本發(fā)明害蟲防治領(lǐng)域，具體涉及一種荔枝蒂蛀蟲的雌雄鑒別方法、引物和試劑盒。
背景技術(shù)：
1、荔枝、龍眼是原產(chǎn)于我國的亞熱帶名優(yōu)水果。2023年，我國荔枝種植面積790.12萬畝，龍眼種植面積418.8萬畝，均為世界上規(guī)模最大的種植國。荔枝、龍眼生長過程中，溫暖濕潤的氣候環(huán)境和常年不落葉的特性，使其易遭受多種病蟲害的威脅。
2、荔枝蒂蛀蟲(conopomorpha?sinensis?bradley)屬鱗翅目，細蛾科，是荔枝、龍眼上最主要的害蟲之一。該蟲以幼蟲鉆蛀為害荔枝、龍眼的果實、花穗、嫩梢和嫩葉，尤其偏愛果實，一般年份荔枝、龍眼蟲果率為10％-20％，嚴重年份達60％-90％，給荔枝、龍眼生產(chǎn)帶來巨大損失。目前，果園防治該蟲主要采用化學藥劑的方式，其隱蔽的為害方式，造成防治效果低下。此外，多年來一直過度使用化學農(nóng)藥，不僅對發(fā)展無公害荔枝、龍眼產(chǎn)品形成阻礙，還對生態(tài)環(huán)境產(chǎn)生極大的破壞，并引發(fā)抗藥性的產(chǎn)生。因此，在科學用藥的同時，亟需研究開發(fā)其他的綠色可持續(xù)的防控措施。目前，許多學者對荔枝蒂蛀蟲的生物學、生態(tài)學及綜合防治技術(shù)進行了大量的報道，而有關(guān)雌雄鑒別方面的報道較少。昆蟲的雌雄鑒別對于以其生物學、生態(tài)學等為基礎(chǔ)的防治研究至關(guān)重要，因此，探究荔枝蒂蛀蟲雌雄個體差異，構(gòu)建準確、快速且穩(wěn)定的鑒別方法，對該蟲的可持續(xù)治理具有重要意義。
3、當前，昆蟲的性別鑒定主要通過蛹和成蟲期的形態(tài)差異進行判斷。果園中采集的荔枝蒂蛀蟲多處于老熟幼蟲期，雌雄形態(tài)特征差異不明顯，蛹和成蟲個體小，且成蟲活動能力強，通過觀察法鑒別要求操作者具有豐富的經(jīng)驗，具有一定的主觀性，容易出現(xiàn)誤判，準確性低且不穩(wěn)定。因此，開發(fā)一種準確、快速且穩(wěn)定的荔枝蒂蛀蟲各蟲態(tài)性別鑒別技術(shù)十分必要。
技術(shù)實現(xiàn)思路
1、本發(fā)明的目的是提供一種荔枝蒂蛀蟲的雌雄鑒別序列。
2、所述的雌雄鑒別序列如下所示：5`-atggatgacgaagaaaatacaacgaaaaagaaa?aagaagagttccaaatataactacgcttttggtgatctttatccaggtgttacgattggacataagacatgcaatcctttcatggtacctggcctccctgtgccagccgacatggggtggttgtggaatgcgcgagatgttcctgggataaagtatcgtcgaggctggcagccaggcatcatcggcaagagtgttgcaaaagtgatgacatttaagacaccacgagttggacccgataaagacaagaacaaaaagaagaagaaaaagggggcgaagcctggcgaggcgttgggaggaggtgactccgaacctgaagagccgttggaaccgaaacccgctttgaaggttcagaggaaaggagacgtttttactatacaggttaaccccttgaaagacctcactgaaatccatccaaatgaagatccttacgtggactgcgaccctctcgtcttcaaaatcatcaaaaagaggagtccagaagaacaggctaaagttgaagccaggagaatggtgaaactaaagaaaaagagagacgctgaaattcgcaatgctttagccgaagccacagaagacatctgcaagtgtgcttatatggatgtcttttgcaacgacttaacggccatcgacaaagtgattgaaaagtgtcctactttcaaagatccagagtgtatttgtcagtcggaatcgttgagttcgctttccagcaacgcgacatgggacatagagtacacgcctccattcggctgcttcgatctggctcctagaaaacgcataaactatatccacgtagagacacagtaccttgctactgacgctggcattccggacacgccgaaggtaaagtgtaaaaagtctacagcgtctataaggaagagttcgctgaagaagtcctcgtgtaagaaatgttgcagtccatgcttttga-3`(seq?id?no.1)。
3、本發(fā)明的第二個目的是提供荔枝蒂蛀蟲雌雄鑒別引物對，其包括正向引物序列為：5
4、`-gtggaatgcgcgagatgttc-3`，反向引物序列為：5`-tttgaagacgagagggtc?gc-3`。
5、本發(fā)明的第二個目的是提供一種荔枝蒂蛀蟲雌雄鑒別的試劑盒，其含有上述引物對。
6、本發(fā)明的第三個目的是提供一種荔枝蒂蛀蟲雌雄鑒別方法，其包括以下步驟：
7、提取荔枝蒂蛀蟲的rna，然后反轉(zhuǎn)錄成cdna，然后利用上述引物對進行pcr擴增，然后進行瓊脂糖電泳，在334bp位置具有條帶的則為雄性荔枝蒂蛀蟲，而沒有條帶的則為雌性荔枝蒂蛀蟲。
8、優(yōu)選，所述的荔枝蒂蛀蟲可以為各個蟲態(tài)的荔枝蒂蛀蟲，例如蛹、成蟲或老熟幼蟲。
9、優(yōu)選，所述的pcr擴增，其反應體系為：2×taq?hifi?pcr?mix?10μl、10μm正向引物0.5μl、10μm反向引物0.5μl、cdna模板1μl，rnase?free?water加到20μl。
10、優(yōu)選，所述的pcr擴增，其反應程序為：95℃預變性3min；94℃變性25s；62
11、℃退火25s；72℃延伸8s；變性-退火-延伸重復34個循環(huán)；72℃延伸5min。
12、本發(fā)明利用分子生物學技術(shù)，實現(xiàn)高效且準確、快速、穩(wěn)定的荔枝蒂蛀蟲雌雄性別鑒定，為該蟲的科學研究及防控技術(shù)開發(fā)提供可靠參考。
1.一種荔枝蒂蛀蟲的雌雄鑒別序列，其特征在于，所述的雌雄鑒別序列如seq?id?no.1所示。
2.一種荔枝蒂蛀蟲雌雄鑒別引物對，其特征在于，包括正向引物序列為：5`-gtggaatgcgcgagatgttc-3`，反向引物序列為：5`-tttgaagacgagagggtcgc-3`。
3.一種荔枝蒂蛀蟲雌雄鑒別的試劑盒，其特征在于，含有權(quán)利要求2所述的引物對。
4.一種荔枝蒂蛀蟲雌雄鑒別方法，其特征在于，包括以下步驟：
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的鑒別方法，其特征在于，所述的荔枝蒂蛀蟲為各個蟲態(tài)的荔枝蒂蛀蟲，優(yōu)選為蛹、成蟲或老熟幼蟲。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的鑒別方法，其特征在于，所述的pcr擴增，其反應體系為：2×taq?hifi?pcr?mix?10μl、10μm正向引物0.5μl、10μm反向引物0.5μl、cdna模板1μl，rnasefree?water加到20μl。
7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的鑒別方法，其特征在于，所述的pcr擴增，其反應程序為：95℃預變性3min；94℃變性25s；62℃退火25s；72℃延伸8s；變性-退火-延伸重復34個循環(huán)；72℃延伸5min。