本發(fā)明屬于抗體篩選和疾病診斷領(lǐng)域，具體而言，涉及一種tff1、aat單克隆抗體及其組合在結(jié)直腸癌診斷中的應用。

背景技術(shù)：

1、直腸癌是全球第三大常見惡性腫瘤，占結(jié)直腸癌病例的約30%。近年來隨著飲食結(jié)構(gòu)的西化（如高脂肪、低纖維飲食）、缺乏運動及老齡化趨勢加劇，直腸癌的發(fā)病率逐年上升?，F(xiàn)階段診斷方法主要包括：結(jié)腸鏡檢測、糞便潛血試驗（fobt）、血液標志物檢測、影像學檢查等。其中結(jié)腸鏡檢查作為診斷直腸癌的金標準，但是存在侵入性強，成本高等缺點，糞便潛血試驗特異性低且易受痔瘡或消化道潰瘍等疾病的干擾，極易出現(xiàn)假陽性或假陰性的結(jié)果，另外，影像學檢查主要的不足在于對早期微小病灶檢測能力有限且費用較高，本專利利用血液標志物檢測方法，具有無創(chuàng)傷、低成本、易于重復檢測等優(yōu)點，另外針對該檢測方法的敏感性和特異性有限的問題，該專利利用更加高效和可靠的兩種生物標志物聯(lián)合檢測的方式，大大提高對于直腸癌早期篩查或診斷的準確性。

2、乳腺癌相關(guān)肽(ps2，即tff1)，屬于三葉家族成員，該家族特征是至少有一個三葉基序的拷貝，一個40個氨基酸的結(jié)構(gòu)域，包含三個保守的二硫鍵。它們是在胃腸道黏膜中表達的穩(wěn)定的分泌蛋白。該基因在腸道和結(jié)腸的杯狀細胞中表達。三葉因子家族是一類具有穩(wěn)定三葉結(jié)構(gòu)的分泌型小肽，包括三個成員：tff1、tff2和tff3。在這三種模式中，tff1化合物的濃度最高。另外tff1與多種腫瘤發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切，在結(jié)直腸癌患者中，tff1含量顯著增加，可作為結(jié)直腸癌的早期診斷生物標志物。

3、人α-1抗胰蛋白酶(aat)，又名serpin?a1，也稱為α1蛋白酶抑制劑(α1-pi)和絲氨酸蛋白酶抑制劑1(絲氨酸蛋白酶抑制劑，a組，成員1)，是一種循環(huán)糖蛋白，其主要功能是抑制血液和組織中的中性粒細胞彈性蛋白酶和其他絲氨酸蛋白酶。aat缺乏癥是一種遺傳性疾病，通常容易導致慢性阻塞性肺病(copd)、肝硬化、復發(fā)性脂膜炎、系統(tǒng)性血管炎以及可能的一系列炎癥和腫瘤疾病的過早發(fā)作。此外，一些臨床研究表明，aat缺乏癥患者患惡性腫瘤的風險增加，包括肝細胞癌、肺癌、膀胱腫瘤和膽囊腫瘤、惡性淋巴瘤和結(jié)腸癌，因而，可作為結(jié)直腸癌的早期診斷生物標志物。

4、雖然tff1和aat均可作為結(jié)直腸癌的早期診斷生物標志物，但現(xiàn)有技術(shù)存在如下空白：1）缺乏標準化檢測工具：不同試劑盒檢測結(jié)果差異大，難以精確檢測；2）未探索協(xié)同診斷價值：尚無研究數(shù)據(jù)表明tff1與aat聯(lián)合可提升診斷效能（auc值等指標未見文獻報道）。

5、因此，亟需分別找到特異性強、靈敏度高的tff1抗體和aat抗體用于早期精準診斷結(jié)直腸癌。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明提供了一種tff1、aat單克隆抗體及其組合在結(jié)直腸癌診斷中的應用，通過優(yōu)化tff1、aat的免疫原序列，篩選高親和力、高特異性的單克隆抗體，篩選出最優(yōu)的tff1和aat抗體并進行組合，能有效解決現(xiàn)有抗體存在的親和力和特異性低、穩(wěn)定性差的問題，檢測范圍更寬，聯(lián)合檢測時體現(xiàn)出極高的協(xié)同診斷價值，顯著提升早期結(jié)直腸癌的診斷效能，具有重要的臨床應用價值。

2、現(xiàn)有技術(shù)方案中采用傳統(tǒng)雜交瘤技術(shù)、噬菌體展示技術(shù)或重組蛋白免疫動物制備tff1蛋白或aat蛋白的單克隆或多克隆抗體時，存在免疫原設(shè)計未優(yōu)化導致抗體親和力和特異性不足的問題，且現(xiàn)有elisa或化學發(fā)光法檢測tff1、aat蛋白腫瘤標志物時，未針對tff1和aat抗體的組合進行試劑盒優(yōu)化，導致檢測靈敏度和特異性較低，無法實現(xiàn)高效的結(jié)直腸癌診斷。本發(fā)明開發(fā)了全新的tff1和aat的高特異性抗體及其組合，能夠用于診斷試劑盒的制備，檢測不同樣本中的tff1和aat，以實現(xiàn)臨床價值。

3、一方面，本發(fā)明提供一種tff1單克隆抗體，包括第一抗體和/或第二抗體；所述第一抗體包括：

4、（1）在重鏈可變區(qū)中的由seq?id?no.1的氨基酸序列組成的cdr1、由seq?id?no.2的氨基酸序列組成的cdr2以及由seq?id?no.3的氨基酸序列組成的cdr3，和

5、（2）在輕鏈可變區(qū)中的由seq?id?no.4的氨基酸序列組成的cdr1、由seq?id?no.5的氨基酸序列組成的cdr2以及由seq?id?no.6的氨基酸序列組成的cdr3；

6、所述第二抗體包括：

7、（3）在重鏈可變區(qū)中的由seq?id?no.7的氨基酸序列組成的cdr1、由seq?id?no.8的氨基酸序列組成的cdr2以及由seq?id?no.9的氨基酸序列組成的cdr3，和

8、（4）在輕鏈可變區(qū)中的由seq?id?no.10的氨基酸序列組成的cdr1、由seq?idno.11的氨基酸序列組成的cdr2以及由seq?id?no.12的氨基酸序列組成的cdr3。

9、本發(fā)明涉及抗體制備技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及一種tff1的特異性靶向抗體及其制備方法和應用。通過生物信息檢索tff1核苷酸序列，并設(shè)計2種抗原：tff1-h01、tff1-h02，進行抗原質(zhì)粒合成，根據(jù)所獲得的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化top10挑陽性克隆、保藏，活化放大培養(yǎng)提取質(zhì)粒進行真核細胞轉(zhuǎn)染表達，親和純化獲得相應抗原。將tff1-h01抗原進行免疫注射和雜交瘤細胞融合，利用tff1-h02進行篩選，獲得多對單克隆抗體株。通過抗原檢測及抗體配對的方式，最終選擇其中優(yōu)質(zhì)抗體對用于結(jié)直腸癌快速檢測試劑盒的開發(fā)。

10、所述tff1-h01抗原的氨基酸序列如seq?id?no.50所示，核苷酸序列如seq?idno.54所示；所述tff1-h02抗原的氨基酸序列如seq?id?no.51所示，核苷酸序列如seq?idno.55所示。

11、進一步地，所述tff1單克隆抗體的第一抗體的重鏈可變區(qū)的氨基酸序列如seq?idno.13所示，輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列如seq?id?no.14所示；所述第二抗體的重鏈可變區(qū)的氨基酸序列如seq?id?no.15所示，輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列如seq?id?no.16所示。

12、所述tff1單克隆抗體的第一抗體的重鏈氨基酸序列如seq?id?no.40所示，輕鏈氨基酸序列如seq?id?no.41所示；所述tff1單克隆抗體的第二抗體的重鏈氨基酸序列如seqid?no.42所示，輕鏈氨基酸序列如seq?id?no.43所示。

13、進一步地，本發(fā)明提供一種tff1的檢測試劑盒，所述試劑盒包括上所述的tff1蛋白的抗體。

14、可以理解的是，所述試劑盒可以是elisa檢測試劑盒、化學發(fā)光免疫檢測試劑盒等等。

15、在一些方式中，所述試劑盒為elisa檢測試劑盒。通過篩選最優(yōu)且合適配對的tff1第一抗體和第二抗體，構(gòu)建雙抗體組合elisa檢測試劑盒。

16、另一方面，本發(fā)明提供一種aat單克隆抗體，包括第一抗體和/或第二抗體；所述第一抗體包括：

17、（1）在重鏈可變區(qū)中的由seq?id?no.17的氨基酸序列組成的cdr1、由seq?idno.18的氨基酸序列組成的cdr2以及由seq?id?no.19的氨基酸序列組成的cdr3，和

18、（2）在輕鏈可變區(qū)中的由seq?id?no.20的氨基酸序列組成的cdr1、由seq?idno.21的氨基酸序列組成的cdr2以及由seq?id?no.22的氨基酸序列組成的cdr3；所述第二抗體包括：

19、（3）在重鏈可變區(qū)中的由seq?id?no.23的氨基酸序列組成的cdr1、由seq?idno.24的氨基酸序列組成的cdr2以及由氨基酸序列為fdy組成的cdr3，和

20、（4）在輕鏈可變區(qū)中的由seq?id?no.25的氨基酸序列組成的cdr1、由seq?idno.26的氨基酸序列組成的cdr2以及由seq?id?no.27的氨基酸序列組成的cdr3。

21、本發(fā)明還涉及一種抗aat的特異性靶向抗體及其制備方法和應用，通過生物信息檢索aat蛋白的核苷酸序列，并設(shè)計2種抗原：aat-h01、aat-h02，進行抗原質(zhì)粒合成，根據(jù)所獲得的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化top10挑陽性克隆、保藏，活化放大培養(yǎng)提取質(zhì)粒進行真核細胞轉(zhuǎn)染表達，親和純化獲得相應抗原。將aat-h01抗原進行免疫注射和雜交瘤細胞融合，利用aat-h02進行篩選，獲得多對單克隆抗體株。通過抗原檢測及抗體配對的方式，最終選擇其中優(yōu)質(zhì)抗體對用于腸癌快速檢測試劑盒的開發(fā)。

22、所述aat-h01抗原的氨基酸序列如seq?id?no.52所示，核苷酸序列如seq?idno.56所示；所述aat-h02抗原的氨基酸序列如seq?id?no.53所示，核苷酸序列如seq?idno.57所示。

23、進一步地，所述aat單克隆抗體的第一抗體的重鏈可變區(qū)的氨基酸序列如seq?idno.28所示，輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列如seq?id?no.29所示；所述第二抗體的重鏈可變區(qū)的氨基酸序列如seq?id?no.30所示，輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列如seq?id?no.31所示。

24、所述aat單克隆抗體的第一抗體的重鏈氨基酸序列如seq?id?no.44所示，輕鏈氨基酸序列如seq?id?no.45所示；所述aat單克隆抗體的第二抗體的重鏈氨基酸序列如seqid?no.46所示，輕鏈氨基酸序列如seq?id?no.47所示。

25、再一方面，本發(fā)明提供了一種檢測aat蛋白的試劑盒，所述試劑盒包括如上所述的aat蛋白的抗體。

26、可以理解的是，所述試劑盒可以是elisa檢測試劑盒、化學發(fā)光免疫檢測試劑盒等等。

27、在一些方式中，所述試劑盒為elisa檢測試劑盒。通過篩選最優(yōu)且合適配對的aat第一抗體和第二抗體，構(gòu)建雙抗體組合elisa檢測試劑盒。

28、再一方面，本發(fā)明提供一種檢測tff1蛋白和/或aat蛋白的試劑盒，包括上述所述的tff1單克隆抗體，和/或上述所述的aat單克隆抗體。

29、在一些方式中，將檢測tff1蛋白的試劑盒和檢測aat蛋白的試劑盒進行組合，可用于同時檢測tff1蛋白和aat蛋白，從而可應用于同時進行多種標志物檢測的領(lǐng)域，通過聯(lián)合檢測來提高早期診斷結(jié)直腸癌的效能。

30、再一方面，本發(fā)明提供一種抗體用于制備預測個體是否患有結(jié)直腸癌的試劑的用途，所述抗體包括上述所述的tff1單克隆抗體，和/或上述所述的aat單克隆抗體。

31、傳統(tǒng)的單靶向抗體藥物本身存在諸多局限性，現(xiàn)有癌癥診斷技術(shù)中，單一生物標志物（如tff1）檢測存在靈敏度低、假陽性率高的問題。tff1雖與腫瘤微環(huán)境相關(guān)，但其單獨檢測的臨床應用尚未成熟。本發(fā)明將tff1和aat作為聯(lián)合標志物，通過靶向tff1和aat蛋白的抗體聯(lián)合檢測，解決單一標志物診斷效能不足的問題，提高癌癥診斷的準確性和特異性。

32、tff1和aat雖然是已知的結(jié)直腸癌診斷標志物，但是采用不同的tff1抗體和/或aat抗體來診斷結(jié)直腸癌，其診斷效能存在明顯差異。因為結(jié)直腸癌診斷過程中，需要通過tff1抗體和/或aat抗體來檢測其血液樣品，血液樣品中存在復雜的干擾物質(zhì)，基質(zhì)影響較大，容易存在交叉反應，或是一些非線性片段的干擾，直接采用現(xiàn)有的抗體檢測，難以獲得理想的檢測結(jié)果，嚴重影響診斷結(jié)果的準確性。

33、本發(fā)明經(jīng)過對抗原的設(shè)計、表達、單克隆抗體的篩選，最終獲得的tff1、aat蛋白的抗體具有更好的檢測靈敏度和特異性，而且信號更穩(wěn)定，交叉反應更小，用于結(jié)直腸癌診斷時，能顯著提高診斷效能。

34、進一步地，包括tff1單克隆抗體和aat單克隆抗體；所述tff1單克隆抗體包括第一抗體和第二抗體，所述第一抗體的重鏈可變區(qū)的氨基酸序列如seq?id?no.13所示，輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列如seq?id?no.14所示；第二抗體的重鏈可變區(qū)的氨基酸序列如seq?idno.15所示，輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列如seq?id?no.16所示；所述aat單克隆抗體包括第一抗體和第二抗體，所述第一抗體的重鏈可變區(qū)的氨基酸序列如seq?id?no.28所示，輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列如seq?id?no.29所示；第二抗體的重鏈可變區(qū)的氨基酸序列如seq?idno.30所示，輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列如seq?id?no.31所示。

35、進一步地，所述試劑用于檢測體液樣本中的能與抗體結(jié)合的抗原的含量；所述體液樣本包括唾液、血液、尿液、血漿、血清、脊髓液中的任意一種或多種。

36、在一些實施方式中，所述預測結(jié)直腸癌的試劑，是以tff1、aat蛋白為檢測目標制備的檢測試劑，本發(fā)明采用抗體檢測tff1、aat蛋白。

37、進一步地，所述試劑用于檢測體液樣本中生物標志物的有無或相對豐度或濃度。

38、本發(fā)明從血液篩選到預測結(jié)直腸癌風險的生物標志物（tff1、aat蛋白），這些兩種標志物在結(jié)直腸癌患者和健康人群的血液中存在顯著性差異，通過收集血液樣本，即可通過檢測個體血液中tff1、aat蛋白的含量，從而來預測或輔助診斷該個體患結(jié)直腸癌的可能性，或者可以檢測某一群體血液中的tff1、aat蛋白的含量，進而將該群體分為結(jié)直腸癌患者和健康人群。

39、再一方面，本發(fā)明還提供一種預測個體是否患有結(jié)直腸癌的試劑盒，包括上述所述的tff1單克隆抗體，和上述所述的aat單克隆抗體。

40、再一方面，本發(fā)明還提供一種預測個體是否患有結(jié)直腸癌的抗體組合，包括上述所述的tff1單克隆抗體，和上述所述的aat單克隆抗體。

41、再一方面，本發(fā)明還提供一種預測個體是否患有結(jié)直腸癌的系統(tǒng)，所述系統(tǒng)包括數(shù)據(jù)分析模塊，所述數(shù)據(jù)分析模塊用于分析抗原的檢測值，所述抗原通過抗體進行檢測，所述抗體包括上述所述的tff1單克隆抗體，和/或上述所述的aat單克隆抗體。

42、進一步地，所述數(shù)據(jù)分析模塊采用已知樣本的標志物的檢測值作為訓練集，根據(jù)結(jié)直腸癌患者手術(shù)后的情況，分為健康人群和結(jié)直腸癌患者，分析健康人群和結(jié)直腸癌患者的檢測值之間的關(guān)系，構(gòu)建模型。

43、進一步地，所述系統(tǒng)還包括數(shù)據(jù)存儲模塊、數(shù)據(jù)輸入界面和數(shù)據(jù)輸出界面；所述數(shù)據(jù)存儲模塊用于存儲生物標志物的檢測值；數(shù)據(jù)輸入界面用于輸入生物標志物的檢測值，數(shù)據(jù)輸出界面用于輸出預測結(jié)果。

44、本發(fā)明具有以下有益效果：

45、1、設(shè)計自制的tff1、aat表達抗原，并利用該抗原免疫動物獲得特異性靶向單克隆抗體，且具有極高的靈敏度；

46、2、對于制備的抗體進行重組，提高表達量并保證了抗體的穩(wěn)定表達；抗體的檢驗過程引入臨床血樣的檢測，大大增加了實驗數(shù)據(jù)的可靠性；雙抗體檢測，試劑用量減少50%；

47、3、篩選得到多對針對tff1抗原表位的單克隆抗體，構(gòu)建tff1檢測試劑盒，結(jié)合雙抗體夾心法設(shè)計，交叉反應率極低（<1%），靈敏度達ng/ml級別，能高精度檢測tff1蛋白；

48、4、篩選得到多對針對aat抗原表位的單克隆抗體，構(gòu)建aat檢測試劑盒，結(jié)合雙抗體夾心法設(shè)計，交叉反應率極低（<1%），靈敏度達ng/ml級別，能高精度檢測aat蛋白；

49、5、化抗體組合及檢測流程，實現(xiàn)高效、經(jīng)濟的臨床應用；

50、6、試劑盒單獨或聯(lián)合使用在消化道腫瘤中的診斷價值，特別是在腸癌中的診斷價值；首次采用聯(lián)合檢測模型（tff1+aat）較單一標志物顯著提升區(qū)分能力（auc≥0.91）。