本技術(shù)屬于生物醫(yī)用抗菌材料，具體涉及一種空間分離雙層水凝膠及其制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、糖尿病足潰瘍（diabetic?foot?ulcers，dfus）是糖尿病患者的主要并發(fā)癥之一，指的是在糖尿病患者中出現(xiàn)的足部感染、化膿、潰爛等癥狀。dfus愈合緩慢、易受感染、容易復(fù)發(fā)，嚴(yán)重時(shí)可導(dǎo)致截肢。目前針對(duì)糖尿病足潰瘍的治療，臨床上主要采用抗感染、負(fù)壓吸引、提高局部血流供應(yīng)以及局部徹底清創(chuàng)等方式。盡管當(dāng)前的治療方法在一定程度上有效，但由于感染控制難度大、機(jī)體愈合能力差等原因，仍有極多數(shù)患者的壞疽得不到有效控制，病情持續(xù)惡化。因此，積極探索更加合理的治療方案，研究和開發(fā)新的治療方法對(duì)于改善dfus治療效果十分有必要。

2、光動(dòng)力治療是一種通過特定波長(zhǎng)的光輻射誘導(dǎo)局部微生物滅活的治療方式。與傳統(tǒng)抗菌藥物不同，其機(jī)制是將激發(fā)的能量通過光敏劑傳遞到分子氧，從而生成具有強(qiáng)氧化還原活性的活性氧?；钚匝跄軌蜃饔糜诩?xì)菌的細(xì)胞壁、細(xì)胞膜和核酸，有效殺滅抗生素敏感菌和耐藥菌株，同時(shí)減少耐藥性的形成。由于活性氧存在時(shí)間極短且作用范圍局限于局部組織，這種治療方法能夠有效針對(duì)局部感染，并避免對(duì)周圍健康組織造成損傷。然而，傳統(tǒng)的有機(jī)光敏劑（如孟加拉玫瑰紅和亞甲藍(lán)）由于易發(fā)生聚集淬滅、ros產(chǎn)生效率低等缺陷，限制了其光動(dòng)力抗菌效果。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的是解決現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種空間分離雙層水凝膠及其制備方法和應(yīng)用，具體采用以下的技術(shù)方案：

2、第一方面，本發(fā)明提供了一種空間分離雙層水凝膠，所述空間分離雙層水凝膠包括：

3、內(nèi)層凝膠，所述內(nèi)層凝膠為負(fù)載工程乳酸菌的瓊脂糖凝膠微球；

4、外層凝膠，所述外層凝膠包括甲基丙烯?；髂z和負(fù)載于甲基丙烯酰化明膠上的光敏劑；

5、所述光敏劑為tpa-py+-c4；所述tpa-py+-c4的結(jié)構(gòu)式如下：

6、

7、本發(fā)明將活菌（工程乳酸菌）封裝在水凝膠中能夠有效保護(hù)益生菌的活性，提供穩(wěn)定的微環(huán)境。水凝膠中的益生菌可免受傷口環(huán)境的不利影響，延長(zhǎng)其在傷口處的存活時(shí)間。此外，光固化型水凝膠在傷口治療中的應(yīng)用進(jìn)一步擴(kuò)展了水凝膠的優(yōu)勢(shì)。這類水凝膠能夠在光照下迅速固化，提供更好的適配性，精確貼合各種形狀和大小的傷口。其中甲基丙烯酰化明膠（gelma）是一種重要的生物醫(yī)用材料，其性質(zhì)類似天然細(xì)胞外基質(zhì)。在波長(zhǎng)為405?nm的光照下，gelma能夠交聯(lián)形成穩(wěn)定凝膠結(jié)構(gòu)，在本發(fā)明中可以起到藥物釋放目的。

8、其中，（1）上述內(nèi)層凝膠為微球形式，負(fù)載的工程乳酸菌（乳酸乳球菌mg1363），能夠原位持續(xù)釋放cxcl12和乳酸，激活免疫并促進(jìn)傷口愈合；外層凝膠具有光固化性能，能夠適配不同的傷口形狀，負(fù)載的光敏劑tpa-py+-c4能夠提供持續(xù)的抗菌、抗生物膜作用，促進(jìn)傷口愈合。

9、（2）光敏劑tpa-py+-c4具有聚集誘導(dǎo)發(fā)光特性，在甲苯中熒光發(fā)射最強(qiáng)，隨著甲苯濃度的增加，其熒光強(qiáng)度增強(qiáng)并發(fā)生藍(lán)移；tpa-py+-c4能顯著生成活性氧（reactiveoxygen?species，ros），包括單線態(tài)氧（1o2）和超氧陰離子（o2?-），其ros生成效率優(yōu)于傳統(tǒng)光敏劑孟加拉玫瑰紅（rb）。

10、（3）甲基丙烯?；髂z（gelma）在405?nm藍(lán)光照射后可液態(tài)凝膠轉(zhuǎn)變?yōu)楣腆w凝膠結(jié)構(gòu)，且具有較好的流變性質(zhì)、保水率和溶脹率及穩(wěn)定性，有助于傷口的濕潤(rùn)環(huán)境維持；且經(jīng)凍干處理后的gelma凝膠表現(xiàn)出明顯的結(jié)構(gòu)和形態(tài)特征，其內(nèi)部具有均勻的微球分布。

11、作為進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方式，所述工程乳酸菌為乳酸乳球菌mg1363；所述乳酸乳球菌mg1363由基因工程改造得到；

12、所述tpa-py+-c4合成路線如下：

13、。

14、上述乳酸乳球菌mg1363經(jīng)基因工程改造，能夠在培養(yǎng)基中原位表達(dá)cxcl12，并在培養(yǎng)12小時(shí)后，其表達(dá)量達(dá)1200?pg/ml，且該乳酸乳球菌mg1363在培養(yǎng)初期表現(xiàn)出比野生型乳酸菌更快的生長(zhǎng)速度。

15、第二方面，本發(fā)明提供了上述空間分離雙層水凝膠的制備方法，包括以下步驟：

16、將工程乳酸菌、瓊脂糖溶液、m17培養(yǎng)基和葡萄糖混合，然后加入礦物油，攪拌直至溶液成乳白色乳液狀，離心，洗滌，得到負(fù)載有工程乳酸菌的瓊脂糖凝膠微球；

17、將所述瓊脂糖凝膠微球、甲基丙烯酰化明膠溶液、光引發(fā)劑和光敏劑混勻，然后注入模具中，藍(lán)光照射固化，得到所述空間分離雙層水凝膠。

18、在上述制備過程中負(fù)載有工程乳酸菌的瓊脂糖凝膠微球（mps）的制備方法為乳液法，微球的平均粒徑為68.4?μm；其中，m17培養(yǎng)基、葡萄糖的添加可以顯著提高微球內(nèi)乳酸乳球菌mg1363的存活率。

19、作為進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方式，所述瓊脂糖溶液的濃度為0.5%-1%；所述甲基丙烯?；髂z溶液的濃度為100?mg/ml-150?mg/ml；所述光引發(fā)劑的濃度為2.5?mg/ml-3.5?mg/ml；所述m17培養(yǎng)基最終的濃度為10?mg/ml；所述葡萄糖最終的濃度為50?mg/ml。其中，在上述制備過程中，（1）瓊脂糖濃度越高，形成的微球的尺寸越大，硬度越強(qiáng)；原因是：瓊脂糖的濃度越高，溶液的粘度就越大，這使得在微球形成過程中，聚合物更容易凝結(jié)，從而形成較大和較硬的微球。（2）甲基丙烯酰化明膠溶液濃度越高，光固化速度越快；原因是：甲基丙烯酰化明膠中的光敏基團(tuán)在受到光照后會(huì)發(fā)生交聯(lián)反應(yīng)，形成三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。高濃度的甲基丙烯?；髂z意味著每單位體積內(nèi)有更多的交聯(lián)點(diǎn)，因此會(huì)加速光固化過程。（3）光引發(fā)劑的濃度越高，光固化速度越快；原因是：光引發(fā)劑的濃度增加會(huì)導(dǎo)致更多的自由基或活性物種的生成，從而促進(jìn)聚合物鏈的交聯(lián)反應(yīng)，使光固化反應(yīng)更迅速。但是過高的光引發(fā)劑濃度可能會(huì)導(dǎo)致過快的聚合反應(yīng)，產(chǎn)生不均勻的交聯(lián)結(jié)構(gòu)，因此該濃度范圍為優(yōu)化后的濃度，以獲得理想的固化速度和均勻性。

20、作為進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方式，所述攪拌的溫度為45℃-75℃，所述攪拌的速度為800?rpm-1200?rpm，所述攪拌的時(shí)間為5?min-15?min；所述藍(lán)光照射固化的時(shí)間為30?s-90s。

21、第三方面，本發(fā)明提供了上述空間分離雙層水凝膠在制備抗菌材料中的應(yīng)用。

22、作為進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方式，上述菌包括大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、耐甲氧西林金黃色葡萄球菌中的至少一種。

23、本發(fā)明實(shí)施例結(jié)果顯示，空間分離雙層水凝膠展現(xiàn)出優(yōu)異的抗菌性能，能夠有效抑制并殺滅包括大腸桿菌（ escherichia?coli，ec）、金黃色葡萄球菌（ staphylococcus? aureus，sa）、銅綠假單胞菌（ pseudomonas?aeruginosa，pa）及耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（methicillin-resistant staphylococcus?aureus，mrsa）在內(nèi)的四種常見致病菌。此外，該水凝膠對(duì)細(xì)菌生物膜的形成具有顯著抑制作用，能夠高效清除已形成的生物膜，可于抗菌、抗生物膜相關(guān)的預(yù)防和治療。

24、第四方面，本發(fā)明提供了一種抗菌材料，該抗菌材料包括上述的空間分離雙層水凝膠。

25、第五方面，本發(fā)明提供了上述空間分離雙層水凝膠在制備促進(jìn)糖尿病傷口愈合的產(chǎn)品中的應(yīng)用。

26、第六方面，本發(fā)明提供了一種用于促進(jìn)糖尿病傷口愈合的敷料，所述敷料包括上所述的空間分離雙層水凝膠。

27、根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例結(jié)果顯示，空間分離雙層水凝膠能夠顯著促進(jìn)ii型糖尿病小鼠全層缺損皮膚創(chuàng)面的愈合。

28、相較于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明的有益效果至少包括：

29、（1）本發(fā)明提供了一種雙層水凝膠，可以在傷口愈合的不同時(shí)期發(fā)揮治療效果。該敷料協(xié)同光動(dòng)力抗菌與促愈合，可顯著促進(jìn)糖尿病傷口愈合。相較于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明將工程菌限制在水凝膠內(nèi)部，減少乳酸乳球菌mg1363表面免疫原性物質(zhì)對(duì)組織的刺激。乳酸乳球菌mg1363無(wú)法外泄也有效防止其進(jìn)入血液循環(huán)，降低了因治療而引發(fā)敗血癥等風(fēng)險(xiǎn)，進(jìn)一步確保了治療的安全性；

30、（2）本發(fā)明優(yōu)化了乳酸乳球菌凝膠微球的組分，保證了益生菌在凝膠微球內(nèi)部的活性。本發(fā)明在凝膠微球合成過程中，通過加入葡萄糖、m17培養(yǎng)基等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，優(yōu)化了凝膠微球內(nèi)部環(huán)境。相較于純水凝膠環(huán)境，添加營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)后凝膠內(nèi)部滲透壓不僅更適宜乳酸乳球菌mg1363生長(zhǎng)，還能為其生長(zhǎng)代謝提供足夠的營(yíng)養(yǎng)；

31、（3）本發(fā)明具有優(yōu)異的抗菌效果：本發(fā)明的雙層水凝膠對(duì)多種致病菌（如大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、耐甲氧西林的金黃色葡萄球菌）表現(xiàn)出顯著的抑制作用，且能有效抑制并清除相應(yīng)細(xì)菌生物膜；

32、（4）本發(fā)明的雙層水凝膠設(shè)計(jì)了空間分離型結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)使得乳酸乳球菌與光敏劑被分離在不同的空間，避免了兩者之間的直接接觸，從而確保了它們各自的功能不受影響。