本申請涉及分子診斷生物學(xué)，尤其涉及一種定量檢測b族鏈球菌核酸的引物探針組合、試劑盒及其檢測方法。
背景技術(shù)：
1、b族鏈球菌(group?b?streptococcus，gbs)是一種β-溶血性革蘭氏陽性菌，通常定植在女性胃腸道或下生殖道中，沒有明顯臨床癥狀，但在其他宿主中是一種具有侵襲性的病原體。gbs很少引起產(chǎn)婦膿毒癥，但易引起胎兒的死產(chǎn)和早產(chǎn)，同時也會致新生兒感染gbs。
2、gbs是全球新生兒感染發(fā)病率和死亡率的主要原因，胎兒感染gbs后，最常見的臨床表現(xiàn)是敗血癥、肺炎、腦膜炎和腦病，研究表明，gbs是引發(fā)新生兒患腦膜炎與敗血癥的主要致病菌，全球發(fā)病率約0.53‰，死亡率高達10％。即使治療痊愈后，近30％的存活兒將保留長期的如耳聾、視力受損、發(fā)育障礙及腦癱等神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥。
3、目前有關(guān)b族鏈球菌檢測涉及的檢測方法包括細菌分離培養(yǎng)法、膠體金免疫層析法和熒光定量pcr檢測法等。其中，細菌培養(yǎng)法檢測時間長，成本也高，檢測靈敏度低，陽性檢出率不高；質(zhì)譜快速鑒定法檢測靈敏度較低、時間相對較長(約6h)，且在培養(yǎng)液中有兩種及以上細菌時，常無法準確鑒定出目標菌株；膠體金免疫層析法容易出現(xiàn)假陽性，不適合定向診斷；實時熒光pcr具有靈敏度、準確度高，檢測快速等優(yōu)點，用于圍產(chǎn)期篩查和緊急情況下的快速檢測，但其定量需要參考標準品、標準曲線和內(nèi)標校正熒光，對低拷貝數(shù)的靶基因分子分辨不佳，靈敏度、精確度和分辨率受限制。
技術(shù)實現(xiàn)思路
1、本申請的目的在于提出一種定量檢測b族鏈球菌核酸的引物探針組合、試劑盒及其檢測方法，以解決現(xiàn)有技術(shù)中不能快速準確地對b族鏈球菌核酸進行定量檢測，以及由于依賴標準曲線導(dǎo)致檢測靈敏度、精確度和分辨率較低的技術(shù)問題。
2、為了解決上述技術(shù)問題，本申請實施例提供一種定量檢測b族鏈球菌核酸的引物探針組合，采用了如下所述的技術(shù)方案：
3、包括檢測b族鏈球菌上游引物，具有如seq?id?no：1所示的核苷酸序列；
4、檢測b族鏈球菌下游引物，具有如seq?id?no：2所示的核苷酸序列；
5、檢測b族鏈球菌探針，具有如seq?id?no：3所示的核苷酸序列；
6、內(nèi)控基因上游引物，具有如seq?id?no：4所示的核苷酸序列；
7、內(nèi)控基因下游引物，具有如seq?id?no：5所示的核苷酸序列；
8、內(nèi)控基因探針，具有如seq?id?no：6所示的核苷酸序列。
9、進一步的，所述探針的5’端標記有熒光基團，所述探針的3’端標記有淬滅基團；
10、其中，所述熒光基團選自fam、vic或hex；所述淬滅基團選自mgb、bhq系列、tamra或eclipse。
11、進一步的，所述檢測b族鏈球菌探針的5’端標記有fam熒光基團，所述檢測b族鏈球菌探針的3’端標記有mgb淬滅基團；所述內(nèi)控基因探針的5’端標記有vic熒光基團，所述內(nèi)控基因探針的3’端標記有mgb淬滅基團。
12、為了解決上述技術(shù)問題，本申請實施例還提供一種定量檢測b族鏈球菌核酸的試劑盒，采用了如下所述的技術(shù)方案：
13、包括引物探針混合液、ddpcr預(yù)混液、gbs陽性質(zhì)控品和gbs陰性質(zhì)控品；所述引物探針混合液包括如上所述的引物探針組合。
14、進一步的，所述檢測b族鏈球菌上游引物和所述檢測b族鏈球菌下游引物在pcr反應(yīng)體系中的終濃度為0.5μmol/l；所述檢測b族鏈球菌探針在pcr反應(yīng)體系中的終濃度為0.25μmol/l；所述內(nèi)控基因上游引物和所述內(nèi)控基因下游引物在pcr反應(yīng)體系中的終濃度為0.5μmol/l；所述內(nèi)控基因探針在pcr反應(yīng)體系中的終濃度為0.25μmol/l。
15、進一步的，所述gbs陽性質(zhì)控品的成分包括含有濃度不低于1×105copies/ml的b族鏈球菌假病毒和含有濃度不低于1×105copies/ml的內(nèi)標片段的假病毒；所述gbs陰性質(zhì)控品的成分包括含有濃度不低于5×104copies/ml的內(nèi)標片段的假病毒和te緩沖液。
16、進一步的，所述試劑盒的檢測樣本為人痰液；
17、所述試劑盒判定檢測有效的標準包括：
18、每次檢測所有反應(yīng)孔中只有微滴數(shù)≥10000的反應(yīng)孔為有效反應(yīng)孔；
19、有效反應(yīng)孔中，應(yīng)包含陰性對照組和陽性對照組，當陽性對照組檢測結(jié)果為陽性，陰性對照組檢測結(jié)果為陰性，且陽性對照組的濃度檢測結(jié)果為105±10％copies/ml時，檢測結(jié)果有效。
20、為了解決上述技術(shù)問題，本申請實施例還提供一種非診斷目的的定量檢測b族鏈球菌核酸的檢測方法，采用如上所述的試劑盒進行檢測，采用了如下所述的技術(shù)方案：
21、采集待測樣本，對待測樣本進行核酸提取，得到待測樣本核酸；
22、從所述試劑盒中取出引物探針混合液和ddpcr預(yù)混液，室溫融化后混勻，配制pcr反應(yīng)體系，并將pcr反應(yīng)體系分裝到預(yù)設(shè)數(shù)量的pcr反應(yīng)管中；
23、于所述pcr反應(yīng)管中分別加入待測樣本核酸、gbs陽性質(zhì)控品和gbs陰性質(zhì)控品，瞬時離心后轉(zhuǎn)移至微滴制備區(qū)；
24、將所述pcr反應(yīng)管中的液體進行微滴制備，按照預(yù)設(shè)的pcr反應(yīng)條件對制得的微滴進行pcr擴增反應(yīng)，得到pcr反應(yīng)產(chǎn)物；
25、對所述pcr反應(yīng)產(chǎn)物進行定量分析，得到b族鏈球菌核酸的拷貝數(shù)。
26、進一步的，所述pcr反應(yīng)條件如下：
27、95℃酶熱啟動10min；94℃變性30s，58℃退火1min，共45個循環(huán)；最后98℃酶滅活10min。
28、進一步的，所述檢測方法還包括：
29、使用無rna酶的去離子水按照1:10、1:100、1:1000、1:10000、1:100000的比例分別稀釋b族鏈球菌參考品s1～s3。
30、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本申請主要有以下有益效果：
31、本申請?zhí)峁┑亩繖z測b族鏈球菌核酸的引物探針組合、試劑盒及其檢測方法，基于微滴式數(shù)字pcr技術(shù)，對樣本中的b族鏈球菌核酸進行定量檢測，最快可在3h內(nèi)獲得定量檢測結(jié)果，穩(wěn)定檢出濃度低至3500copies/ml的樣本，操作簡單，檢測效率高，并且能夠?qū)族鏈球菌同時進行定性和定量；其次，本申請的引物探針組合特性高，對b族鏈球菌的檢測靈敏度和檢測準確率高；此外，本申請無需設(shè)置標準曲線，根據(jù)熒光類型、熒光微滴數(shù)的結(jié)果，可以直接判讀b族鏈球菌的陰陽性和拷貝數(shù)，大大簡化操作步驟。
1.一種定量檢測b族鏈球菌核酸的引物探針組合，其特征在于，包括：
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的定量檢測b族鏈球菌核酸的引物探針組合，其特征在于，所述探針的5’端標記有熒光基團，所述探針的3’端標記有淬滅基團；
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的定量檢測b族鏈球菌核酸的引物探針組合，其特征在于，所述檢測b族鏈球菌探針的5’端標記有fam熒光基團，所述檢測b族鏈球菌探針的3’端標記有mgb淬滅基團；所述內(nèi)控基因探針的5’端標記有vic熒光基團，所述內(nèi)控基因探針的3’端標記有mgb淬滅基團。
4.一種定量檢測b族鏈球菌核酸的試劑盒，其特征在于，包括引物探針混合液、ddpcr預(yù)混液、gbs陽性質(zhì)控品和gbs陰性質(zhì)控品；所述引物探針混合液包括如權(quán)利要求1至3任一項所述的引物探針組合。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的定量檢測b族鏈球菌核酸的試劑盒，其特征在于，所述檢測b族鏈球菌上游引物和所述檢測b族鏈球菌下游引物在pcr反應(yīng)體系中的終濃度為0.5μmol/l；所述檢測b族鏈球菌探針在pcr反應(yīng)體系中的終濃度為0.25μmol/l；所述內(nèi)控基因上游引物和所述內(nèi)控基因下游引物在pcr反應(yīng)體系中的終濃度為0.5μmol/l；所述內(nèi)控基因探針在pcr反應(yīng)體系中的終濃度為0.25μmol/l。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的定量檢測b族鏈球菌核酸的試劑盒，其特征在于，所述gbs陽性質(zhì)控品的成分包括含有濃度不低于1×105copies/ml的b族鏈球菌假病毒和含有濃度不低于1×105copies/ml的內(nèi)標片段的假病毒；所述gbs陰性質(zhì)控品的成分包括含有濃度不低于5×104copies/ml的內(nèi)標片段的假病毒和te緩沖液。
7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的定量檢測b族鏈球菌核酸的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒的檢測樣本為人痰液；
8.一種非診斷目的的定量檢測b族鏈球菌核酸的檢測方法，采用如權(quán)利要求4至7中任一項所述的試劑盒進行檢測，其特征在于，包括以下步驟：
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的定量檢測b族鏈球菌核酸的檢測方法，其特征在于，所述pcr反應(yīng)條件如下：
10.根據(jù)權(quán)利要求8所述的定量檢測b族鏈球菌核酸的檢測方法，其特征在于，所述檢測方法還包括：