本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥，尤其涉及一種工程化線粒體及其制備方法與應(yīng)用。
背景技術(shù)：
1、干細(xì)胞療法，又稱(chēng)為再生醫(yī)療技術(shù)，其通過(guò)體外培養(yǎng)擴(kuò)增健康的干細(xì)胞，隨后移植到患者體內(nèi)，利用干細(xì)胞的歸巢作用、分化潛能及免疫調(diào)節(jié)特性，實(shí)現(xiàn)受損細(xì)胞或組織的修復(fù)與替換，從而改善疾病狀態(tài)，其中，永生化的間充質(zhì)干細(xì)胞(immortalized?mesenchymalstem?cells,imscs)作為一類(lèi)經(jīng)過(guò)特殊處理的干細(xì)胞，它結(jié)合了間充質(zhì)干細(xì)胞的多向分化潛能和永生化的特性，不僅能夠提供穩(wěn)定的細(xì)胞資源，還能夠分化為多種組織細(xì)胞，在組織工程和再生醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域中展現(xiàn)出巨大潛力，為復(fù)雜疾病的治療提供了新的可能性。然而，盡管imscs具有諸多優(yōu)勢(shì)，干細(xì)胞療法在臨床應(yīng)用上仍面臨免疫排斥這一重大挑戰(zhàn)，傳統(tǒng)的干細(xì)胞移植需要嚴(yán)格的組織配型，以避免強(qiáng)烈的免疫排斥反應(yīng)，這大大限制了其臨床應(yīng)用范圍。
2、為了克服上述問(wèn)題，科學(xué)家們探索了干細(xì)胞療法的創(chuàng)新路徑，其中線粒體移植治療成為了一個(gè)備受矚目的前沿方向，線粒體作為細(xì)胞內(nèi)的“能量工廠”，負(fù)責(zé)合成三磷酸腺苷(atp)，為細(xì)胞提供必要的能量支持，并參與到脂肪酸代謝、細(xì)胞鈣緩沖及活性氧產(chǎn)生等一系列關(guān)鍵生理過(guò)程中。線粒體移植治療通過(guò)將健康的外源性線粒體直接移植或借助攜帶線粒體的細(xì)胞間接移植到受損機(jī)體中，旨在恢復(fù)受損細(xì)胞的線粒體功能，提升細(xì)胞活力，其在多個(gè)疾病治療領(lǐng)域，如心肌缺血性損傷、神經(jīng)退行性病變及代謝性疾病等，均展現(xiàn)出了顯著的治療效果。然而，線粒體移植治療在臨床應(yīng)用中也面臨著一系列技術(shù)難題，如何高效、穩(wěn)定地獲取足夠數(shù)量的線粒體以滿足治療需求，以及解決線粒體直接移植存在的細(xì)胞攝取效率低、靶向性差等問(wèn)題，是當(dāng)前線粒體移植治療領(lǐng)域亟待解決的關(guān)鍵問(wèn)題。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
1、本發(fā)明針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，一方面提供了一種工程化線粒體及其制備方法與應(yīng)用，該工程化線粒體表面包裹有工程化凋亡細(xì)胞外囊泡膜，不僅解決了現(xiàn)有技術(shù)中傳統(tǒng)的線粒體移植治療無(wú)法高效穩(wěn)定獲取足量線粒體，還提高了細(xì)胞攝取效率和靶向性；另一方面提供了一種工程化線粒體的應(yīng)用。
2、為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下：
3、一種工程化線粒體的制備方法，包括以下步驟：
4、s1、構(gòu)建永生化間充質(zhì)干細(xì)胞；
5、s2、從永生化間充質(zhì)干細(xì)胞中分離提取線粒體；
6、s3、取永生化間充質(zhì)干細(xì)胞經(jīng)ifn-γ和tnf-α預(yù)處理，凋亡誘導(dǎo)，提取得到工程化凋亡細(xì)胞外囊泡膜；
7、s4、將線粒體與工程化凋亡細(xì)胞外囊泡膜混合，經(jīng)超聲、離心后，獲得表面包覆工程化凋亡細(xì)胞外囊泡膜的工程化線粒體。
8、根據(jù)上述技術(shù)手段，通過(guò)構(gòu)建永生化間充質(zhì)干細(xì)胞并提取線粒體，結(jié)合ifn-γ和tnf-α預(yù)處理的凋亡細(xì)胞外囊泡膜對(duì)線粒體進(jìn)行包覆，有效提升了工程化線粒體的穩(wěn)定性與靶向性，不僅解決了線粒體直接移植時(shí)細(xì)胞攝取效率低的問(wèn)題，還增強(qiáng)了線粒體在受損細(xì)胞中的功能恢復(fù)效果，為工程化線粒體移植治療提供了更為高效、穩(wěn)定的線粒體來(lái)源。
9、進(jìn)一步的，步驟s1中所述永生化間充質(zhì)干細(xì)胞的構(gòu)建包括以下步驟：
10、s11、通過(guò)慢病毒載體向人臍帶源性間充質(zhì)干細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)htert和sv40lt基因；
11、s12、經(jīng)g418篩選及擴(kuò)增培養(yǎng)后，獲得具有永生化特性的永生化間充質(zhì)干細(xì)胞。
12、根據(jù)上述技術(shù)手段，所獲得具有永生化特性的永生化間充質(zhì)干細(xì)胞由于其特殊的性質(zhì)，在長(zhǎng)期傳代中無(wú)衰老跡象，且能夠保持線粒體供體功能。
13、進(jìn)一步的，步驟s3中所述工程化凋亡細(xì)胞外囊泡膜的提取方法包括以下步驟：
14、s31、預(yù)處理：取永生化間充質(zhì)干細(xì)胞接種于培養(yǎng)基中，用濃度為20ng/ml的ifn-γ和濃度為20ng/ml的tnf-α預(yù)處理24h；
15、s32、凋亡誘導(dǎo)：將ifn-γ和tnf-α預(yù)處理后的細(xì)胞采用星形孢菌素誘導(dǎo)凋亡16h，收集上清液；
16、s33、將上清液進(jìn)行離心處理，獲得工程化凋亡細(xì)胞外囊泡；
17、s34、取工程化凋亡細(xì)胞外囊泡在4℃條件下用pbs重懸，靜置2h，然后經(jīng)過(guò)超聲、離心處理后，獲得工程化凋亡細(xì)胞外囊泡膜。
18、進(jìn)一步的，步驟s33中所述離心處理?xiàng)l件為：
19、上清液先在800g條件下離心10min，收集上清液二；將上清液二在2000g條件下離心10min，收集上清液三；將上清液三在16000g條件下離心30min，獲得沉淀物為工程化凋亡細(xì)胞外囊泡。
20、根據(jù)上述技術(shù)手段，800g條件下離心10min用于去除上清液中的細(xì)胞碎片；2000g條件下離心10min用于去除清液二中的大顆粒雜質(zhì)；16000g條件下離心30min，所獲得的沉淀物經(jīng)pbs重懸，獲得工程化凋亡細(xì)胞外囊泡(eimscs-apoevs)。
21、進(jìn)一步的，步驟s34中所述超聲處理?xiàng)l件為：功率40w，脈沖周期開(kāi)6s、關(guān)3s，持續(xù)時(shí)間6min；所述離心處理?xiàng)l件為：超聲處理的溶液先在3200g條件下離心5min，收集上清液四；將上清液四在20000g條件下離心20min，獲得沉淀物為工程化凋亡細(xì)胞外囊泡膜。
22、進(jìn)一步的，步驟s4中所述線粒體與工程化凋亡細(xì)胞外囊泡膜混合的質(zhì)量比例為1:1。
23、進(jìn)一步的，步驟s4中所述超聲處理?xiàng)l件為：功率40w，脈沖周期開(kāi)2s、關(guān)3s，持續(xù)時(shí)間為2min；所述離心處理?xiàng)l件為：12000g離心5min。
24、一種根據(jù)上述工程化線粒體的制備方法制備得到的工程化線粒體。
25、根據(jù)上述技術(shù)手段，工程化線粒體以外源性線粒體為中心，其表面包覆工程化凋亡細(xì)胞外囊泡膜(eimscs-apoevs膜)，具有靶向炎癥部位巨噬細(xì)胞的能力，并且富含多種炎性調(diào)節(jié)相關(guān)分子及組織修復(fù)相關(guān)功能性蛋白，能夠促進(jìn)m1型巨噬細(xì)胞向m2型表型轉(zhuǎn)化，通過(guò)eimscs-apoevs膜介導(dǎo)的靶向遞送效率，提高了永生化間充質(zhì)干細(xì)胞源性線粒體的細(xì)胞攝取率，從而為線粒體移植治療效率的提升提供新的技術(shù)路徑。
26、進(jìn)一步的，所述的工程化線粒體的粒徑為200-500nm。
27、進(jìn)一步的，所述的工程化線粒體在制備用于調(diào)控巨噬細(xì)胞免疫和代謝的藥物中的應(yīng)用。
28、本發(fā)明實(shí)現(xiàn)的有益效果：
29、1、本發(fā)明通過(guò)構(gòu)建永生化間充質(zhì)干細(xì)胞作為線粒體的來(lái)源，在永生化間充質(zhì)干細(xì)胞穩(wěn)定的體外增殖能力下不僅確保了線粒體在數(shù)量上的充足性和功能上的完整性，還因永生化的特性使得線粒體資源得以穩(wěn)定供應(yīng)，避免了傳統(tǒng)方法中線粒體提取困難、數(shù)量有限的問(wèn)題，簡(jiǎn)化了線粒體的獲取過(guò)程，還提高了線粒體的提取效率，為線粒體移植治療的大規(guī)模臨床應(yīng)用奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)，同時(shí)，利用ifn-γ和tnf-α對(duì)永生化間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行預(yù)處理，誘導(dǎo)其凋亡并提取凋亡細(xì)胞外囊泡膜，使得凋亡細(xì)胞外囊泡膜具有良好的生物相容性和靶向性，能夠作為線粒體的“載體”，顯著提高了工程化線粒體在移植過(guò)程中的細(xì)胞攝取效率和靶向性，解決了傳統(tǒng)線粒體直接移植時(shí)面臨的細(xì)胞攝取效率低、難以精準(zhǔn)定位到受損部位的關(guān)鍵技術(shù)難題。
30、2、本發(fā)明中工程化線粒體是通過(guò)結(jié)合凋亡細(xì)胞外囊泡膜對(duì)外源性線粒體進(jìn)行包覆，不僅保護(hù)了線粒體的結(jié)構(gòu)和功能免受外界環(huán)境的破壞，還增強(qiáng)了線粒體在受損細(xì)胞內(nèi)的穩(wěn)定性和功能恢復(fù)能力，工程化凋亡細(xì)胞外囊泡膜具有靶向炎癥部位巨噬細(xì)胞的能力，同時(shí)富含多種炎性調(diào)節(jié)相關(guān)分子及組織修復(fù)相關(guān)功能性蛋白，以能夠促進(jìn)m1型巨噬細(xì)胞向m2型表型轉(zhuǎn)化的作用下，使得工程化線粒體在移植到受損機(jī)體后，能夠更有效地恢復(fù)受損細(xì)胞的線粒體功能，提升細(xì)胞活力，不僅為線粒體移植治療提供了新的技術(shù)路徑，也為難治性疾病的治療帶來(lái)了新的希望，有望在未來(lái)的臨床實(shí)踐中發(fā)揮重要作用。
31、3、本發(fā)明中工程化線粒體的制備方法通過(guò)將從永生化間充質(zhì)干細(xì)胞中提取的線粒體和工程化凋亡細(xì)胞外囊泡膜混合、超聲、離心等簡(jiǎn)單、易操作的步驟，獲得能夠?qū)奘杉?xì)胞的免疫功能及能量代謝重編程具有顯著的調(diào)控作用的工程化線粒體，制備方法簡(jiǎn)單、效率高，綠色無(wú)污染、適合大規(guī)模生產(chǎn)，具有重要的臨床意義和廣闊的市場(chǎng)應(yīng)用前景。