本發(fā)明屬于生物材料領(lǐng)域。具體地，本發(fā)明涉及一種用于制備聚丙烯酰胺凝膠的組合物、聚丙烯酰胺凝膠及其制備方法和用途。

背景技術(shù)：

1、聚丙烯酰胺凝膠電泳(sds-page)是一種以聚丙烯酰胺凝膠作為支持介質(zhì)用于分離蛋白質(zhì)的常用電泳技術(shù)?！吨袊幍洹穼?duì)于電泳用聚丙烯酰胺凝膠的配方有具體的記載，采用藥典配方能夠分離出不同分子量的蛋白，顯示出不同的蛋白條帶，但對(duì)于分子量十分接近的蛋白卻不能實(shí)現(xiàn)較好的分離效果。

2、百日咳(pertussis)是由百日咳鮑特氏桿菌(bordetella?pertussis)引起的一種具有高度傳染性的嚴(yán)重急性呼吸道傳染病，傳染性較強(qiáng)，人群普遍易感，其中尤以嬰幼兒多見，是嚴(yán)重威脅人類健康的主要傳染病之一。

3、百日咳鮑特氏桿菌能產(chǎn)生許多毒性因子，這些毒性因子可因環(huán)境條件改變而發(fā)生表型變化，毒力因子的表達(dá)水平也不同。這些毒性因子包括百日咳外毒素(pt)、絲狀血凝素(filamentous?hemagglutinin，fha)、百日咳桿菌粘著素(pertactin?prn)、耐熱內(nèi)毒素(endotoxin，et)、不耐熱毒素(hlt)、氣管細(xì)胞毒素(tct)和腺苷環(huán)化酶毒素(act)等多種生物活性物質(zhì)。在檢測(cè)蛋白時(shí)，采用經(jīng)典sds-page的檢測(cè)方法無法實(shí)現(xiàn)分子量十分接近的蛋白的分離，從而影響產(chǎn)品質(zhì)量。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的發(fā)明人經(jīng)過大量的研究發(fā)現(xiàn)，百日咳毒素(pt)是一種多亞基的蛋白質(zhì)，總分子量為105kda，亞基s1為28kda，亞基s2為23kda，亞基s3為22kda，亞基s4為11.7kda，亞基s5為9.3kda，各亞基的分子量十分接近。百日咳粘附素(prn)為69kda，絲狀血凝素(fha)為220kda，這兩種蛋白極易降解和聚集，其分子量條帶從90kda～250kda均有分布。對(duì)于上述蛋白的檢測(cè)，采用經(jīng)典sds-page的配方不能實(shí)現(xiàn)較好的分離。

2、針對(duì)以上問題，本發(fā)明的目的是提供一種用于制備聚丙烯酰胺凝膠的組合物、聚丙烯酰胺凝膠及其制備方法和用途。采用本發(fā)明的組合物制備的聚丙烯酰胺凝膠對(duì)分子量接近的蛋白具有較高的分離度，能夠更準(zhǔn)確的檢測(cè)蛋白的條帶分布。

3、定義：

4、除非另有定義，否則本文使用的所有科技術(shù)語具有本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所理解的相同含義。關(guān)于本領(lǐng)域的術(shù)語的定義，專業(yè)人員具體可參考current?protocols?inmolecular?biology(ausubel)。

5、盡管本發(fā)明以廣義范圍顯示數(shù)字范圍和參數(shù)近似值，但是具體實(shí)施例中所示的數(shù)值盡可能準(zhǔn)確地進(jìn)行記載。然而，任何數(shù)值本來就必然含有一定的誤差，其是由它們各自的測(cè)量中存在的標(biāo)準(zhǔn)偏差所致。另外，本文公開的所有范圍應(yīng)理解為涵蓋其中包含的任何和所有子范圍。例如記載的“2至40”的范圍應(yīng)認(rèn)為包含最小值2和最大值40之間(包含端點(diǎn))的任何和所有子范圍，也就是說，所有以最小值2或更大起始的子范圍，例如2至6.1，以及以最大值40或更小終止的子范圍，例如5.5至40。另外，任何稱為“并入本文”的參考文獻(xiàn)應(yīng)理解為以其整體并入。

6、本文使用的術(shù)語“或”可與術(shù)語“和/或”互換使用，除非上下文另外清楚地指明。

7、本發(fā)明的上述目的是通過提供以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：

8、一方面，本發(fā)明提供一種用于制備聚丙烯酰胺凝膠的組合物，其包含分離膠液和濃縮膠液，所述分離膠液包含：以體積份數(shù)計(jì)，1.2-1.8mol/l?tris-hcl緩沖液1-1.5份，20-40重量％丙烯酰胺溶液1.8-2.2份，5-15重量％sds(十二烷基硫酸鈉)溶液0.03-0.08份，5-15重量％aps(過硫酸銨)溶液0.03-0.08份，temed(四甲基乙二胺)0.001-0.006份，水1.5-2.2份；

9、所述濃縮膠液包含：以體積份數(shù)計(jì)，20-40重量％丙烯酰胺溶液0.24-0.32份，5-15重量％sds溶液0.018-0.022份，5-15重量％aps溶液0.018-0.022份，temed?0.0018-0.0022份，0.2-0.8mol/l?tris-hcl緩沖液0.45-0.55份，水1.0-1.4份。

10、優(yōu)選地，所述分離膠液包含：以體積份數(shù)計(jì)，1.5mol/l?tris-hcl緩沖液1.2-1.3份，30重量％丙烯酰胺溶液1.9-2.1份，10重量％sds溶液0.04-0.06份，10重量％aps溶液0.04-0.06份，temed?0.002-0.005份，水1.7-2份。

11、優(yōu)選地，所述濃縮膠液包含：以體積份數(shù)計(jì)，30重量％丙烯酰胺溶液0.26-0.3份，10重量％sds溶液0.019-0.021份，10重量％aps溶液0.019-0.021份，temed?0.0019-0.0021份，0.5mol/l?tris-hcl緩沖液0.48-0.52份，水1.1-1.3份。

12、優(yōu)選地，所述分離膠液中溶質(zhì)的總濃度為10-15重量％，優(yōu)選為11-12重量％。

13、優(yōu)選地，所述濃縮膠液中溶質(zhì)的總濃度為3-5重量％，優(yōu)選為3.9-4.6重量％。

14、優(yōu)選地，所述組合物中分離膠液和濃縮膠液的體積比為1-4∶1，優(yōu)選為2-3∶1。

15、另一方面，本發(fā)明提供一種聚丙烯酰胺凝膠，其由本發(fā)明的組合物制得。

16、再一方面，本發(fā)明提供一種由本發(fā)明的組合物制備聚丙烯酰胺凝膠的方法，所述方法包括如下步驟：

17、(1)向容器中依次加入所述分離膠液配方量的tris-hcl緩沖液、丙烯酰胺溶液、sds溶液、aps溶液、temed和水，混合均勻，得到分離膠液，將所述分離膠液加入制膠板中，加入超純水液封，靜置，待分離膠液凝固后去除超純水，得到分離膠層；

18、(2)向容器中依次加入所述濃縮膠液配方量的丙烯酰胺溶液、sds溶液、aps溶液、temed、tris-hcl緩沖液和水，混合均勻，得到濃縮膠液，將所述濃縮膠液加入制膠板內(nèi)分離膠層的上層，插入齒梳，靜置，待濃縮膠液凝固后得到聚丙烯酰胺凝膠。

19、優(yōu)選地，所述方法還包括以下步驟：在步驟(1)之前，對(duì)所述制膠板進(jìn)行驗(yàn)漏。

20、優(yōu)選地，步驟(1)中，靜置10-30分鐘，優(yōu)選為20分鐘。

21、優(yōu)選地，步驟(2)中，靜置10-30分鐘，優(yōu)選為20分鐘。

22、再一方面，本發(fā)明提供一種聚丙烯酰胺凝膠試劑盒，其包含根據(jù)本發(fā)明的用于制備聚丙烯酰胺凝膠的組合物。

23、再一方面，本發(fā)明提供一種聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)方法，所述聚丙烯酰胺凝膠由根據(jù)本發(fā)明的用于制備聚丙烯酰胺凝膠的組合物或根據(jù)本發(fā)明的聚丙烯酰胺凝膠試劑盒制得，所述方法包括如下步驟：

24、(1)將蛋白質(zhì)樣品點(diǎn)入所述聚丙烯酰胺凝膠的膠孔中，進(jìn)行電泳；

25、(2)電泳結(jié)束后，將所述聚丙烯酰胺凝膠依次進(jìn)行染色、脫色，直至反應(yīng)條帶清晰，掃描保存反應(yīng)結(jié)果。

26、優(yōu)選地，步驟(1)中，蛋白質(zhì)樣品的上樣量為5-10μg，優(yōu)選為5μg。

27、優(yōu)選地，所述聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)方法用于檢測(cè)蛋白質(zhì)分子量。

28、優(yōu)選地，所述蛋白質(zhì)選自百日咳毒素、百日咳粘附素和絲狀血凝素中的一種或多種。

29、本發(fā)明至少具有如下有益效果：

30、采用本發(fā)明的組合物制備的聚丙烯酰胺凝膠對(duì)分子量接近的蛋白具有較高的分離度，能夠更準(zhǔn)確的檢測(cè)出蛋白的條帶分布。

31、具體地，將采用本發(fā)明的組合物制備的聚丙烯酰胺凝膠用于電泳分離百日咳毒素pt蛋白，該蛋白的亞基s1、s2、s3、s4和s5的條帶均清晰可見，且分離度較高。