本發(fā)明屬于抗性淀粉檢測，具體涉及一種大米抗性淀粉檢測方法。
背景技術(shù)：
1、抗性淀粉是指在正常人體腸道內(nèi)無法被消化的淀粉類物質(zhì)?？剐缘矸劬哂薪笛恰⒏纳埔葝u素敏感性、防止便秘、結(jié)腸癌、降血脂、降脂減肥、改善礦物質(zhì)吸收等作用。大米作為主食，增加大米里抗性淀粉含量，對居民營養(yǎng)膳食結(jié)構(gòu)的改善至關(guān)重要。因此水稻抗性淀粉的遺傳生理、高抗性淀粉水稻品種的選育成為了研究熱點。這些研究的基礎(chǔ)就是抗性淀粉的準確、高效檢測?？剐缘矸酆康臏y定有berry法（1986）、bjorck法（1987）、champ法（1992）、englyst法（1992）、goni法（1996）和aoac法（2002），其中改進的goni法和aoac法是最常使用的方法。goni法，首先采用胃蛋白酶去蛋白質(zhì)，然后用α-淀粉酶（37℃）水解16h，乙醇洗去非抗性淀粉分解形成的糖類，用2mol/l?koh水解抗性淀粉，隨后糖化酶60℃下催化反應30min，水解抗性淀粉成葡萄糖，再用god-pod方法進行葡萄糖含量檢測，換算得到抗性淀粉含量。該方法能很好地模擬消化道的生理環(huán)境，既能檢測高抗性淀粉，又能檢測抗性淀粉在1%以下的食品，重復性好。但該方法操作繁瑣、耗時長、試劑種類繁多，且需要使用毒性很大的疊氮化鈉（nan3）。因此有人基于goni法進行改進，提出了改進的goni法，其中最大的改變是在分解非抗性淀粉時采用α-淀粉酶和糖化酶混合酶液（ph=6），但分解時間依然是16h，抗性淀粉分解時，加入koh后采用冰浴，防止淀粉糊化，糖化酶催化溫度由60℃調(diào)整為50℃。mccleary等人于2002年在goni法的基礎(chǔ)上提出aoac法，又稱mccleary法，也是商業(yè)化的megazyme抗性淀粉試劑盒采用的方法。其最大的不同是刪除了胃蛋白酶去除蛋白的這一步驟，在分解非抗性淀粉時采用α-淀粉酶和糖化酶混合酶液（ph=6），但分解時間依然是16h?？剐缘矸鄯纸鈺r，加入koh后采用冰浴，防止淀粉糊化，糖化酶催化溫度由60℃調(diào)整為50℃。改進的goni法和aoac法的方法較為可靠，重復性好，目前已經(jīng)被美國分析化學學會（analysis?chemistry?of?analytical?chemistry?of?analytical?chemistry?ofchemist?ry）用于檢測食品中抗性淀粉含量，并被我國行業(yè)標準《稻米及制品中抗性淀粉的測定-分光光度法》所采用。但現(xiàn)有方法存在測定時間長、所涉及試劑多而復雜、非抗性淀粉分解時間過長導致淀粉發(fā)酵影響測定、樣品前處理方式模糊等問題。
2、為解決aoac法中降解非抗性淀粉時間過長（在37℃搖床孵育16h），淀粉水解液出現(xiàn)不同程度的發(fā)酵的問題，現(xiàn)有技術(shù)提出添加多種抗生素復配劑抑制細菌生長，避免細菌發(fā)酵分解抗性淀粉，以保障測定結(jié)果的準確性。但其提出的抗生素復配劑含有種類繁多的抗生素，較為復雜，不利于大規(guī)模的檢測實驗。
技術(shù)實現(xiàn)思路
1、針對上述現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明提供一種大米抗性淀粉檢測方法，解決現(xiàn)有技術(shù)中測定時間長、所需試劑多且復雜、非抗性淀粉分解時間過長導致淀粉發(fā)酵影響測定、樣品前處理方式模糊等問題，準確反映出大米在蒸煮食用狀態(tài)下的抗性淀粉含量。
2、為了達到上述目的，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是：提供一種大米抗性淀粉檢測方法，包括以下步驟：
3、（1）將大米研磨成米粉，然后對其進行脫脂處理，得脫脂米粉；
4、（2）將脫脂米粉加水蒸熟，得熟化米粉；
5、（3）向熟化米粉中加入含α-淀粉酶和糖化酶的混合酶緩沖液，在37℃條件下處理4~6h，加入乙醇溶液終止反應，再離心獲得沉淀；混合酶緩沖液中α-淀粉酶和糖化酶的濃度分別為40~60u/ml和80~100u/ml，混合酶緩沖液的ph為4.5~5.5；
6、（4）向沉淀中加入堿液，在37℃條件下處理30~60min；
7、（5）加入ph為4.5~5、糖化酶含量為1000~2625u/ml的糖化酶緩沖液，在60~65℃條件下處理1~2h；
8、（6）離心后取上清液，用dns法檢測上清液中葡萄糖的含量，計算得抗性淀粉的含量。
9、在上述技術(shù)方案的基礎(chǔ)上，本發(fā)明還可以做如下改進。
10、進一步，米粉的粒徑為0.38~1mm；步驟（1）中脫脂處理為用沸程為30~60℃的石油醚或體積分數(shù)為85%的甲醇溶液回流抽提4~6h，回流抽提的速度為5~6滴/s，回流抽提后在40℃條件下干燥1天。
11、進一步，步驟（2）中脫脂米粉與水的料液比為1g:10~20ml，蒸制時間為20min。
12、進一步，步驟（3）中加入混合酶緩沖液的處理時間為6h；混合酶緩沖液由α-淀粉酶、糖化酶、cacl2和濃度為2m的hac-naac緩沖液配制而成，混合酶緩沖液中α-淀粉酶、糖化酶和cacl2的濃度分別為40u/ml、80u/ml和0.032μmol/ml；混合酶緩沖液的ph為4.75。
13、進一步，步驟（4）中堿液為濃度為2m的koh溶液，處理時間為30min。
14、進一步，步驟（5）中糖化酶緩沖液的ph為4.75，糖化酶緩沖液中糖化酶的含量為2625u/ml；處理溫度為60℃，處理時間為1h。
15、進一步，糖化酶緩沖液由糖化酶與濃度為2m的hac-naac緩沖液配制而成，并在4℃條件下用濃度為2m的hac-naac緩沖液透析12h。
16、本發(fā)明的有益效果是：與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明中的檢測方法，試劑更加常規(guī)、簡單，檢測成本遠低于megazyme抗性淀粉試劑盒。根據(jù)大米及米粉均蒸煮糊化食用的飲食特點，本發(fā)明通過明確脫脂、料液比、熟化等前處理方法，更加準確的反應大米中抗性淀粉含量（米飯、熟米粉抗性淀粉類型），標準化的前處理有利于大量育種材料篩選，或大量處理比較試驗中的準確檢測。脫脂處理去除大米中的脂肪成分，排除脂肪對抗性淀粉檢測的干擾；脫脂后，抗性淀粉的檢測值會更高。熟化處理從實驗角度模擬蒸煮過程，因為大米都是蒸煮后食用，抗性淀粉的定義也是食用后不能被消化的淀粉。脫脂和熟化處理使檢測值更貼合抗性淀粉的定義。同時探索非抗性淀粉降解采用的混合酶液最適濃度和ph值，將其分解過程由16h減少至4~6h，有效避免非抗性淀粉降解過程的長時間孵育導致細菌發(fā)酵使檢測結(jié)果不準確的問題。同時將糖化酶溶液通過透析技術(shù)，去除糖化酶試劑生產(chǎn)過程中所帶有的糖分，避免背景糖含量過高影響測定，糖化酶緩沖液ph調(diào)整至4.75，提高催化效率。通過這些關(guān)鍵步驟的優(yōu)化，抗性淀粉檢測誤差顯著降低。由于經(jīng)過前面分解過程，沉淀多次沖洗，樣品中成分相對簡單，因此將葡萄糖的檢測方法由god-pod方法換成dns法，試劑更簡單，操作性更強。
1.一種大米抗性淀粉檢測方法，其特征在于，包括以下步驟：
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的大米抗性淀粉檢測方法，其特征在于：所述米粉的粒徑為0.38~1mm；所述步驟（1）中脫脂處理為用沸程為30~60℃的石油醚或體積分數(shù)為85%的甲醇溶液回流抽提4~6h，回流抽提的速度為5~6滴/s，回流抽提后在40℃條件下干燥1天。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的大米抗性淀粉檢測方法，其特征在于：所述步驟（2）中脫脂米粉與水的料液比為1g:10~20ml，蒸制時間為20min。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的大米抗性淀粉檢測方法，其特征在于：所述步驟（3）中加入混合酶緩沖液的處理時間為6h；所述混合酶緩沖液由α-淀粉酶、糖化酶、cacl2和濃度為2m的hac-naac緩沖液配制而成，所述混合酶緩沖液中α-淀粉酶、糖化酶和cacl2的濃度分別為40u/ml、80u/ml和0.032μmol/ml；所述混合酶緩沖液的ph為4.75。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的大米抗性淀粉檢測方法，其特征在于：所述步驟（4）中堿液為濃度為2m的koh溶液，處理時間為30min。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的大米抗性淀粉檢測方法，其特征在于：所述步驟（5）中糖化酶緩沖液的ph為4.75，所述糖化酶緩沖液中糖化酶的含量為2625u/ml；處理溫度為60℃，處理時間為1h。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的大米抗性淀粉檢測方法，其特征在于：所述糖化酶緩沖液由糖化酶與濃度為2m的hac-naac緩沖液配制而成，并在4℃條件下用濃度為2m的hac-naac緩沖液透析12h。