本發(fā)明涉及一種高效的茂原鏈霉菌crispr/cas9編輯方法，屬于基因工程。

背景技術(shù)：

1、茂原鏈霉菌(streptomyces?mobaraensis)長期用于生產(chǎn)食品級谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶(tgase)，具有良好的安全性和發(fā)酵性能，宿主菌被fda和國標(biāo)都認(rèn)定為gras菌株。且其分泌系統(tǒng)強(qiáng)，發(fā)酵液中的多種產(chǎn)物具有重要的工業(yè)應(yīng)用價值。但缺乏高效的基因編輯方法和快速篩選重組菌株的方法是阻礙其分子改造進(jìn)程的重要因素。

2、傳統(tǒng)的鏈霉菌基因編輯手段存在實(shí)驗周期冗長和操作步驟繁瑣等問題，導(dǎo)致基因編輯效率低。因此，有必要開發(fā)高效的基因編輯系統(tǒng)對其基因組進(jìn)行編輯。crispr/cas9作為一種新興的多功能基因編輯系統(tǒng)，具有操作簡單、效率高、成本低、實(shí)驗周期短以及能夠同時編輯多個基因等優(yōu)勢。目前該系統(tǒng)已成功應(yīng)用于多種模式鏈霉菌并取得不錯的效果。此外，基于crispr/cas9衍生的多種基因編輯工具也進(jìn)一步加速了鏈霉菌的基因改造。但在很多非模式鏈霉菌中該編輯系統(tǒng)仍舊難以操作，有許多困難需要面對。有報道顯示，在一些鏈霉菌的基因組中引入crispr/cas9系統(tǒng)，菌落并未發(fā)生編輯，甚至無法獲得轉(zhuǎn)化子。研究發(fā)現(xiàn)，cas蛋白的表達(dá)會對細(xì)胞產(chǎn)生毒性作用，這些毒性來自脫靶dna切割和非靶dna結(jié)合，致使轉(zhuǎn)化效率、編輯效率急劇降低(甚至為零)，阻礙了其在鏈霉菌中的應(yīng)用(具體可見參考文獻(xiàn)：consequences?of?cas9?cleavage?in?the?chromosome?of?escherichia?coli)。因此，圍繞降低cas9蛋白毒性作用展開了不少研究，包括開發(fā)crispr/cpf1系統(tǒng)來替代cas9蛋白；采用藍(lán)光誘導(dǎo)拆分cas9策略來降低cas9毒性；通過使用硫鏈菌素誘導(dǎo)型啟動子(tipap)和茶堿誘導(dǎo)型核糖開關(guān)(ribo)調(diào)控cas9水平；引入抑制劑acriia4作為cas9活性抑制因子來降低其毒性。這些研究為鏈霉菌中crispr/cas9編輯系統(tǒng)的優(yōu)化提供了重要參考意見。然而上述策略仍然無法解決在s.mobaraensis基因編輯中產(chǎn)生的問題，使用crispr/cas9系統(tǒng)進(jìn)基因組編輯時，由于cas9蛋白非特異性結(jié)合引起的細(xì)胞毒性會抑制細(xì)胞的正常生長，對系統(tǒng)的廣泛應(yīng)用構(gòu)成了挑戰(zhàn)，特別是鏈霉菌中該現(xiàn)象更加普遍。為減輕這種細(xì)胞毒性，通常采用的方法是通過誘導(dǎo)型啟動子在質(zhì)粒轉(zhuǎn)化過程中抑制cas9蛋白的表達(dá)。然而，即使在未被誘導(dǎo)的狀態(tài)下，仍然存在一定水平的表達(dá)泄露。此外，誘導(dǎo)型啟動子系統(tǒng)需要誘導(dǎo)cas9的表達(dá)，并在表達(dá)后重新分離單克隆細(xì)胞，這會顯著延長基因編輯周期。同時，應(yīng)用于大規(guī)模工業(yè)發(fā)酵生產(chǎn)時，誘導(dǎo)劑的添加會顯著增加生產(chǎn)成本。因此，亟待獲得一種用于s.mobaraensis的基因編輯的新工具。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、針對上述現(xiàn)有技術(shù)中的不足，本發(fā)明提供一種高效的茂原鏈霉菌crispr/cas9編輯方法，目的在于解決傳統(tǒng)的基因編輯方法在s.mobaraensis中由于存在操作繁瑣、周期冗長、編輯效率低、cas9蛋白對細(xì)胞具有毒性等問題，從而限制了其分子改造應(yīng)用和生產(chǎn)過程的優(yōu)化的技術(shù)問題。

2、本發(fā)明提供的第一個技術(shù)方案為一種用于茂原鏈霉菌的crispr/cas9基因編輯載體，所述基因編輯載體是在pcrispomyces-2質(zhì)粒的基礎(chǔ)上，將cas9基因的啟動子替換為來源于茂原鏈霉菌s.mobaraensis的內(nèi)源啟動子，所述內(nèi)源啟動子的核苷酸序列如seq?idno:1～seq?id?no:4中任意一個所示。

3、在某些實(shí)施方式中，所述內(nèi)源啟動子的核苷酸序列如seq?id?no:3所示。

4、本發(fā)明提供的第二個技術(shù)方案為一種高效的用于茂原鏈霉菌的crispr/cas9基因編輯系統(tǒng)，包括第一個技術(shù)方案所述的基因編輯載體。

5、本發(fā)明提供的第三個技術(shù)方案為第一個技術(shù)方案所述的編輯載體、第二個技術(shù)方案所述的編輯系統(tǒng)編輯茂原鏈霉菌基因的方法，包括如下步驟：

6、s1，將靶向茂原鏈霉菌目的基因的sgrna克隆到所述基因編輯載體上，獲得重組質(zhì)粒；

7、s2，對步驟s1中的重組質(zhì)粒的修復(fù)模板進(jìn)行優(yōu)化，獲得優(yōu)化質(zhì)粒；

8、s3,將步驟s2的優(yōu)化質(zhì)粒轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)過篩選、鑒定得到基因編輯的轉(zhuǎn)化子，完成基因編輯。

9、在某些實(shí)施方式中，所述感受態(tài)細(xì)胞為茂原鏈霉菌smy2019，所述茂原鏈霉菌(streptomyces?mobaraensis)smy2019的保藏編號為cctcc?no:m2020507，參考公告號為cn112126613b的專利。

10、在某些實(shí)施方案中，所述目的基因為ssti基因，靶向茂原鏈霉菌目的基因的sgrna的核苷酸序列如seq?id?no:5～seq?id?no:10任一個所示。

11、在某些實(shí)施方案中，所述目的基因為ssti基因和sapb基因，靶向茂原鏈霉菌目的基因的sgrna包括sgrna1和sgrna2，所述sgrna1的核苷酸序列如seq?id?no:6所示，所述sgrna2的核苷酸序列seq?id?no:11所示。

12、在某些實(shí)施方案中，所述重組質(zhì)粒的修復(fù)模板的優(yōu)化方式如下：以s.mobaraensis基因組為模板，擴(kuò)增目的基因上游和下游0.5kb～2.5kb同源臂片段，并克隆至步驟s2中的重組質(zhì)粒上的xbai位點(diǎn)上。

13、本發(fā)明提供的第四個技術(shù)方案為ssti基因在驗證第一個技術(shù)方案所述的編輯載體編輯效率中的應(yīng)用，所述ssti基因的核苷酸序列如seq?id?no:12所示。

14、在某些實(shí)施方式中，包括如下步驟：

15、a，以影響茂原鏈霉菌s.mobaraensis菌體生長形態(tài)的ssti基因作為報告基因；

16、b，篩選出靶向步驟a中ssti基因的sgrna，并將分別克隆到第一個技術(shù)方案所述的基因編輯載體上，獲得重組質(zhì)粒；

17、c，將步驟b的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至茂原鏈霉菌中，通過gym培養(yǎng)基平板上孢子的形態(tài)變化驗證編輯效率。

18、在某些實(shí)施方式中，步驟a中，獲得報告基因的具體步驟如下：選擇來源于茂原鏈霉菌s.mobaraensis菌體blda、bldkc、bldkd、sapb和ssti與菌絲分化相關(guān)的5個基因，并分別構(gòu)建敲除質(zhì)粒pjtu1278-δblda、pjtu1278-δbldkc、pjtu1278-δbldkd、pjtu1278-δsapb、pjtu1278-δssti轉(zhuǎn)化茂原鏈霉菌s.mobaraensis中，得到發(fā)生單交換的重組菌smy2019-δblda、smy2019-δbldkc、smy2019-δbldkd、smy2019-δsapb和smy2019-δssti，在gym培養(yǎng)基平板上通過上述重組菌的孢子的形態(tài)變化，篩選出ssti基因作為報告基因。

19、有益效果：

20、1、本發(fā)明成功解決了crispr/cas9系統(tǒng)在茂原鏈霉菌中由于細(xì)胞毒性導(dǎo)致的致死問題。由于不同鏈霉菌系統(tǒng)中cas9蛋白的表達(dá)水平存在差異，將pcrispomyces-2質(zhì)粒引入茂原鏈霉菌時，高表達(dá)水平的cas9蛋產(chǎn)生了顯著的細(xì)胞毒性，導(dǎo)致無法產(chǎn)生有效陽性轉(zhuǎn)化子。本發(fā)明通過對cas9蛋白的啟動子進(jìn)行工程優(yōu)化，成功改善了細(xì)胞毒性，同時保持了較高的dsb(雙鏈斷裂)效率，為茂原鏈霉菌中crispr/cas9系統(tǒng)的應(yīng)用提供了有效的解決方案。

21、2、本發(fā)明還成功篩選出氣生菌絲生長延遲的關(guān)鍵基因ssti，擴(kuò)展了茂原鏈霉菌crispr/cas9系統(tǒng)基因編輯篩選方法，可以直觀的通過菌落外觀判斷敲除成功與否，有效縮短了茂原鏈霉菌crispr/cas9系統(tǒng)的編輯周期。

22、3、本發(fā)明成功構(gòu)建并優(yōu)化用于s.mobaraensis的crispr/cas9基因編輯系統(tǒng)，選取氣生菌絲生長延遲的相關(guān)基因ssti為報告基因，對crispr/cas9編輯系統(tǒng)進(jìn)行優(yōu)化。獲得cas9的最佳啟動子p19570(核苷酸序列如seq?id?no:3所示)和靶向ssti基因的最合適的sgrna(sgrna-150，核苷酸序列如如seq?id?no:6所示)，在此基礎(chǔ)上選擇長度為2kb的修復(fù)模板，使單基因編輯效率最高達(dá)到90.8％。

23、4、實(shí)現(xiàn)了smy2019中ssti和sapb基因的同時敲除，敲除效率為6.25％。本發(fā)明證明了使用crispr/cas9系統(tǒng)可以對s.mobaraensis基因組不僅可以進(jìn)行單基因編輯還能夠?qū)崿F(xiàn)多基因編輯，為優(yōu)化s.mobaraensis表達(dá)系統(tǒng)及研究未知基因功能提供了有效的操作工具。