裝抗菌納米片作為抗腫瘤藥物的載體的應(yīng)用，是將抗菌納米片超聲分散于去離子水中，并加入抗腫瘤藥物，在黑暗條件下充分?jǐn)嚢枋箍鼓[瘤藥物負(fù)載到抗菌納米片中，經(jīng)離心、干燥，得到抗菌抗腫瘤納米藥物?？咕{米片具有良好的抗菌性能和生物相容性，能通過靜電相互作用及絡(luò)合作用高效負(fù)載抗腫瘤藥物，得到的納米藥物在正常生理環(huán)境中結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，在腫瘤微酸和高含量谷胱甘肽環(huán)境中可高效釋放抗腫瘤藥物和銅離子，發(fā)揮協(xié)同的抗腫瘤作用和優(yōu)異的抗菌性能，同時有效避免傳統(tǒng)金屬粒子抗菌材料中金屬離子無序泄漏導(dǎo)致的副作用風(fēng)險，有望解決腫瘤治療過程中患者易受細(xì)菌感染的問題，并能提高化療藥物的治療效果。該專利強調(diào)抗菌與抗腫瘤雙重作用，但未涉及益生菌遞送系統(tǒng)。

4、cn112791106b公開了一種藥物組合物，其包含免疫信號通路調(diào)節(jié)劑和一定量的鼠李糖乳桿菌，所述鼠李糖乳桿菌的量足以增強受試者對免疫信號通路調(diào)節(jié)劑的治療響應(yīng)。該藥物組合物中還可以含有伊立替康，其能夠提高腫瘤患者接受pd-1治療的應(yīng)答率，抑制腫瘤的發(fā)展，延長生存期；口服的治療方式簡單；該鼠李糖乳桿菌耐酸耐堿，能通過胃腸道環(huán)境，穩(wěn)定定殖。該方案主要通過口服鼠李糖乳桿菌增強免疫檢查點抑制劑(如pd-1抗體)的療效，不涉及調(diào)節(jié)腫瘤酸性環(huán)境，增強化療敏感性等問題。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、基于現(xiàn)有技術(shù)治療乳腺癌效果有待提高的問題，本發(fā)明提供一種具有抗腫瘤效果的活菌遞送的銅-伊立替康金屬納米藥物及其制備方法和應(yīng)用。

2、本發(fā)明提供的藥物，簡寫為lgg-pda@cu-cpt。該藥物由銅離子(cu2+)與化療藥物伊立替康(irinotecan,cpt)通過配位作用形成穩(wěn)定的納米配位聚合物(ncp)，并結(jié)合多巴胺(pda)包被的鼠李糖乳桿菌(lactobacillus?rhamnosus,lgg)作為遞送載體，用以實現(xiàn)藥物的精準(zhǔn)靶向遞送。

3、cu2+具有強大的抗菌和抗癌作用，能夠通過破壞細(xì)菌膜、產(chǎn)生活性氧(ros)和損傷dna殺滅腫瘤內(nèi)細(xì)菌，同時激活sting通路，增強免疫反應(yīng)。伊立替康的多羥基和氮雜環(huán)結(jié)構(gòu)能夠與銅離子形成穩(wěn)定的相互作用，實現(xiàn)協(xié)同抗腫瘤和抗菌效果。lgg作為一種厭氧菌，能夠特異性地定植于腫瘤缺氧區(qū)域，實現(xiàn)精準(zhǔn)藥物遞送，同時通過cgas/sting/tbk1/irf7信號通路誘導(dǎo)i型干擾素β(ifn-β)的產(chǎn)生，增強抗腫瘤免疫反應(yīng)。

4、本發(fā)明提供的lgg-pda@cu-cpt納米藥物通過整合抗菌治療、光熱療法和sting通路激活，解決了現(xiàn)有技術(shù)在腫瘤內(nèi)微生物群清除、腫瘤轉(zhuǎn)移抑制以及免疫激活方面的不足，實現(xiàn)了抗菌、抗腫瘤和免疫激活的多機制協(xié)同，該多功能策略為乳腺癌治療提供了一種創(chuàng)新的解決方案。

5、本發(fā)明的目的可以通過以下技術(shù)方案來實現(xiàn)：

6、本發(fā)明首先提供一種具有抗腫瘤效果的活菌遞送的銅-伊立替康金屬納米藥物，簡寫為lgg-pda@cu-cpt，包括銅-伊立替康納米配位聚合物，在所述銅-伊立替康納米配位聚合物上物理吸附或化學(xué)交聯(lián)有多巴胺(pda)包被的鼠李糖乳桿菌(lgg)。

7、本發(fā)明提供的lgg-pda@cu-cpt中，各成分的作用說明如下：

8、銅-伊立替康納米配位聚合物(cu-cpt?nps)：通過銅離子(cu2+)與化療藥物伊立替康(cpt)的配位作用形成穩(wěn)定的納米配位聚合物。cu2+具有廣譜抗菌和抗癌作用，而cpt的多羥基和氮雜環(huán)結(jié)構(gòu)能夠與銅離子形成穩(wěn)定的相互作用，實現(xiàn)協(xié)同抗腫瘤和抗菌效果。

9、多巴胺(pda)包被的鼠李糖乳桿菌(lgg)：利用lgg的厭氧特性，使其能夠特異性地定植于腫瘤缺氧區(qū)域，實現(xiàn)藥物的精準(zhǔn)遞送。pda包被不僅提高了納米藥物的穩(wěn)定性，還賦予其光熱治療功能。

10、本發(fā)明進一步提供具有抗腫瘤效果的活菌遞送的銅-伊立替康金屬納米藥物的制備方法，包括以下步驟：

11、銅-伊立替康納米配位聚合物(cu-cpt?nps)的制備：將銅離子與伊立替康進行配位反應(yīng)，形成穩(wěn)定的銅-伊立替康納米配位聚合物；

12、lgg-pda@cu-cpt的制備：將cu-cpt?nps與多巴胺包被的鼠李糖乳桿菌結(jié)合，通過物理吸附或化學(xué)交聯(lián)形成最終的納米藥物。

13、在本發(fā)明的一個實施方式中，所述銅-伊立替康納米配位聚合物(cu-cpt?nps)的制備方法，包括以下步驟：

14、第一步：通過在伊立替康(cpt)存在的溶劑中加入ph調(diào)節(jié)劑，加入助懸劑，攪拌，使得伊立替康的內(nèi)酯鍵和羧基鍵斷裂；

15、第二步：通過在溶劑存在下，加入cucl2化合物，無氧條件下，與伊立替康共同攪拌，來制備cu-cpt化合物。

16、在本發(fā)明的一個實施方式中，更具體地，在第一步中，可以采用的方案是，用三乙胺進行ph的調(diào)節(jié)，將體系的ph調(diào)節(jié)至7.4，加入的助懸劑為pvp，攪拌1h。

17、在本發(fā)明的一個實施方式中，更具體地，上述反應(yīng)的溶劑，可使用對反應(yīng)無不良影響的任何溶劑，優(yōu)選使用甲醇、n,n-二甲基甲酰胺。

18、在本發(fā)明的一個實施方式中，更具體地，cu與伊立替康摩爾比為4：1。

19、在本發(fā)明的一個實施方式中，所述銅-伊立替康納米配位聚合物(cu-cpt?nps)的制備方法，包括如下步驟：

20、s1、無氧攪拌條件下，將藥物伊立替康加入甲醇溶液中形成混合溶液，通過在固定ph體系中攪拌使得伊立替康的內(nèi)酯鍵、羥基鍵等斷開便于與銅離子配位結(jié)合；

21、s2、攪拌1h后，將氯化銅溶液緩慢滴入伊立替康體系中，于無氧條件下攪拌5h，將反應(yīng)后產(chǎn)物進行離心分離，得到產(chǎn)物cu-cpt；

22、s3、將產(chǎn)物cu-cpt重新分散，多次離心、洗滌分離后再加超純水超聲重分散，得到銅-伊立替康納米粒，即銅-伊立替康納米配位聚合物。

23、在本發(fā)明的一個實施方式中，進一步地，步驟s1中所述伊立替康溶液是將三水鹽酸伊立替康溶解在甲醇有機溶劑中，滴加三乙胺調(diào)節(jié)體系ph至7.4。

24、在本發(fā)明的一個實施方式中，進一步地，步驟s1中，還加入助懸劑為pvp。

25、在本發(fā)明的一個實施方式中，進一步地，步驟s2中所述氯化銅溶液為將二水氯化銅溶解在n,n-二甲基甲酰胺中，超聲溶解均勻，得到質(zhì)量濃度為1.44mg/ml的氯化銅溶液。

26、在本發(fā)明的一個實施方式中，進一步地，步驟s3中離心速度為10000～12000g，離心時間為10～20分鐘。

27、在本發(fā)明的一個實施方式中，伊立替康的化學(xué)結(jié)構(gòu)式如下所示：

28、

29、在本發(fā)明的一個實施方式中，多巴胺包被的鼠李糖乳桿菌的制備方法，包括以下步驟：

30、s1、準(zhǔn)備生長至對數(shù)期的活的鼠李糖乳桿菌，離心洗滌備用；

31、s2、將鹽酸多巴胺溶液與鼠李糖乳桿菌混合，攪拌反應(yīng)，將反應(yīng)產(chǎn)物離心，分離得到多巴胺包被的鼠李糖乳桿菌。

32、進一步地，步驟s1中洗滌菌體所用的溶液為pbs。

33、進一步地，步驟s2中所述的鹽酸多巴胺溶液為將鹽酸多巴胺溶解在tris-生理鹽水(ph＝8.5,10mm)，超聲溶解均勻，得到質(zhì)量濃度為2mg/ml的鹽酸多巴胺溶液。

34、進一步地，步驟s2中，鹽酸多巴胺溶液與鼠李糖乳桿菌混合時，按照2mg/ml的鹽酸多巴胺與od600(指在600納米波長下測量的菌液吸光度值)為1的鼠李糖乳桿菌液按照1：1的體積比進行混合。

35、進一步地，步驟s2中，攪拌反應(yīng)的條件是：37℃，100rpm中攪拌10分鐘。

36、在本發(fā)明的一個實施方式中，將cu-cpt?nps與多巴胺包被的鼠李糖乳桿菌通過靜電吸附的方式結(jié)合，形成最終的納米藥物的方法

37、在本發(fā)明的一個實施方式中，將cu-cpt?nps與多巴胺包被的鼠李糖乳桿菌結(jié)合時，cu-cpt?nps與多巴胺包被的鼠李糖乳桿菌的質(zhì)量比為4:1。

38、本發(fā)明還進一步提供所述具有抗腫瘤效果的活菌遞送的銅-伊立替康金屬納米藥物的應(yīng)用，所述藥物在制備治療乳腺癌的藥物中的應(yīng)用。

39、進一步地，本發(fā)明提供所述藥物在制備治療三陰性乳腺癌(tnbc)的藥物中的應(yīng)用。

40、lgg-pda@cu-cpt納米藥物可用于乳腺癌的治療，特別是針對三陰性乳腺癌(tnbc)等難治性亞型，通過多機制協(xié)同作用克服耐藥性和復(fù)發(fā)問題。

41、具體地，在實現(xiàn)乳腺癌治療功能時，其作用機制包括：

42、腫瘤內(nèi)微生物群清除：該納米藥物可高效清除腫瘤內(nèi)細(xì)菌，消除微生物屏障，增強免疫治療效果。

43、腫瘤轉(zhuǎn)移抑制：通過抑制腫瘤內(nèi)細(xì)菌的促轉(zhuǎn)移作用和激活全身免疫反應(yīng)，有效抑制腫瘤轉(zhuǎn)移。

44、本發(fā)明提供的lgg-pda@cu-cpt納米藥物的功能與作用機制總結(jié)說明如下：

45、抗菌作用：cu2+通過破壞細(xì)菌膜、產(chǎn)生活性氧(ros)和損傷dna殺滅腫瘤內(nèi)細(xì)菌，同時光熱療法(ptt)產(chǎn)生的局部高溫進一步增強細(xì)菌清除效果。

46、抗腫瘤作用：cu2+和cpt的協(xié)同作用通過誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡和免疫原性細(xì)胞死亡(icd)，實現(xiàn)對腫瘤細(xì)胞的高效殺傷。

47、免疫激活作用：ptt產(chǎn)生的高溫和cu2+的釋放協(xié)同激活sting通路，促進i型干擾素的產(chǎn)生，增強樹突狀細(xì)胞(dc)和t細(xì)胞的活化，提升抗腫瘤免疫反應(yīng)。

48、抑制腫瘤轉(zhuǎn)移：通過破壞腫瘤內(nèi)細(xì)菌及其分泌的促轉(zhuǎn)移因子，同時誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的免疫原性細(xì)胞死亡(icd)，釋放腫瘤相關(guān)抗原，激活全身免疫反應(yīng)，抑制腫瘤轉(zhuǎn)移。

49、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下優(yōu)點及有益效果：

50、1、本發(fā)明開發(fā)了一種具有抗腫瘤效果的活菌遞送的銅-伊立替康金屬納米藥物(lgg-pda@cu-cpt)，伊立替康作為抗腫瘤藥物，銅作為抗菌藥物，利用鼠李糖乳桿菌(lgg)作為載體，充分發(fā)揮了lgg的厭氧特性和腫瘤靶向性，能夠特異性地定植于腫瘤缺氧區(qū)域，實現(xiàn)藥物的精準(zhǔn)遞送，能夠有效提高納米藥物在腫瘤部位的富集度，并延長藥物在體內(nèi)的作用時間。同時，lgg通過cgas/sting/tbk1信號通路誘導(dǎo)i型干擾素β(ifn-β)的產(chǎn)生，進一步增強抗腫瘤免疫反應(yīng)，實現(xiàn)了抗菌和抗腫瘤的雙重特性。

51、2、本發(fā)明通過納米化技術(shù)解決了銅離子(cu2+)的高毒性問題。傳統(tǒng)銅離子雖然具有廣譜抗菌和抗癌作用，但其高毒性限制了其直接應(yīng)用。本發(fā)明通過將銅離子與伊立替康(cpt)配位形成穩(wěn)定的納米配位聚合物(ncp)，顯著降低了銅離子的毒性，同時提高了其穩(wěn)定性和生物相容性。納米化后的銅離子不僅保留了其抗菌和抗癌活性，還通過與cpt結(jié)合進一步增強了治療效果，實現(xiàn)了高效、低毒的腫瘤治療。

52、3、本發(fā)明通過多機制協(xié)同作用克服了腫瘤內(nèi)微生物群對免疫治療的抑制。腫瘤內(nèi)細(xì)菌的存在通過抑制cd4+和cd8+t細(xì)胞的活性削弱了抗腫瘤免疫反應(yīng)，而cu2+的廣譜抗菌作用和光熱療法(ptt)的局部高溫效應(yīng)高效清除了腫瘤內(nèi)細(xì)菌，消除了微生物屏障，進一步增強細(xì)菌清除效果，并誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的免疫原性細(xì)胞死亡。同時，cpt和lgg的釋放協(xié)同激活sting通路，促進i型干擾素的產(chǎn)生，增強了樹突狀細(xì)胞(dc)和t細(xì)胞的活化，顯著提升了抗腫瘤免疫反應(yīng)。

53、4、本發(fā)明通過銅離子和伊立替康的協(xié)同作用，克服了乳腺癌治療的耐藥性和復(fù)發(fā)問題。cu2+和cpt的協(xié)同抗腫瘤作用通過納米配位聚合物(ncp)實現(xiàn)藥物的精準(zhǔn)釋放，增強了對腫瘤細(xì)胞的殺傷效果。此外，光熱療法(ptt)誘導(dǎo)的免疫原性細(xì)胞死亡(icd)進一步釋放腫瘤相關(guān)抗原，激活全身免疫反應(yīng)，有效抑制了腫瘤的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移。

54、5、本發(fā)明通過整合抗菌治療、光熱療法和sting通路激活，實現(xiàn)了多機制協(xié)同治療。lgg-pda@cu-cpt納米藥物不僅能夠高效清除腫瘤內(nèi)微生物群，還能通過sting通路激活增強抗腫瘤免疫反應(yīng)，同時抑制腫瘤轉(zhuǎn)移，同時全身毒性最小。這種多功能整合策略為乳腺癌治療提供了一種創(chuàng)新的多機制協(xié)同治療方案，具有顯著的臨床應(yīng)用前景。