利用質(zhì)譜進(jìn)行葉酸遺傳代謝能力檢測(cè)的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種用于確定葉酸遺傳代謝能力相關(guān)基因多態(tài)性 位點(diǎn)（SNP)的檢測(cè)方法及產(chǎn)品，具體而言是利用多重PCR技術(shù)、單堿基延伸技術(shù)和質(zhì)譜技 術(shù)，葉酸遺傳代謝能力的3個(gè)基因多態(tài)位點(diǎn)進(jìn)行檢測(cè)的方法及相應(yīng)的試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002] 葉酸是B族維生素的一種，參與DNA、RNA、蛋白質(zhì)等其他重要化合物的合成，在機(jī) 體代謝過(guò)程中發(fā)揮重要的作用，常用于孕期營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充，從而預(yù)防神經(jīng)管缺陷等疾病。
[0003] 我國(guó)患出生缺陷排在前5位的包括：先天性心臟病，神經(jīng)管畸形，唇腭裂，唐氏綜 合癥，多指（趾）。根據(jù)2003年的統(tǒng)計(jì)結(jié)果，我國(guó)先天性心臟病的發(fā)病人數(shù)達(dá)到11-16萬(wàn) 人。根據(jù)2004年的統(tǒng)計(jì)結(jié)果，我國(guó)神經(jīng)管畸形的發(fā)病發(fā)生率為9. 44/萬(wàn)。此外，根據(jù)2003 年的統(tǒng)計(jì)結(jié)果，唐氏綜合癥的發(fā)病率位18000人，
[0004] 神經(jīng)管畸形是指由于胚胎在母體內(nèi)發(fā)育至第3-4周時(shí)，神經(jīng)管未能閉合所造成的 先天缺陷，可導(dǎo)致脊柱裂，腦膨出和無(wú)腦畸形。
[0005] 先天性心臟病是器官形成期心血管系統(tǒng)發(fā)育導(dǎo)致的一種疾病。研宄表明，HCY可 影響胚胎早期心血管發(fā)育，補(bǔ)充葉酸能夠明顯緩解同型半胱氨酸對(duì)心血管的發(fā)育毒性，降 低CHD的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。
[0006] 有研宄認(rèn)為，由于葉酸代謝相關(guān)基因的缺陷致葉酸的代謝障礙引起的甲基化導(dǎo) 致染色體不分離，可能是發(fā)生唐氏綜合征的危險(xiǎn)因素。
[0007] 葉酸缺乏引起HCY，從而引起唇腭裂，包括唇裂（俗稱(chēng)：兔唇）和腭裂（俗稱(chēng)：狼 咽）。這種疾病與參與葉酸代謝的基因有很大關(guān)系，如果一個(gè)嬰兒的哥哥或姐姐也有這種先 天缺陷，那這個(gè)嬰兒便比其他嬰兒多30至40倍的可能出現(xiàn)這種缺陷。
[0008] 高同型半胱氨酸血癥與妊高征關(guān)系密切，可導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷，并可能是妊 高征的發(fā)病因素之一。Hcy的輕中度升高可導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞的抗凝功能下降，可以使內(nèi)皮細(xì) 胞合成減少，影響前列環(huán)素（PGI2)的合成，而PGI2有抑制血小板的粘附和聚集，增強(qiáng)血 管擴(kuò)張的作用。
[0009] 孕婦體內(nèi)葉酸缺乏是造成早產(chǎn)或流產(chǎn)的重要原因之一。葉酸缺乏引起的流產(chǎn)或早 產(chǎn)，采用其它任何補(bǔ)救措施都難以避免。
[0010] 大量的科學(xué)研宄表明，葉酸攝入絕對(duì)或相對(duì)的缺乏，是引起高同型半胱氨酸血癥 的直接原因。引起葉酸缺乏的主要原因，遺傳因素：機(jī)體葉酸利用能力的先天性不足，引起 葉酸缺乏；攝入不足：膳食中葉酸不足或烹調(diào)加工損失；需要量增加：孕婦、乳母都處于特 殊的生理狀態(tài)，葉酸需要量增加，造成相對(duì)不足；其它不良因素：酗酒、服用某些藥物（如抗 驚厥類(lèi)藥物）等均可導(dǎo)致葉酸的缺乏。
[0011] 亞甲基四氫葉酸還原酶（MTHFR)是葉酸代謝的關(guān)鍵酶，催化5, 10-亞甲基四氫葉 酸還原為5-甲基四氫葉酸。人類(lèi)MTHFR基因位于染色體1ρ36. 3,其中有多個(gè)與MTHFR活性 相關(guān)的 SNP 位點(diǎn)，例如 G1965A、A1515C、C894T、以及 677C 和 1298A 等。
[0012] MTHFR第1298位堿基A>C突變（rsl801131)，導(dǎo)致谷氨酰胺被丙氨酸取代，產(chǎn)生產(chǎn) 生了三種基因型：野生型（A/A)，雜合突變型（A/C)和純合突變型（C/C)，引起MTHFR活性 下降，高半胱氨酸轉(zhuǎn)化為蛋氨酸的能力下降，導(dǎo)致血漿中半胱氨酸（Hcy)升高。其中野生 型，雜合突變型和純合突變型三種基因型在中國(guó)人群中分布所占比例為66. 8%，29. 3%和 3. 9%〇
[0013] MTHFR第677位堿基OT突變（rsl801133)，導(dǎo)致編碼MTHFR蛋白葉酸結(jié)合區(qū)域 222位的丙氨酸被纈氨酸取代，產(chǎn)生了三種基因型：野生型（C/C)，雜合突變型（C/T)和純合 突變型（T/T)，導(dǎo)致MTHFR酶活性降低，同型半胱氨酸在體內(nèi)積累。其中野生型，雜合突變型 和純合突變型三種基因型在中國(guó)人群中分布所占比例為33%，44%和23%。
[0014] 甲硫氨酸合成酶還原酶（MTRR)能夠通過(guò)還原型甲基化作用重新生成具有功能活 性的甲硫氨酸合酶，是葉酸代謝的關(guān)鍵酶之一。主要突變型有十余種，其中A2756G在西 方人群中較為常見(jiàn)，另外還有122M(A66G)、S175L、其它一些片段插入缺失和點(diǎn)突變，其中 A66G是最主要和研宄最多的突變。
[0015] MTRR基因第66位堿基A>G突變（rsl801394)，在氨基酸鏈殘基22處蛋氨酸被異亮 氨酸替代，可引起MTRR酶的活性降低，易導(dǎo)致同型半胱氨酸血癥、神經(jīng)管缺陷等疾病。上述 基因位點(diǎn)變異，會(huì)顯著影響機(jī)體的葉酸利用能力，進(jìn)而引起孕婦發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)和嬰兒出生缺陷。 其中野生型（A/A)，雜合突變型（A/G)和純合突變型（G/G)三種基因型在中國(guó)人群中分布所 占比例為58%，36%和6%。
[0016] 機(jī)體葉酸利用能力的先天性不足，引起葉酸缺乏時(shí)，需要對(duì)補(bǔ)充適當(dāng)?shù)娜~酸，以維 持機(jī)體機(jī)內(nèi)正常的生物代謝。我國(guó)推薦孕期補(bǔ)充量為400微克/天，可以將顯著降低患兒 的出生缺陷，如能夠降低NTDs(41% -85% )，但是還有15% -59%卻效果不明顯，通過(guò)增加 合適劑量的葉酸可以進(jìn)一步降低NTDs。個(gè)性化補(bǔ)充葉酸，即讓補(bǔ)充葉酸更具有針對(duì)性。專(zhuān) 家建議：根據(jù)自己的遺傳體質(zhì)，在正確的時(shí)間補(bǔ)充合適劑量的葉酸。
[0017] 對(duì)MTHFR基因、MTRR基因及其相關(guān)位點(diǎn)的檢測(cè)，可以直接發(fā)現(xiàn)被檢測(cè)者葉酸代謝 方面的遺傳缺陷（即葉酸的利用能力），從而根據(jù)風(fēng)險(xiǎn)高低（相關(guān)代謝酶的活性程度）。如 由發(fā)明人和中國(guó)疾病預(yù)防控制中心婦幼保健中心聯(lián)合組織的孕期葉酸利用能力檢測(cè)所提 供的增補(bǔ)參考量：
[0018] 表1 :孕期葉酸利用能力檢測(cè)所提供的增補(bǔ)參考量表
[0020] 以上補(bǔ)充劑量指合成葉酸補(bǔ)充劑或強(qiáng)化劑的攝入量，不包括食物；對(duì)所有成年人 包括孕婦和乳母，合成葉酸制劑的可耐受的最高攝入量（UL)設(shè)定為1000微克/天。因此 800微克/天的葉酸制劑是安全的。
[0021] 對(duì)葉酸的增補(bǔ)劑量并非越多越好。大量研宄發(fā)現(xiàn)，過(guò)量補(bǔ)充葉酸會(huì)導(dǎo)致以下不良 后果：導(dǎo)致體內(nèi)鋅缺乏。鋅是多種酶的活化劑，因此，孕母過(guò)量補(bǔ)充會(huì)導(dǎo)致胎兒生長(zhǎng)緩慢，出 生體重過(guò)低。
[0022] 利用現(xiàn)代基因分型技術(shù)（熒光PCR，Sanger測(cè)序等）檢測(cè)孕婦的葉酸代謝相關(guān)基 因，根據(jù)基因分型結(jié)果對(duì)受檢者葉酸利用能力進(jìn)行分級(jí)，進(jìn)而針對(duì)性的調(diào)整葉酸補(bǔ)充劑量。 目前常用的檢測(cè)技術(shù)中，測(cè)序需對(duì)多個(gè)位點(diǎn)逐一進(jìn)行檢測(cè)，操作復(fù)雜，費(fèi)用較高。芯片法雖 可檢測(cè)多個(gè)位點(diǎn)，但操作過(guò)程繁瑣，檢測(cè)費(fèi)用高。
[0023] 中國(guó)實(shí)用新型專(zhuān)利ZL 201420084983和發(fā)明專(zhuān)利ZL201410067910、名稱(chēng)"單管聯(lián) 合測(cè)定乙醛脫氫酶2基因與亞甲基四氫葉酸還原酶基因突變位點(diǎn)的試劑盒及檢測(cè)方法"公 開(kāi)一種利用多重PCR技術(shù)檢測(cè)亞甲基四氫葉酸還原酶基因突變位點(diǎn)的方法，該方法能夠準(zhǔn) 確測(cè)定MTHFR的C677T突變位點(diǎn)，從而有利于預(yù)測(cè)個(gè)體對(duì)葉酸的代謝能力，指導(dǎo)孕產(chǎn)婦和兒 童補(bǔ)充適合劑量的葉酸補(bǔ)充劑等。但該技術(shù)只能檢測(cè)單一突變位點(diǎn)，且仍然存在傳統(tǒng)PCR 擴(kuò)增檢測(cè)技術(shù)的缺陷。
[0024] 在應(yīng)用檢測(cè)MTHFR基因和/或MTRR基因的突變位點(diǎn)的新技術(shù)來(lái)中，質(zhì)譜技術(shù)顯示 出其準(zhǔn)確、高效的優(yōu)勢(shì)。其中，張孝平等（胰腺癌細(xì)胞DPYD、MTHFR基因單核苷酸多態(tài)性分 析，《山東醫(yī)藥》2011年第45期；胃癌細(xì)胞DPYD、MTHFR基因單核苷酸多態(tài)性的檢測(cè)，《江蘇 醫(yī)藥》2011年第17期）和陳寶安等（應(yīng)用質(zhì)譜技術(shù)檢測(cè)結(jié)腸癌DPYD、MTHFR基因單核苷酸 多態(tài)性，《癌變?畸變?突變》第24卷第2期）公開(kāi)了利用MALDI-T0F質(zhì)譜技術(shù)檢測(cè)MTHFR 基因的三個(gè) SNPs 位點(diǎn) G1965A(rs2274976)、A1515C(rsl801131)及 C894T(rsl801133)，結(jié) 果發(fā)現(xiàn)該位點(diǎn)突變可能導(dǎo)致MTHFR活性改變，影響氟尿嘧啶類(lèi)藥物的體內(nèi)代謝，且與氟尿 嘧啶類(lèi)藥物的療效及毒副反應(yīng)相關(guān)。然而，以上技術(shù)均是聯(lián)合檢測(cè)DPYD基因（二氫嘧啶脫 氫酶基因）和MTHFR基因的突變，通過(guò)預(yù)測(cè)臨床預(yù)測(cè)氟嘧啶類(lèi)藥物的療效及毒副反應(yīng)，使腫 瘤患者在選用最佳藥物方案、劑量及最大限度地降低藥物毒副反應(yīng)方面受益。因此，研宄人 員根據(jù)上述技術(shù)的教導(dǎo)，易于想到通過(guò)質(zhì)譜技術(shù)檢測(cè)MTHFR的上述三個(gè)位點(diǎn)來(lái)確定腫瘤患 者的最佳用藥方案，而難以想到對(duì)該三個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行調(diào)整改變，以及難以想到用于指導(dǎo)葉酸 服用人群進(jìn)行合理攝入葉酸的用途。
[0025] 綜合所述，目前存在的技術(shù)問(wèn)題是：缺乏一次能同時(shí)檢測(cè)多個(gè)葉酸相關(guān)的基因多 態(tài)位點(diǎn)的方法和產(chǎn)品，常見(jiàn)的檢測(cè)技術(shù)，如測(cè)序、實(shí)時(shí)熒光定量PCR等，均需對(duì)位點(diǎn)逐一進(jìn) 行檢測(cè)，當(dāng)位點(diǎn)較多時(shí)操