本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥領(lǐng)域，更具體地，涉及一種基于真菌甘露聚糖的訓(xùn)練免疫誘導(dǎo)劑及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、腫瘤微環(huán)境和腫瘤細(xì)胞之間的相互作用在腫瘤的發(fā)生、進(jìn)展、轉(zhuǎn)移和對(duì)治療的反應(yīng)中起著決定性的作用。靶向微環(huán)境中的腫瘤浸潤(rùn)t細(xì)胞的免疫治療策略，已被廣泛的研究并應(yīng)用于臨床。而腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞大量存在于多種微環(huán)境中的，并幫助癌細(xì)胞免疫逃逸，促進(jìn)血管生成轉(zhuǎn)換，加速腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移。鑒于腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞的免疫抑制功能，多種阻斷細(xì)胞趨化的藥物已進(jìn)入臨床實(shí)驗(yàn)階段，但妨礙正常巨噬細(xì)胞遷移功能造成的副作用也一直是這類藥物的通病。因此，激活訓(xùn)練免疫機(jī)制從而改變腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞活性的手段已被臨床前研究證明有效，并有潛力成為新的治療策略。

2、訓(xùn)練免疫，先天免疫細(xì)胞在經(jīng)歷病原體刺激后獲得“免疫記憶”的過程。訓(xùn)練免疫使得先天免疫細(xì)胞在外源性或內(nèi)源性刺激物誘導(dǎo)下的長(zhǎng)期功能重編程，在恢復(fù)到非活性狀態(tài)后，經(jīng)再次刺激后產(chǎn)生的效應(yīng)因子功能增強(qiáng)，機(jī)體能夠更快速、高效地產(chǎn)生免疫應(yīng)答。因此，訓(xùn)練免疫誘導(dǎo)劑可將腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞的免疫抑制活性轉(zhuǎn)變?yōu)榭鼓[瘤狀態(tài)，并促進(jìn)抗原特異性適應(yīng)性免疫的建立和維持，進(jìn)而減少腫瘤進(jìn)展和控制腫瘤轉(zhuǎn)移。目前，bacillecalmette-gue?rin?(bcg)誘導(dǎo)訓(xùn)練免疫，被廣泛應(yīng)用于非肌層浸潤(rùn)性膀胱癌（nmibc）的護(hù)理治療，但其成分復(fù)雜且個(gè)體差異大。β-1,3-葡聚糖能夠訓(xùn)練肺癌和胰腺癌中的巨噬細(xì)胞，從而控制癌癥肺轉(zhuǎn)移和胰腺癌的發(fā)生，但葡聚糖水溶性較差，且不同組分分子量范圍差別大，活性也有區(qū)別，阻礙其作為藥物應(yīng)用于臨床。

3、因此，開發(fā)更適合成藥的訓(xùn)練免疫誘導(dǎo)物能夠顯著推動(dòng)腫瘤免疫治療領(lǐng)域的進(jìn)展。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、針對(duì)上述問題，本發(fā)明的目的是提供一種基于真菌甘露聚糖的訓(xùn)練免疫誘導(dǎo)劑及其應(yīng)用。

2、本發(fā)明首次報(bào)道了flo8基因缺失白念珠菌生物合成的甘露聚糖（flo8?mutantmannan，fm）可特異性誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞組蛋白h3k79的單甲基化修飾，通過利用fim作為訓(xùn)練免疫誘導(dǎo)劑，可將腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞的免疫抑制狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)閙1型的抗腫瘤狀態(tài)，進(jìn)而加強(qiáng)抗原特異性適應(yīng)性免疫，減少腫瘤進(jìn)展并控制腫瘤轉(zhuǎn)移。

3、在本發(fā)明第一方面，提供了一種活性成分的用途，所述活性成分選自flo8基因缺失型白念珠菌來源的甘露聚糖、或其藥學(xué)上可接受的鹽、或其活性衍生物，并且所述活性成分用于預(yù)防和/或治療腫瘤的藥物或試劑盒；或所述活性成分用于制備一制劑或組合物，所述制劑或組合物用于誘導(dǎo)訓(xùn)練免疫；或所述活性成分用于制備訓(xùn)練免疫誘導(dǎo)劑；或所述活性成分用于制備保健品；或所述活性成分用于制備醫(yī)療器械。

4、在另一優(yōu)選實(shí)施方式中，所述訓(xùn)練免疫誘導(dǎo)劑包括：先天免疫訓(xùn)練劑，非特異性免疫增強(qiáng)劑，先天免疫記憶激活劑，表觀免疫調(diào)節(jié)劑，廣譜免疫調(diào)節(jié)劑或巨噬細(xì)胞記憶誘導(dǎo)劑。

5、在另一優(yōu)選實(shí)施方式中，所述訓(xùn)練免疫為固有免疫細(xì)胞和/或非傳統(tǒng)免疫細(xì)胞再次應(yīng)對(duì)刺激的增強(qiáng)反應(yīng)。

6、在另一優(yōu)選實(shí)施方式中，所述固有免疫細(xì)胞選自單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞和粒細(xì)胞，優(yōu)選巨噬細(xì)胞。

7、在另一優(yōu)選實(shí)施方式中，所述非傳統(tǒng)免疫細(xì)胞選自內(nèi)皮細(xì)胞和表皮細(xì)胞。

8、在另一優(yōu)選實(shí)施方式中，所述藥物還用于以下用途：

9、(y1)促進(jìn)tnf-α表達(dá)上調(diào)；

10、(y2)促進(jìn)cd86表達(dá)上調(diào)；

11、(y3)促進(jìn)inos表達(dá)上調(diào)；

12、(y4)降低arg-1表達(dá)；

13、(y5)促進(jìn)巨噬細(xì)胞組蛋白的h3k79單甲基化修飾（h3k79me1）；

14、(y6)促進(jìn)巨噬細(xì)胞組蛋白的h3k23乙?；揎棧╤3k23ac）；和/或

15、(y7)促進(jìn)巨噬細(xì)胞組蛋白的h3k27乙?；揎棧╤3k27ac）。

16、在另一優(yōu)選實(shí)施方式中，所述藥物還用于以下用途：激活erk信號(hào)通路和/或促進(jìn)糖酵解。

17、在另一優(yōu)選實(shí)施方式中，所述藥物的使用量按照flo8基因缺失型白念珠菌來源的甘露聚糖的濃度計(jì)0.1-100μg/ml，較佳的為1-50μg/ml，更佳的為1-10μg/ml。

18、在另一優(yōu)選實(shí)施方式中，所述藥物的使用量按照flo8基因缺失型白念珠菌來源的甘露聚糖的用量計(jì)為1-1000mg/kg/天，較佳地為20-500mg/kg/天，更佳地為25-200mg/kg/天。

19、在另一優(yōu)選實(shí)施方式中，所述腫瘤包括：肺癌、膀胱癌、肝癌,胃癌，結(jié)腸癌，黑色素瘤，乳腺癌；

20、所述醫(yī)療器械包括但不限于：醫(yī)學(xué)敷料；

21、所述保健品包括但不限于：口服類保健品、功能導(dǎo)向類保健品和具有特殊形態(tài)的保健品；

22、所述醫(yī)學(xué)敷料包括但不限于：創(chuàng)可貼、慢性創(chuàng)面敷料；

23、所述口服類保健品的劑型包括但不限于：片劑、膠囊、口服液，粉劑或顆粒劑；

24、所述功能導(dǎo)向類保健品包括但不限于：增強(qiáng)免疫力的保健品；

25、所述具有些特殊形態(tài)保健品包括但不限于：保健飲料和保健糖果。

26、在另一優(yōu)選實(shí)施方式中，所述腫瘤不包括結(jié)腸癌。

27、在另一優(yōu)選實(shí)施方式中，所述衍生物包括前藥。

28、在另一優(yōu)選實(shí)施方式中，所述藥物被施用于選自下組的對(duì)象：嚙齒動(dòng)物或靈長(zhǎng)動(dòng)物(人或非人靈長(zhǎng)動(dòng)物)。

29、在另一優(yōu)選實(shí)施方式中，所述的對(duì)象具有選自下組的一個(gè)或多個(gè)特征：

30、(y1)所述對(duì)象的tnfα表達(dá)量偏低；

31、(y2)所述對(duì)象的cd86表達(dá)量偏低；

32、(y3)所述對(duì)象的inos表達(dá)量偏低；

33、(y4)所述對(duì)象的arg-1表達(dá)量偏高；

34、(y5)所述對(duì)象的巨噬細(xì)胞組蛋白的h3k79單甲基化修飾（h3k79me1）水平偏低；

35、(y6)所述對(duì)象的巨噬細(xì)胞組蛋白的h3k23乙酰化修飾（h3k23ac）水平偏低；和/或

36、(y7)所述對(duì)象的巨噬細(xì)胞組蛋白的h3k27乙?；揎棧╤3k27ac）水平偏低。

37、在另一優(yōu)選實(shí)施方式中，所述的偏低指表達(dá)量或甲基化或乙?；揎椝斤@著低于基準(zhǔn)值；所述的偏高指表達(dá)量顯著高于基準(zhǔn)值。

38、在另一優(yōu)選實(shí)施方式中，所述的基準(zhǔn)值為正常受試者(未患有腫瘤的受試者)中相應(yīng)基因的表達(dá)量或甲基化或乙?；揎椝健?/p>

39、在另一優(yōu)選實(shí)施方式中，所述的顯著低于指表達(dá)量≤2/3基準(zhǔn)值，較佳地≤1/2基準(zhǔn)值，更佳地≤1/3基準(zhǔn)值。

40、在另一優(yōu)選實(shí)施方式中，所述的顯著高于指表達(dá)量≥4/3基準(zhǔn)值，較佳地≥3/2基準(zhǔn)值，更佳地≥2倍基準(zhǔn)值。

41、另一優(yōu)選實(shí)施方式中，所述藥物是在腫瘤患者造模前給予的。

42、另一優(yōu)選實(shí)施方式中，所述藥物包括：

43、(z1)第一活性成分，flo8基因缺失型白念珠菌來源的甘露聚糖、或其藥學(xué)上可接受的鹽、或其衍生物；

44、(z2)任選的，第二活性成分，其他的預(yù)防和/或治療腫瘤的藥物或訓(xùn)練免疫誘導(dǎo)劑；和

45、(z3)藥學(xué)上可接受的載體。

46、另一優(yōu)選實(shí)施方式中，所述的藥物中，所述組分(z1)占所述藥物總重量的1-99wt%，較佳地10-90wt%，更佳地30-70wt%。

47、另一優(yōu)選實(shí)施方式中，所述其他的預(yù)防和/或治療腫瘤的藥物包括（但不限于）：紫杉醇，順鉑，達(dá)卡巴嗪，吉西他濱，氟尿嘧啶，奧沙利鉑，多柔比星，培美曲塞。

48、另一優(yōu)選實(shí)施方式中，所述訓(xùn)練免疫誘導(dǎo)劑包括（但不限于）：β-葡聚糖，野生型白念珠菌來源甘露聚糖（wym），bacille?calmette-gue?rin?(bcg)，氧化低密度脂蛋白，尿酸晶體，琥珀酸鹽，流感病毒疫苗。

49、另一優(yōu)選實(shí)施方式中，所述藥物中可以是單一化合物，也可以是多個(gè)化合物的混合構(gòu)成的藥物組合物。

50、另一優(yōu)選實(shí)施方式中，所述的藥物用于制備預(yù)防和/或治療腫瘤的藥物或制劑。

51、另一優(yōu)選實(shí)施方式中，所述的藥物劑型為口服給藥或非口服給藥劑型。

52、另一優(yōu)選實(shí)施方式中，所述的口服給藥劑型是片劑、散劑、顆粒劑或膠囊劑，或乳劑或糖漿劑。

53、另一優(yōu)選實(shí)施方式中，所述的非口服給藥劑型是注射劑或針劑。

54、另一優(yōu)選實(shí)施方式中，所述的藥物選自下組：注射劑、吸入劑、酊劑、粉劑、顆粒劑、膠囊劑、口服液、片劑、丸劑、懸浮劑、乳劑、含片、或滴丸。

55、另一優(yōu)選實(shí)施方式中，所述藥物的給藥方式為靜脈注射或腹腔內(nèi)注射。

56、另一優(yōu)選實(shí)施方式中，所述藥物施用的對(duì)象為人或非人哺乳動(dòng)物。

57、另一優(yōu)選實(shí)施方式中，所述試劑盒包括：

58、(f1)第一藥物組合物，所述藥物組合物含有(i)作為第一活性成分的flo8基因缺失型白念珠菌來源的甘露聚糖、或其藥學(xué)上可接受的鹽、或其衍生物；和(ii)藥學(xué)上可接受的載體；和

59、(f2)檢測(cè)tnfα水平的試劑。

60、在本發(fā)明第二方面，提供了一種訓(xùn)練免疫誘導(dǎo)劑，所述訓(xùn)練免疫誘導(dǎo)劑包括flo8基因缺失型白念珠菌來源的甘露聚糖、或其藥學(xué)上可接受的鹽、或其衍生物。

61、在本發(fā)明第三方面，提供了一種本發(fā)明第二方面所述的訓(xùn)練免疫誘導(dǎo)劑的用途，用于制備預(yù)防和/或治療腫瘤的藥物；或用于制備保健品；或用于制備醫(yī)療器械。

62、在另一優(yōu)選實(shí)施方式中，所述腫瘤包括：肺癌、膀胱癌、肝癌，胃癌，結(jié)腸癌，黑色素瘤，乳腺癌。

63、在本發(fā)明第四方面，提供了一種預(yù)防和/或治療腫瘤的方法，包括步驟：

64、給需要的對(duì)象，施用安全有效量的flo8基因缺失型白念珠菌來源的甘露聚糖、或其藥學(xué)上可接受的鹽、或其衍生物。

65、另一優(yōu)選實(shí)施方式中，所述施用包括口服、靜脈注射或腹腔內(nèi)注射。

66、另一優(yōu)選實(shí)施方式中，所述的對(duì)象包括人或非人哺乳動(dòng)物。

67、另一優(yōu)選實(shí)施方式中，所述非人哺乳動(dòng)物包括嚙齒動(dòng)物和靈長(zhǎng)目動(dòng)物，優(yōu)選小鼠、大鼠、兔、猴。

68、在本發(fā)明第五方面，提供了一種體外非診斷或治療目的的誘導(dǎo)訓(xùn)練免疫的方法，包括步驟：

69、(a)在flo8基因缺失型白念珠菌來源的甘露聚糖存在下，刺激巨噬細(xì)胞，從而誘導(dǎo)所述巨噬細(xì)胞的訓(xùn)練免疫。

70、另一優(yōu)選實(shí)施方式中，所述flo8基因缺失型白念珠菌來源的甘露聚糖濃度為（10mg-100mg）/107巨噬細(xì)胞；優(yōu)選50mg/107巨噬細(xì)胞。

71、另一優(yōu)選實(shí)施方式中，在步驟(a)中，培養(yǎng)體系中還包括：（a1）在所述刺激巨噬細(xì)胞24~48小時(shí)后，采用腫瘤細(xì)胞分泌的上清對(duì)所述巨噬細(xì)胞進(jìn)行二次刺激，進(jìn)而誘導(dǎo)訓(xùn)練免疫。

72、另一優(yōu)選實(shí)施方式中，所述瘤細(xì)胞分泌的上清與所述培養(yǎng)體系的體積比為1:1~1:5；優(yōu)選1:2~1:4。

73、另一優(yōu)選實(shí)施方式中，所述二次刺激的時(shí)間為5~9天，優(yōu)選7天。

74、另一優(yōu)選實(shí)施方式中，所述腫瘤細(xì)胞包括：mb49、hct116，ht29，sw480，sw620、nci-1299、sw1573、hepg2、huh-7、huh-7.5.1、hgc27和mfc細(xì)胞。

75、在本發(fā)明第六方面，提供了一種調(diào)節(jié)真菌甘露聚糖誘導(dǎo)訓(xùn)練免疫的方法，該方法包括：

76、(f1)?通過調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞組蛋白的h3k79單甲基化修飾（h3k79me1）水平實(shí)現(xiàn)真菌甘露聚糖誘導(dǎo)訓(xùn)練免疫的調(diào)節(jié)；包括：

77、增強(qiáng)巨噬細(xì)胞組蛋白的h3k79單甲基化修飾（h3k79me1）水平以增強(qiáng)真菌甘露聚糖誘導(dǎo)訓(xùn)練免疫并預(yù)防感染和治療腫瘤；或

78、抑制巨噬細(xì)胞組蛋白的h3k79單甲基化修飾（h3k79me1）水平以抑制真菌甘露聚糖誘導(dǎo)訓(xùn)練免疫并抑制炎癥反應(yīng)；其中，所述真菌甘露聚糖為flo8基因缺失型白念珠菌來源的甘露聚糖。

79、另一優(yōu)選實(shí)施方式中，所述增強(qiáng)巨噬細(xì)胞組蛋白的h3k79單甲基化修飾（h3k79me1）水平的方法為直接添加能提高h(yuǎn)3k79單甲基化修飾水平的激動(dòng)劑或提高dot1l活性的激動(dòng)劑。

80、另一優(yōu)選實(shí)施方式中，所述增強(qiáng)真菌甘露聚糖誘導(dǎo)訓(xùn)練免疫的過程中，增強(qiáng)巨噬細(xì)胞組蛋白的h3k79單甲基化修飾（h3k79me1）水平使用的激動(dòng)劑在所述真菌甘露聚接種前使用，或和所述甘露聚糖以相同途徑或不同途徑接種一起使用；

81、所述預(yù)防感染和治療腫瘤的過程中，增強(qiáng)巨噬細(xì)胞組蛋白的h3k79單甲基化修飾（h3k79me1）水平使用的激動(dòng)劑采用腹腔注射、靜脈注射或瘤內(nèi)注射。

82、另一優(yōu)選實(shí)施方式中，所述抑制巨噬細(xì)胞組蛋白的h3k79單甲基化修飾（h3k79me1）水平的方法為直接添加能降低h3k79單甲基化修飾水平的抑制劑或dot1l抑制劑；所述dot1l抑制劑選自pinometostat。

83、另一優(yōu)選實(shí)施方式中，所述通過調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞組蛋白的h3k79單甲基化修飾（h3k79me1）水平實(shí)現(xiàn)真菌甘露聚糖誘導(dǎo)訓(xùn)練免疫的調(diào)節(jié)的方式為直接體內(nèi)注射能提高h(yuǎn)3k79單甲基化修飾水平的激動(dòng)劑或提高dot1l活性的激動(dòng)劑進(jìn)入血液循環(huán)以刺激免疫細(xì)胞；或

84、將免疫細(xì)胞分選出來在體外采用能提高h(yuǎn)3k79單甲基化修飾水平的激動(dòng)劑或提高dot1l活性的激動(dòng)劑刺激免疫細(xì)胞后回輸體內(nèi)。

85、另一優(yōu)選實(shí)施方式中，所述方法還包括：

86、(f2)通過調(diào)節(jié)erk信號(hào)通路或糖酵解實(shí)現(xiàn)真菌甘露聚糖誘導(dǎo)訓(xùn)練免疫的調(diào)節(jié)；包括：

87、增強(qiáng)erk信號(hào)通路或糖酵解以增強(qiáng)真菌甘露聚糖誘導(dǎo)訓(xùn)練免疫并預(yù)防感染和治療腫瘤；或

88、抑制erk信號(hào)通路或糖酵解以抑制真菌甘露聚糖誘導(dǎo)訓(xùn)練免疫并抑制炎癥反應(yīng)；其中，所述真菌甘露聚糖為flo8基因缺失型白念珠菌來源的甘露聚糖。

89、另一優(yōu)選實(shí)施方式中，所述增強(qiáng)erk信號(hào)通路或糖酵解的方法為直接添加能激活erk信號(hào)通路或能夠發(fā)生糖酵解的激動(dòng)劑。

90、另一優(yōu)選實(shí)施方式中，所述增強(qiáng)真菌甘露聚糖誘導(dǎo)訓(xùn)練免疫的過程中，增強(qiáng)erk信號(hào)通路或糖酵解使用的能激活erk信號(hào)通路或能夠發(fā)生糖酵解的激動(dòng)劑在所述真菌甘露聚接種前使用，或和所述甘露聚糖以相同途徑或不同途徑接種一起使用；

91、所述預(yù)防感染和治療腫瘤的過程中，增強(qiáng)erk信號(hào)通路或糖酵解使用的能激活erk信號(hào)通路或能夠發(fā)生糖酵解的激動(dòng)劑采用腹腔注射、靜脈注射或瘤內(nèi)注射。

92、另一優(yōu)選實(shí)施方式中，所述抑制erk信號(hào)通路或糖酵解的方法為直接添加erk抑制劑或糖酵解抑制劑；所述erk抑制劑選自u(píng)0126；所述糖酵解抑制劑選自2-dg。

93、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下技術(shù)效果：

94、(1)?本發(fā)明首次將fm應(yīng)用于惡性腫瘤的免疫治療，開辟了腫瘤治療的新方向。

95、(2)?本發(fā)明研究發(fā)現(xiàn)flo8基因的缺失導(dǎo)致白念珠菌表面甘露聚糖的糖苷鍵連接方式及聚合程度發(fā)生顯著改變，從而賦予fm獨(dú)特的生理效應(yīng)，對(duì)免疫應(yīng)答產(chǎn)生深遠(yuǎn)影響。

96、(3)?本發(fā)明提供的fm來源于人類共生真菌的合成多糖，其生物安全性高，易溶于水，分子量集中，成分相對(duì)單一，其區(qū)別于藥食用真菌來源多糖，在誘導(dǎo)訓(xùn)練免疫中展現(xiàn)出優(yōu)越的生物安全性及良好的生物相容性，有望推動(dòng)臨床轉(zhuǎn)化應(yīng)用。