本公開涉及光激化學發(fā)光，具體涉及一種免疫檢測試劑盒及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、化學發(fā)光免疫分析是目前世界公認的先進的體外免疫診斷技術(shù)，廣泛應(yīng)用于醫(yī)療診斷領(lǐng)域，其中酶促化學發(fā)光、直接化學發(fā)光、電化學發(fā)光是主流化學發(fā)光技術(shù)。

2、鉤狀效應(yīng)(hook效應(yīng))是指免疫檢測中采用雙抗體夾心法時，在一定濃度范圍內(nèi)，分析物濃度與檢測信號呈正比，但超出某一界定濃度后，信號值反而下降的現(xiàn)象。發(fā)生hook效應(yīng)時，化學發(fā)光儀一般沒有數(shù)據(jù)報警，除了結(jié)合臨床信息進行研判和對比稀釋后結(jié)果外，并不能輕易察覺，如果不加以甄別處理，假性低值的報告會嚴重誤導(dǎo)臨床診斷。

3、在化學發(fā)光免疫分析中，傳統(tǒng)檢測方法的檢測范圍有限，常用解決方法是采用合適的稀釋方法，對存疑樣本進行稀釋，但稀釋操作較為費時費力，且偶有發(fā)生不能一次稀釋達到符合檢測要求的情況。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、為了解決上述至少一個問題，本公開提供了一種免疫檢測試劑盒及其應(yīng)用。

2、根據(jù)本公開的第一方面，提供了一種免疫檢測試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括：

3、第一抗體/抗原包被的發(fā)光/感光微球；

4、配體修飾的第二抗體/抗原；

5、受體修飾的感光/發(fā)光微球a；和

6、第三抗體/抗原包被的感光/發(fā)光微球b。

7、在一些實施方式中，所述發(fā)光微球a和所述發(fā)光微球b包含相同的鑭系元素金屬以使其能夠發(fā)出相同波長的信號。

8、在一些實施方式中，所述鑭系元素選自鑭、鈰、鐠、釹、钷、釤、銪、釓、鋱、鏑、鈥、鉺、銩、鐿和镥。

9、在一些實施方式中，所述配體和所述受體互相特異性結(jié)合。

10、在一些實施方式中，所述配體和所述受體包括以下任一項的組合：抗原或其片段/抗體、納米金/碘乙酰-巰基、氨基-醛基/羧基/異硫氰基、硅烷基/丙烯酰胺、親和素或鏈霉親和素/生物素或生物素類似物、抗體/抗抗體、半抗原/抗體、肽段標簽/抗標簽抗體、可基因編碼的多肽/蛋白質(zhì)反應(yīng)對。

11、根據(jù)本公開的第二方面，提供了一種免疫測定方法，其特征在于，所述方法包括如下步驟：

12、1)對含待測目標抗原/抗體的待測樣本進行免疫反應(yīng)；

13、2)加入受體修飾的感光/發(fā)光微球a，形成第一發(fā)光復(fù)合物m，經(jīng)激光照射，檢測所述第一發(fā)光復(fù)合物m的發(fā)光信號rlu1；

14、3)判定發(fā)光信號rlu1≤第一閾值，則終止反應(yīng)；

15、判定發(fā)光信號rlu1＞第一閾值，則加入第三抗體/抗原包被的感光/發(fā)光微球b，形成第二發(fā)光復(fù)合物n，經(jīng)激光照射，檢測所述第二發(fā)光復(fù)合物n的發(fā)光信號rlu2；

16、4)基于發(fā)光信號rlu1或發(fā)光信號rlu2，計算所述待測樣本中的待測目標抗原/抗體的濃度。

17、在一些實施方式中，所述發(fā)光信號rlu1與所述發(fā)光信號rlu2的檢測波長相同。

18、在一些實施方式中，步驟1)包括：添加第一抗體/抗原包被的發(fā)光/感光微球和配體修飾的第二抗體/抗原，以與目標抗原/抗體形成第一夾心復(fù)合物和第一復(fù)合物；

19、其中，所述第一夾心復(fù)合物含有所述第一抗體/抗原包被的發(fā)光/感光微球、所述目標抗原/抗體和配體修飾的第二抗體/抗原，所述第一復(fù)合物含有包被有所述第一抗體/抗原包被的發(fā)光/感光微球和所述目標抗原/抗體。

20、在一些實施方式中，所述配體/受體包括抗原或抗原片段與抗體的組合、納米金/碘乙酰(iodacetyl)-巰基、氨基-醛基/羧基/異硫氰基、硅烷基-丙烯酰胺或鏈霉親和素與生物素的組合。

21、在一些實施方式中，所述配體/受體包括鏈霉親和素和生物素的組合。

22、在一些實施方式中，所述受體修飾的感光/發(fā)光微球a與所述第一夾心復(fù)合物結(jié)合形成第一發(fā)光復(fù)合物m。

23、在一些實施方式中，所述第三抗體/抗原包被的感光/發(fā)光微球b和所述第一復(fù)合物形成第二發(fā)光復(fù)合物n。

24、在一些實施方式中，所述第一抗體/抗原和所述第二抗體/抗原分別與目標抗原/抗體上的不同位點結(jié)合。

25、在一些實施方式中，所述第一抗體/抗原和所述第三抗體/抗原分別與目標抗原/抗體上的不同位點結(jié)合。

26、在一些實施方式中，所述第二抗體/抗原和所述第三抗體/抗原分別與所述目標抗原/抗體上的相同位點結(jié)合。

27、在一些實施方式中，步驟4)還包括以下步驟：

28、當判定發(fā)光信號rlu1≤第一閾值，終止反應(yīng)后，將所述發(fā)光信號rlu1代入第一定標曲線計算所述待測目標抗原/抗體的濃度；

29、判定第二閾值≤rlu2≤第三閾值時，基于發(fā)光信號rlu1和發(fā)光信號rlu2，計算發(fā)光信號rlu3，將rlu3代入第二定標曲線計算所述待測目標抗原/抗體的濃度，其中所述rlu3＝rlu2－k×rlu1，k為rlu1的信號衰減系數(shù)；

30、判定rlu2＞第三閾值時，報告所述待測目標抗原/抗體的濃度超出檢測范圍。

31、在一些實施方式中，所述定標曲線的建立包括以下步驟：

32、s1)對標準品進行免疫反應(yīng)，其中所述標準品包括多個經(jīng)梯度稀釋的目標抗原/抗體；

33、s2)加入所述受體修飾的感光/發(fā)光微球a，形成第一發(fā)光復(fù)合物m'，經(jīng)激光照射，檢測所述第一發(fā)光復(fù)合物m'的發(fā)光信號rlu1'；

34、s3)加入所述第三抗體/抗原包被的感光/發(fā)光微球b，形成第二發(fā)光復(fù)合物n'，經(jīng)激光照射，檢測所述第二發(fā)光復(fù)合物n'的發(fā)光信號rlu2'；

35、s4)計算發(fā)光信號rlu1'與對應(yīng)的標準品中的目標抗原/抗體濃度的皮爾遜相關(guān)性系數(shù)，將皮爾遜相關(guān)系數(shù)≥0.99的n個發(fā)光信號rlu1'及其對應(yīng)的標準品中的n個目標抗原/抗體濃度進行線性擬合，得到第一定標曲線；

36、s5)計算發(fā)光信號rlu1'的衰減系數(shù)k；

37、s6)基于衰減系數(shù)k，計算發(fā)光信號rlu3’，其中rlu3'＝rlu2'－k×rlu1'；

38、s7)計算發(fā)光信號rlu3'與對應(yīng)的標準品中的目標抗原/抗體濃度的皮爾遜相關(guān)性系數(shù)，將皮爾遜相關(guān)系數(shù)≥0.99的m個發(fā)光信號rlu3'及其對應(yīng)的標準品中的m個目標抗原/抗體濃度進行線性擬合，得到第二定標曲線。

39、在一些實施方式中，所述第一定標曲線對應(yīng)公式1，所述公式1如下：

40、公式1：rlu1＝a1×目標抗原/抗體的濃度+b1。

41、在一些實施方式中，所述第二定標曲線對應(yīng)公式2，所述公式2如下：

42、公式2：rlu3＝a2×目標抗原/抗體的濃度+b2。

43、在一些實施方式中，所述發(fā)光信號rlu1'與所述發(fā)光信號rlu2'的檢測波長相同。

44、在一些實施方式中，所述衰減系數(shù)k為n個衰減系數(shù)kn的平均值，所述第n個衰減系數(shù)kn通過所述第n個發(fā)光信號rlu1'和對應(yīng)濃度的第n個發(fā)光信號rlu2'計算。

45、在一些實施方式中，將所述n個發(fā)光信號rlu1'中的最高數(shù)值乘以預(yù)設(shè)倍數(shù)，確定為第一閾值；將所述m個發(fā)光信號rlu3'中的最低數(shù)值乘以預(yù)設(shè)倍數(shù)，確定為第二閾值；將所述m個發(fā)光信號rlu3'中的最高數(shù)值乘以預(yù)設(shè)倍數(shù)，確定為第三閾值。

46、在一些實施方式中，所述預(yù)設(shè)倍數(shù)選自1.0～1.5。

47、在一些實施方式中，所述預(yù)設(shè)倍數(shù)選自1.0、1.01、1.02、1.03、1.04、1.05、1.06、1.07、1.08、1.09、1.1、1.11、1.12、1.13、1.14、1.15、1.16、1.17、1.18、1.19、1.2、1.21、1.22、1.23、1.24、1.25、1.26、1.27、1.28、1.29、1.3、1.31、1.32、1.33、1.34、1.35、1.36、1.37、1.38、1.39、1.4、1.41、1.42、1.43、1.44、1.45、1.46、1.47、1.48、1.49或1.5。

48、在一些實施方式中，所述免疫測定為光激化學發(fā)光檢測。

49、在一些實施方式中，所述發(fā)光微球包含鑭系元素金屬。

50、在一些實施方式中，所述鑭系元素金屬選自鑭、鈰、鐠、釹、钷、釤、銪、釓、鋱、鏑、鈥、鉺、銩、鐿、镥中的至少一種。

51、在一些實施方式中，所述待測樣本選自血液、血漿、血清、尿液、精液、唾液、細胞培養(yǎng)物、組織樣本中的一種或多種。

52、根據(jù)本公開的第三方面，提供了一種免疫測定系統(tǒng)，所述系統(tǒng)用于實現(xiàn)第二方面所述的方法，所述系統(tǒng)包括：

53、免疫反應(yīng)元件，用于與待測目標抗原/抗體形成第一發(fā)光復(fù)合物m/m'和第二發(fā)光復(fù)合物n/n'；

54、獲取信號元件，用于激發(fā)和記錄信號值，

55、處理器，用于計算并獲得信號值對應(yīng)的待測目標抗原/抗體在待測樣本中的濃度。

56、根據(jù)本公開的第四方面，提供了第一方面所述試劑盒、第二方面所述方法、或第三方面所述系統(tǒng)在檢測目標抗原/抗體中的應(yīng)用。

57、在一些實施方式中，所述目標抗原/抗體包括疾病標志物。

58、在一些實施方式中，所述疾病標志物包括腫瘤標志物、心肌標志物、甲功標志物、性激素標志物、傳染病標志物、炎癥標志物等。

59、在一些實施方式中，所述腫瘤標志物包括糖類抗原。

60、在一些實施方式中，所述腫瘤標志物包括ca19-9抗原、ca15-3抗原、ca72-4抗原等。

61、本公開所述檢測方法，因待測樣本不需進行稀釋操作而更加省時省力；與傳統(tǒng)方法的直接檢測相比，提升檢測范圍，可實現(xiàn)改善hook效應(yīng)的目標。