本發(fā)明涉及柑橘病原檢測(cè)，具體涉及基于rpa-crispr-cas12b檢測(cè)柑橘裂皮類病毒的引物、試劑盒及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、柑橘裂皮病是由柑橘裂皮類病毒(citrus?exocortis?viroid,cevd)引起、發(fā)生在柑橘上的病害。該病害主要為害以積、橙和黎檬作砧木的柑橘品種。夏橙呈快速蔓延的趨勢(shì)，其中病株率為100％的夏橙園約占30％。由于中國(guó)許多地區(qū)廣泛采用枳作砧木，因而該病害是枳砧柑橘品種潛在的毀滅性病害，尤其是給臍橙類的發(fā)展造成了更大的威脅。

2、傳統(tǒng)的柑橘重要嫁接傳染病原的檢測(cè)方法之一是指示植物鑒定法，頗為耗時(shí)。目前針對(duì)上述病原已建立了針對(duì)單一病原的快速檢測(cè)方法，包括血清學(xué)、rt-pcr/qpcr及基于環(huán)介導(dǎo)等溫核酸擴(kuò)增技術(shù)的檢測(cè)方法等。其中血清學(xué)檢測(cè)是柑橘常見(jiàn)病毒檢驗(yàn)常用的方法。

3、在crispr檢測(cè)中，特定crispr/cas系統(tǒng)的反式切割活性被用于檢測(cè)靶標(biāo)核酸。具體來(lái)說(shuō)，在特定crispr/cas系統(tǒng)中，通過(guò)人工合成的single?guide?rna(sgrna)的spacer與靶標(biāo)序列特異性結(jié)合后，可以激活cas蛋白的反式切割活性，從而切割體系中的熒光標(biāo)記探針(ssdna或ssrna)，產(chǎn)生熒光信號(hào)，實(shí)現(xiàn)靶標(biāo)核酸的檢測(cè)。crispr檢測(cè)技術(shù)具有高靈敏度和高特異性，能夠在等溫情況下，快速、準(zhǔn)確地檢測(cè)目標(biāo)核酸，是一種理想的核酸檢測(cè)平臺(tái)。目前發(fā)現(xiàn)有反式切割活性的crispr/cas系統(tǒng)有cas13、cas12a和cas12b等crispr/cas系統(tǒng)。與cas12a相比，aacas12b的耐受溫度范圍更寬，其在37～65℃的溫度范圍內(nèi)均有很好的檢測(cè)活性，更適合與rpa、lamp類的等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)同步進(jìn)行。

4、因此，本發(fā)明針對(duì)cevd靶標(biāo)開(kāi)發(fā)了基于rpa和crispr的等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)方法，以擺脫傳統(tǒng)分子生物學(xué)方法對(duì)復(fù)雜儀器設(shè)備平臺(tái)的依賴，極大簡(jiǎn)化檢測(cè)平臺(tái)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的是提出基于rpa-crispr-cas12b檢測(cè)柑橘裂皮類病毒的引物、試劑盒及其應(yīng)用，以解決上述的技術(shù)問(wèn)題。

2、為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案如下：

3、本發(fā)明提供了用于檢測(cè)柑橘裂皮類病毒的sgrna，所述sgrna為cevd-127rev、cevd-134rev、cevd-150forw、cevd-94forw和cevd-241rev中一種；所述cevd-127rev的核苷酸序列如seq?id?no:1所示，所述cevd-134rev的核苷酸序列如seq?id?no:2所示，所述cevd-150forw的核苷酸序列如seq?id?no:3所示，所述cevd-94forw的核苷酸序列如seq?idno:4所示，所述cevd-241rev的核苷酸序列如seq?id?no:5所示。

4、本發(fā)明還提供了基于rpa-crispr-cas12b檢測(cè)柑橘裂皮類病毒的檢測(cè)體系，包括rpa擴(kuò)增反應(yīng)體系和cas12b檢測(cè)反應(yīng)體系；所述cas12b檢測(cè)反應(yīng)體系包括如seq?id?no:1～5中任一所述的sgrna。

5、優(yōu)選地，所述cas12b檢測(cè)反應(yīng)體系還包括synsor?aacas12b、10×aacas12bbuffer和synsor?crispr?ssdna?reporter(12b-fam)。

6、優(yōu)選地，所述rpa擴(kuò)增反應(yīng)體系包括rpa引物，所述rpa引物包括：核苷酸序列如seqid?no:6所示的cevd-rpa-f3、核苷酸序列如seq?id?no:7所示的cevd-rpa-r1、核苷酸序列如seq?id?no:8所示的cevd-rpa-f4、核苷酸序列如seq?id?no:9所示的cevd-rpa-r2和核苷酸序列如seq?id?no:10所示的cevd-rpa-f5。

7、優(yōu)選地，所述rpa引物的配對(duì)方式為上游引物cevd-rpa-f3和下游引物cevd-rpa-r1配對(duì)使用，或者上游引物cevd-rpa-f3和下游引物cevd-rpa-r2配對(duì)使用，或者上游引物cevd-rpa-f4和下游引物cevd-rpa-r1配對(duì)使用，或者上游引物cevd-rpa-f4和下游引物cevd-rpa-r2配對(duì)使用，或者上游引物cevd-rpa-f5和下游引物cevd-rpa-r1配對(duì)使用，或者上游引物cevd-rpa-f5和下游引物cevd-rpa-r2配對(duì)使用，或者上游引物cevd-rpa-f3、cevd-rpa-f4、cevd-rpa-f5和下游引物cevd-rpa-r1、cevd-rpa-r2共同使用。

8、本發(fā)明還提供了基于rpa-crispr-cas12b檢測(cè)柑橘裂皮類病毒的試劑盒，包括如上所述的基于rpa-crispr-cas12b檢測(cè)柑橘裂皮類病毒的檢測(cè)體系。

9、本發(fā)明還提供了所述的基于rpa-crispr-cas12b檢測(cè)柑橘裂皮類病毒的試劑盒在柑橘裂皮類病毒檢測(cè)中的應(yīng)用。

10、本發(fā)明還提供了一種基于rpa-crispr-cas12b檢測(cè)柑橘裂皮類病毒的方法，包括如下步驟：

11、s1、從待測(cè)樣本中提取總rna并反轉(zhuǎn)錄為cdna；

12、s2、以步驟s1的cdna為模板，利用如上所述的rpa引物對(duì)進(jìn)行rpa等溫?cái)U(kuò)增，得到rpa擴(kuò)增產(chǎn)物；

13、s3、以步驟s2得到的rpa擴(kuò)增產(chǎn)物為模板，加入cas12b檢測(cè)反應(yīng)體系進(jìn)行crispr反應(yīng)；

14、所述cas12b檢測(cè)反應(yīng)體系包括如seq?id?no:1～5中任一所述的sgrna、synsoraacas12b、10×aacas12b?buffer和synsor?crispr?ssdna?reporter(12b-fam)；

15、s4、crispr反應(yīng)結(jié)束后，讀取檢測(cè)信號(hào)，根據(jù)檢測(cè)信號(hào)確定檢測(cè)結(jié)果。

16、本發(fā)明中判斷標(biāo)準(zhǔn)為以水模板為陰性對(duì)照，檢測(cè)數(shù)據(jù)與陰性對(duì)照數(shù)據(jù)相比較有無(wú)顯著性差異，無(wú)顯著性差異判定為陰性，有顯著性差異判定為陽(yáng)性。

17、優(yōu)選地，步驟s3中cas12b檢測(cè)反應(yīng)體系具體為2.5μm?synsor?aacas12b?2μl、100ng/μl?synsor?sgrna?1μl、10×aacas12b?buffer?5μl、synsor?crispr?ssdnareporter(12b-fam)0.5μl和水補(bǔ)足至50μl。

18、本發(fā)明還提供了所述的基于rpa-crispr-cas12b檢測(cè)柑橘裂皮類病毒的方法在生物檢疫中的應(yīng)用，所述生物檢疫以柑橘葉為生物檢疫材料。

19、綜上所述，與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明方案具備以下有益效果：

20、本發(fā)明針對(duì)柑橘中常見(jiàn)的cevd病原物靶標(biāo)，開(kāi)發(fā)了基于rpa和crispr的等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)方法，擺脫了傳統(tǒng)分子生物學(xué)方法對(duì)復(fù)雜儀器設(shè)備平臺(tái)的依賴，極大簡(jiǎn)化了檢測(cè)平臺(tái)；通過(guò)體系建立和驗(yàn)證，使cevd靶標(biāo)的總體檢測(cè)時(shí)間均縮短至半小時(shí)以內(nèi)；同時(shí)驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果表明本發(fā)明所開(kāi)發(fā)的檢測(cè)方法具有較好的靈敏度和特異性，且實(shí)際樣本驗(yàn)證結(jié)果與rt-pcr方法結(jié)果一致。