本發(fā)明屬于生物檢測(cè)及診斷，具體涉及一種基于血清mir-21的3’末端2’-o-甲基化作為非小細(xì)胞肺癌尤其是kras?g12c檢測(cè)標(biāo)記物的用途及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、非小細(xì)胞肺癌是一種高度惡性的腫瘤，其發(fā)病率和死亡率均在全球范圍內(nèi)居高不下。盡管近年來在非小細(xì)胞肺癌治療方面已經(jīng)取得了顯著進(jìn)展，但是，鑒于早期診斷、精準(zhǔn)治療和預(yù)后評(píng)估對(duì)于提高患者的生存率和生活質(zhì)量的重要性，非小細(xì)胞肺癌的早期診斷仍然具有舉足輕重的重要意義。因此，對(duì)于建立一種快速可靠的非小細(xì)胞肺癌的早期診斷方法是非常必要的。

2、近期研究表明，哺乳動(dòng)物體內(nèi)多種小分子rna都存在3’末端甲基化，如一些致癌性microrna。而microrna的3’末端2’-o-甲基化修飾，不僅可以增強(qiáng)mirna的穩(wěn)定性，還可以增加與ago2的結(jié)合親和力。這些小分子rna的3’末端甲基化可以使其免受細(xì)胞中多種核酸外切酶、連接酶、末端轉(zhuǎn)移酶、聚合酶等可作用于核酸3’末端羥基的酶攻擊，從而保護(hù)小分子rna的穩(wěn)定。

3、事實(shí)上，mirna甲基化異常在癌癥中的作用是多方面的。一方面，mirna甲基化異?？赡軐?dǎo)致某些腫瘤抑制性mirna的表達(dá)下調(diào)，從而失去對(duì)癌癥相關(guān)基因的負(fù)調(diào)控作用，進(jìn)一步促進(jìn)腫瘤的發(fā)展。另一方面，mirna甲基化異常也可能導(dǎo)致一些促癌mirna的表達(dá)上調(diào)，從而增強(qiáng)其對(duì)癌癥相關(guān)基因的陽(yáng)性調(diào)控作用，如kras?g12c突變，進(jìn)一步促進(jìn)腫瘤的發(fā)展。

4、據(jù)報(bào)道，kras是人類中常見的癌基因之一，其可以參與細(xì)胞增殖、分化和生存等關(guān)鍵過程。kras的基因突變是非小細(xì)胞肺癌最常見的遺傳改變之一，其中g(shù)12c是最常見的突變類型。該突變會(huì)導(dǎo)致kras蛋白的gtp酶活性增加，使其處于活性狀態(tài)，進(jìn)而持續(xù)激活下游信號(hào)通路(如mapk和pi3k通路)，促進(jìn)細(xì)胞增殖和生存。因此，kras?g12c突變與腫瘤的惡性程度、預(yù)后和藥物治療的敏感性密切相關(guān)。

5、在臨床上，kras突變已成為指導(dǎo)腫瘤治療策略的重要分子標(biāo)志物。而目前臨床上常用的檢測(cè)kras?g12c突變的方法通常需要組織活檢以獲取組織樣本，通常需要通過手術(shù)或穿刺等方式獲取腫瘤組織，這對(duì)患者來說是一種侵入性的過程，可能帶來疼痛、感染和出血等并發(fā)癥。此外，由于腫瘤在不同區(qū)域之間可能存在異質(zhì)性，通常從一個(gè)局部組織樣本中獲取的信息可能無法全面反映整個(gè)腫瘤的特征。再者，組織活檢通常需要一定的時(shí)間來完成，包括手術(shù)等待時(shí)間、實(shí)驗(yàn)室處理和病理學(xué)分析等，這可能導(dǎo)致診斷和治療決策的延遲。

6、液體活檢是一種無創(chuàng)性的腫瘤診斷和監(jiān)測(cè)方法，通過分析體液(如血清)中的腫瘤相關(guān)標(biāo)志物，如外泌體和循環(huán)腫瘤rna(ctrna)等，來獲取腫瘤信息。相對(duì)于傳統(tǒng)的組織活檢，液體活檢具有諸多優(yōu)勢(shì)：

7、無創(chuàng)性：液體活檢可以通過采集血液、尿液、唾液等常規(guī)體液樣本，而無需進(jìn)行侵入性的手術(shù)或組織活檢，降低了患者的不適和風(fēng)險(xiǎn)，并提供了更方便的樣本采集方式；

8、全身性：液體活檢可以提供全身性的腫瘤信息，而不僅僅局限于一個(gè)特定的腫瘤部位，其能夠檢測(cè)到整個(gè)體內(nèi)的循環(huán)腫瘤標(biāo)志物，反映出腫瘤的全身性特征和變化；

9、動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)：由于液體活檢可以反復(fù)采集和分析樣本，因此可以實(shí)現(xiàn)腫瘤的動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)，其可以用于檢測(cè)治療后的殘余病變、監(jiān)測(cè)腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，并評(píng)估治療效果和藥物抗性等；

10、空間異質(zhì)性考慮：液體活檢可以克服組織活檢的局部異質(zhì)性限制，因?yàn)檠h(huán)腫瘤標(biāo)志物可以反映腫瘤在全身范圍內(nèi)的遺傳和表達(dá)特征；

11、提供個(gè)體化治療策略：液體活檢可以幫助選擇最佳的治療方案，并根據(jù)腫瘤的分子特征和變異性進(jìn)行個(gè)體化治療策略的制定。

12、綜上，液體活檢作為一種無創(chuàng)性的腫瘤診斷和監(jiān)測(cè)方法，具有無創(chuàng)性、全身性、動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)和個(gè)體化治療等優(yōu)勢(shì)，為腫瘤患者的診斷和治療提供了新的機(jī)會(huì)和選擇。因此，本領(lǐng)域期待開發(fā)一種簡(jiǎn)便、無創(chuàng)的基于液體活檢技術(shù)檢測(cè)非小細(xì)胞肺癌kras?g12c突變的方法，對(duì)于臨床診斷和治療策略的制定具有重要意義。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、為此，本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題在于提供一種基于血清mir-21的3’末端2’-o-甲基化作為非小細(xì)胞肺癌尤其是kras?g12c檢測(cè)標(biāo)記物的用途，能夠通過檢測(cè)血清中mir-21的3’末端2’-o-甲基化水平來準(zhǔn)確檢測(cè)kras?g12c突變，從而解決了傳統(tǒng)組織活檢方法存在的侵入性、局部異質(zhì)性和時(shí)間滯后性等缺陷；

2、本發(fā)明所要解決的第二個(gè)技術(shù)問題在于提供上述基于血清mir-21的3’末端2’-o-甲基化作為非小細(xì)胞肺癌尤其是kras?g12c檢測(cè)標(biāo)記物的應(yīng)用，進(jìn)而提供一種快速的、無創(chuàng)性、全身性的基于液體活檢技術(shù)診斷及檢測(cè)非小細(xì)胞肺癌的方法。

3、為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明所述的一種基于mir-21的3’末端2’-o-甲基化用于制備肺癌診斷生物標(biāo)記物的用途。

4、具體的，所述肺癌包括非小細(xì)胞肺癌。

5、具體的，所述非小細(xì)胞肺癌包括kras?g12c突變。

6、具體的，所述mir-21的3’末端2’-o-甲基化來源于血清。

7、本發(fā)明還公開了一種檢測(cè)mir-21的3’末端2’-o-甲基化水平的物質(zhì)和/或試劑用于制備診斷或輔助診斷、篩查或輔助篩查非小細(xì)胞肺癌尤其是非小細(xì)胞肺癌產(chǎn)品的用途。

8、本發(fā)明還公開了一種檢測(cè)mir-21的3’末端2’-o-甲基化表達(dá)水平的物質(zhì)和/或試劑用于制備檢測(cè)kras?g12c突變相關(guān)性和/或突變表達(dá)水平的產(chǎn)品的用途。

9、本發(fā)明還公開了一種用于非小細(xì)胞肺癌診斷或輔助診斷、篩查或輔助篩查的產(chǎn)品，所述產(chǎn)品包括基于rt-qpcr法檢測(cè)kras?g12c突變相關(guān)性和/或突變水平的試劑。

10、具體的，所述的用于非小細(xì)胞肺癌診斷或輔助診斷、篩查或輔助篩查的產(chǎn)品，所述產(chǎn)品包括血漿試劑盒。

11、具體的，所述的用于非小細(xì)胞肺癌診斷或輔助診斷、篩查或輔助篩查的產(chǎn)品，所述試劑盒包括莖環(huán)法熒光定量pcr試劑盒或加尾法熒光定量pcr試劑盒。

12、具體的，本發(fā)明可選的所述莖環(huán)法熒光定量pcr試劑盒，可以使用thermo?fisherscientific公司的莖環(huán)引物進(jìn)行逆轉(zhuǎn)，其檢測(cè)體系如下表1，pcr反應(yīng)程序如下表2。

13、表1莖環(huán)法熒光定量pcr體系

14、 試劑 體積(μl) amv 0.5 5×amv?buffer 2 dntp?mix(2.5mm) 4 depc 1.5 stem-loop?rt?primer 1 rna 1 total 10

15、表2反應(yīng)程序

16、

17、

18、上述逆轉(zhuǎn)錄完成后，再利用相對(duì)應(yīng)的qpcr探針進(jìn)行定量檢測(cè)，具體的q-pcr體系如下表3，qpcr反應(yīng)程序如下表4。

19、表3?q-pcr體系

20、 試劑 體積(μl) <![cdata[ddh₂o]]> 14.77 10×buffer 2 <![cdata[mgcl₂]]> 1.2 dntp(10mm) 0.4 rtaq 0.3 tm?probe 0.33 cdna 1 total 20

21、表4?qpcr反應(yīng)程序如下：

22、

23、具體的，本發(fā)明可選的所述加尾法熒光定量pcr試劑盒，可以使用qiagen公司的mircury?lnart?kit逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)，其pcr體系如下表5，反應(yīng)程序如下表6。

24、表5反應(yīng)體系

25、 試劑 體積(μl) 10x?mircury?rt?enzyme?mix 0.5 5x?mircury?reaction?buffer 1 nuclease?free?water 0.5 rna 3 total 5

26、表6反應(yīng)程序

27、 溫度(℃) 時(shí)間(min) 42 60 95 5

28、上述反應(yīng)后，逆轉(zhuǎn)錄所得的cdna加入15μl?depc水稀釋混勻，而后進(jìn)行后續(xù)的q-pcr反應(yīng)，具體反應(yīng)體系如下表7，反應(yīng)程序如下表8。

29、表7?q-pcr反應(yīng)體系

30、 試劑 體積(μl) sybr?green?master?mix?2x?concentrate2 10 pcr?primer?6mix 2 rnase-free?water 6 cdna 2 total 20

31、表8?q-pcr反應(yīng)程序

32、

33、本發(fā)明中，計(jì)算甲基化和未甲基化標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)準(zhǔn)曲線的方法如下：

34、(1)取mir-21標(biāo)準(zhǔn)品1nmol，加depc水100μl，配成10μmstandard?rna儲(chǔ)存液，分裝保存；

35、(2)取2’-o-甲基化mir-21標(biāo)準(zhǔn)品5nmol，加depc水500μl，配成10μmstandard?rna儲(chǔ)存液，分裝保存；

36、(3)梯度稀釋：取5μl?standard?rna儲(chǔ)存液，加入45μl?rnase?free?water，配置濃度為1μm的梯度1樣本；取梯度1樣本5μl，加入45μl?rnase?free?water，配置為100nm的梯度2樣本；依次取梯度(n)樣本5μl，加入45μl?rnase?free?water，配置濃度低一個(gè)數(shù)量級(jí)的梯度n+1樣本；具體梯度稀釋濃度見表9；

37、(4)分別選取梯度4-10進(jìn)行莖環(huán)、加尾qrt-pcr實(shí)驗(yàn)，以濃度為橫坐標(biāo)，ct值為縱坐標(biāo)，以繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并計(jì)算差值。

38、表9樣品濃度稀釋梯度

39、 4 5 6 7 8 9 10 1nm 100pm 10pm 1pm 100fm 10fm 1fm

40、本發(fā)明還公開了一種用于診斷或輔助診斷、篩查或輔助篩查非小細(xì)胞肺癌的系統(tǒng)，包括：

41、檢測(cè)裝置，所述檢測(cè)裝置用于測(cè)定生物樣品中kras?g12c突變相關(guān)性和/或突變水平；

42、判斷裝置，所述判斷裝置基于所述生物樣品中kras?g12c是否突變或者突變表達(dá)量，進(jìn)行診斷或輔助診斷、篩查或輔助篩查待測(cè)人是否患有非小細(xì)胞肺癌。

43、本發(fā)明提供了一種基于血清中mir-21的3’末端2’-o-甲基化作為非小細(xì)胞肺癌尤其是kras?g12c檢測(cè)標(biāo)記物的用途，能夠通過檢測(cè)血清中mir-21的3’末端2’-o-甲基化水平來準(zhǔn)確檢測(cè)kras?g12c突變，有效解決了高度致命的非小細(xì)胞肺癌早期診斷和治療選擇困難的問題，從而實(shí)現(xiàn)基于液體活檢技術(shù)對(duì)非小細(xì)胞肺癌的診斷及篩查，解決了傳統(tǒng)組織活檢方法存在的侵入性、局部異質(zhì)性和時(shí)間滯后性等缺陷。

44、本發(fā)明進(jìn)一步提供了基于血清中mir-21的3’末端2’-o-甲基化作為非小細(xì)胞肺癌尤其是kras?g12c檢測(cè)標(biāo)記物的應(yīng)用，進(jìn)而提供一種快速的、無創(chuàng)性、全身性的基于液體活檢技術(shù)診斷及檢測(cè)非小細(xì)胞肺癌的方法，對(duì)于非小細(xì)胞肺癌的診斷和治療具有重要意義。

45、本方法通過對(duì)于患者血清中的mir-21的3’末端2’-o-甲基化水平的檢測(cè)，建立了對(duì)非小細(xì)胞肺癌kras?g12c突變的液體活檢方法，本方法擁有以下優(yōu)點(diǎn)：

46、非侵入性：mir-21的3’末端2’-o-甲基化水平的檢測(cè)可以通過采集患者的血液樣本進(jìn)行，而無需進(jìn)行侵入性的手術(shù)或組織活檢，這種非侵入性的檢測(cè)方法對(duì)于患者來說更加方便和可接受；

47、kras突變特異性：mir-21的3’末端2’-o-甲基化水平的上調(diào)與非小細(xì)胞肺癌中kras突變的相關(guān)性較高；因此，通過檢測(cè)mir-21的3’末端2’-o-甲基化水平的表達(dá)水平，可以間接地推測(cè)出kras突變的存在與否；

48、高靈敏度：mir-21的3’末端2’-o-甲基化水平的上調(diào)在非小細(xì)胞肺癌中普遍存在，并且與kras突變相關(guān)；因此，mir-21的3’末端2’-o-甲基化水平的檢測(cè)可以提供高靈敏度的非小細(xì)胞肺癌kras突變的篩查和診斷；

49、動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)：由于液體活檢的特點(diǎn)，mir-21的3’末端2’-o-甲基化水平的檢測(cè)可以實(shí)現(xiàn)非小細(xì)胞肺癌kras突變的動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)，通過反復(fù)采集樣本，可以及時(shí)監(jiān)測(cè)kras突變的變化情況，包括治療后的殘余病變、復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移等；

50、潛在的預(yù)后價(jià)值：一些研究表明，mir-21的3’末端2’-o-甲基化水平的上調(diào)與非小細(xì)胞肺癌患者的不良預(yù)后相關(guān)；因此，mir-21的3’末端2’-o-甲基化水平的檢測(cè)可能有助于評(píng)估患者的預(yù)后風(fēng)險(xiǎn)，并對(duì)個(gè)體化治療方案的制定提供參考。

51、本技術(shù)進(jìn)一步提供了一種利用血清mir-21的3’末端2’-o-甲基化水平的表達(dá)水平來檢測(cè)非小細(xì)胞肺癌患者中kras?g12c突變的方法，并通過對(duì)非小細(xì)胞肺癌患者血清中循環(huán)的mir-21的3’末端2’-o-甲基化的檢測(cè)以反應(yīng)患者非小細(xì)胞肺癌kras?g12c突變，并對(duì)患者預(yù)后生存進(jìn)行預(yù)測(cè)，該方法具有非侵入性、高靈敏度和特異性、方便快速等優(yōu)點(diǎn)，具備在臨床實(shí)踐中推廣和應(yīng)用的潛力。