本發(fā)明涉及生物醫(yī)用材料領(lǐng)域，具體涉及一種可注射的互鎖交聯(lián)透明質(zhì)酸或其鹽水凝膠、制備方法及應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、透明質(zhì)酸(hyaluronan，縮寫為ha)及其鹽是一種具有高度生物相容性的大分子多糖類化合物，廣泛分布在動(dòng)物和人體結(jié)締組織細(xì)胞外基質(zhì)中，已實(shí)現(xiàn)商業(yè)化應(yīng)用于醫(yī)藥和美容領(lǐng)域。在人體的皮膚組織中分布著大量的透明質(zhì)酸，其發(fā)揮著保水、維持細(xì)胞外空間、促進(jìn)細(xì)胞修復(fù)、黏結(jié)皮膚組織內(nèi)界面、潤滑等功能，故其常作為填充基質(zhì)用于面部年輕化及輪廓修復(fù)治療。然而，未經(jīng)修飾的透明質(zhì)酸注射入皮膚組織中存在機(jī)械性能差、黏度低、在體內(nèi)留存時(shí)間短等弊端，而通過化學(xué)方法對其性能進(jìn)行優(yōu)化是透明質(zhì)酸鈉應(yīng)用的常見策略。

2、大多數(shù)市售的透明質(zhì)酸填充劑使用bdde作為交聯(lián)劑，眾所周知，極低濃度的bdde殘留都可能具有遺傳毒性?？紤]到bdde相關(guān)的安全風(fēng)險(xiǎn)，市售皮膚填充劑產(chǎn)品的年劑量被限制為每年不超過20ml(例如)，每次使用最大劑量被限制為6ml(例如)。因此，更加安全有效的交聯(lián)劑是透明質(zhì)酸類填充劑未來發(fā)展的迫切需求。

3、專利cn113499480報(bào)道了一種皮下填充劑用物理和化學(xué)雙網(wǎng)絡(luò)水凝膠及其制備方法和應(yīng)用。在該專利中先用化學(xué)方法對ha進(jìn)行交聯(lián)改性，再利用物理凍融實(shí)現(xiàn)交聯(lián)凝膠的二次交聯(lián)，盡管高分子材料在凍干過程中分子晶格會(huì)發(fā)生改變，但物理交聯(lián)仍然不如化學(xué)鍵穩(wěn)固。專利cn113896915報(bào)道了使用內(nèi)源性多胺包括精胺和/或亞精胺作為新型交聯(lián)劑制備交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉，但該工藝制備的凝膠粘滯性相對較低，推力相對較大，同時(shí)在該交聯(lián)體系下，會(huì)形成較多的酯鍵結(jié)構(gòu)，當(dāng)透明質(zhì)酸鈉含量較低(如低于15mg/ml)時(shí)，容易出現(xiàn)“水膠分離”，因而作為注射填充產(chǎn)品進(jìn)行臨床使用時(shí)比較受限。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、針對現(xiàn)有工藝存在的不足，本發(fā)明目的在于提供一種可注射的互鎖交聯(lián)透明質(zhì)酸或其鹽水凝膠、制備方法及應(yīng)用。

2、本發(fā)明可注射的互鎖交聯(lián)透明質(zhì)酸或其鹽水凝膠，采用雙重交聯(lián)互鎖技術(shù)(double?cross-linked?interlock?technology，簡稱dcit)，在兩步化學(xué)交聯(lián)反應(yīng)過程中形成互鎖網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。首先透明質(zhì)酸或其鹽和交聯(lián)劑內(nèi)源性多胺經(jīng)第一步交聯(lián)形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)凝膠，然后經(jīng)第二步交聯(lián)形成互鎖結(jié)構(gòu)水凝膠。

3、本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的。

4、第一方面，本發(fā)明提供一種可注射的互鎖交聯(lián)透明質(zhì)酸或其鹽水凝膠，該水凝膠通過兩步交聯(lián)反應(yīng)得到，先將透明質(zhì)酸或其鹽和交聯(lián)劑進(jìn)行第一步交聯(lián)反應(yīng)形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，隨后加入的透明質(zhì)酸或其鹽和交聯(lián)劑穿插在所述網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)中，進(jìn)行第二步交聯(lián)反應(yīng)，得到可注射的互鎖交聯(lián)透明質(zhì)酸或其鹽水凝膠。

5、所述透明質(zhì)酸或其鹽選自透明質(zhì)酸鈉、透明質(zhì)酸鋅、透明質(zhì)酸鉀和透明質(zhì)酸鈣中的一種或多種，優(yōu)選透明質(zhì)酸鈉。

6、所述透明質(zhì)酸或其鹽的分子量為500～2600kda。

7、所述交聯(lián)劑為內(nèi)源性多胺，包括亞精胺、精胺及其衍生物。

8、所述透明質(zhì)酸或其鹽水凝膠粒徑d50為50～650μm。

9、所述可注射的互鎖交聯(lián)透明質(zhì)酸或其鹽水凝膠中透明質(zhì)酸或其鹽的濃度為10～25mg/ml。

10、第一步交聯(lián)反應(yīng)中，交聯(lián)劑與透明質(zhì)酸或其鹽的摩爾比為0.01～0.1，第二步交聯(lián)反應(yīng)中交聯(lián)劑與透明質(zhì)酸或其鹽的摩爾比為0.01～0.1。

11、所述兩步交聯(lián)中的第一步交聯(lián)形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，第二步交聯(lián)進(jìn)一步形成互鎖結(jié)構(gòu)，實(shí)現(xiàn)從互穿到互鎖結(jié)構(gòu)的升級。

12、其中，透明質(zhì)酸或其鹽摩爾量＝所用透明質(zhì)酸或其鹽質(zhì)量/透明質(zhì)酸或其鹽二糖重復(fù)單元分子量403；

13、優(yōu)選地，所述交聯(lián)過程需要加入催化劑，所述催化劑選自碳二亞胺、三苯基膦與溴化物形成的溴化鱗鹽、碳鎓鹽和4-(4,6-二甲氧基三嗪-2-基)-4-甲基嗎啉鹽酸鹽(dmtmm)中的一種或多種。

14、所述第一步交聯(lián)反應(yīng)中，催化劑與透明質(zhì)酸或其鹽的摩爾比為0.6～3，所述第二步交聯(lián)反應(yīng)中，催化劑與透明質(zhì)酸或其鹽的摩爾比為0.03～0.3。

15、進(jìn)一步地，在兩步交聯(lián)反應(yīng)后，還包括透析步驟，得到所述可注射的互鎖交聯(lián)透明質(zhì)酸或其鹽水凝膠。

16、優(yōu)選地，所述透析先用堿性透析液，再用中性透析液進(jìn)行透析。

17、所述互鎖交聯(lián)透明質(zhì)酸或其鹽水凝膠，需要并通過適宜的堿濃度條件透析去除不穩(wěn)定的酯鍵，得到所述可注射的互鎖交聯(lián)透明質(zhì)酸或其鹽水凝膠。其具有抗降解能力強(qiáng)、粘滯性優(yōu)異、支撐性好、易于推注、安全性高等優(yōu)點(diǎn)，可用于皮下注射填充。

18、第二方面，本發(fā)明提供第一方面所述可注射的互鎖交聯(lián)透明質(zhì)酸或其鹽水凝膠的制備方法，具體步驟如下：

19、(1)將交聯(lián)劑與透明質(zhì)酸或其鹽混合，制得交聯(lián)劑與透明質(zhì)酸或其鹽混合溶液a；

20、(2)向所述交聯(lián)劑與透明質(zhì)酸或其鹽混合溶液a中加入催化劑，進(jìn)行第一步交聯(lián)反應(yīng)，制得網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)交聯(lián)凝膠；

21、(3)將交聯(lián)劑與透明質(zhì)酸或其鹽混合，制得交聯(lián)劑與透明質(zhì)酸或其鹽混合溶液b；

22、(4)將步驟(3)制得的混合溶液b加入步驟(2)制得的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)交聯(lián)凝膠中，在催化劑的作用下，進(jìn)行第二步交聯(lián)反應(yīng)，制得互鎖結(jié)構(gòu)的交聯(lián)凝膠，并透析處理。

23、本發(fā)明的互鎖交聯(lián)透明質(zhì)酸或其鹽水凝膠采用雙重交聯(lián)互鎖技術(shù)(doublecross-linked?interlock?technology，簡稱dcit)，在第一步交聯(lián)過程中，ha分子中的羧基和精胺或亞精胺的多個(gè)氨基位點(diǎn)在催化劑的作用下可以構(gòu)建酰胺鍵形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)；同時(shí)ha分子中羧基和經(jīng)催化劑活化后的羥基可以形成酯鍵，起到占位效果；然后再加入ha溶液、交聯(lián)劑及催化劑，進(jìn)行第二步交聯(lián)；在此過程中，ha分子和交聯(lián)劑隨著攪拌力可均勻穿插入第一步形成的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)中，隨后在催化劑的作用下形成酰胺鍵以形成互鎖結(jié)構(gòu)。

24、優(yōu)選地，所述步驟(1)、(3)交聯(lián)劑為內(nèi)源性多胺，進(jìn)一步優(yōu)選包括亞精胺、精胺及其衍生物。

25、優(yōu)選地，步驟(1)、(3)先將交聯(lián)劑溶于水，調(diào)節(jié)ph＝6.0～6.3。

26、步驟(1)、(3)中的透明質(zhì)酸或其鹽選自透明質(zhì)酸鈉、透明質(zhì)酸鋅、透明質(zhì)酸鉀和透明質(zhì)酸鈣中的一種或多種，優(yōu)選透明質(zhì)酸鈉。

27、進(jìn)一步地，透明質(zhì)酸或其鹽的分子量為500～2600kda。

28、優(yōu)選地，步驟(1)、(3)中混合溶解時(shí)間為3～5h，例如：3h、3.5h、4h、4.5h、5h。

29、混合溶液a和混合溶液b中，所述透明質(zhì)酸或其鹽的質(zhì)量濃度為1％～5％。

30、優(yōu)選地，所述混合溶液a和混合溶液b中，交聯(lián)劑與透明質(zhì)酸或其鹽的摩爾比為0.01～0.1，二者可以相同也可以不同，例如：0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.1。

31、更優(yōu)選地，步驟(1)中交聯(lián)劑與透明質(zhì)酸或其鹽的摩爾比低于步驟(3)中交聯(lián)劑與透明質(zhì)酸或其鹽的摩爾比，即第一步反應(yīng)的交聯(lián)度低于第二步反應(yīng)交聯(lián)度，這是由于第一步交聯(lián)反應(yīng)制備得到了相對較松散的第一網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，使得第二步加入的透明質(zhì)酸或其鹽(ha)分子容易穿插，經(jīng)第二步交聯(lián)反應(yīng)后，構(gòu)建了不同層次的空間結(jié)構(gòu)，進(jìn)而更有利于形成互鎖結(jié)構(gòu)。

32、優(yōu)選地，所述交聯(lián)過程需要催化劑，步驟(2)和(4)中的催化劑選自碳二亞胺、三苯基膦與溴化物形成的溴化鱗鹽、碳鎓鹽和4-(4,6-二甲氧基三嗪-2-基)-4-甲基嗎啉鹽酸鹽(dmtmm)中的一種或多種，二者可以相同也可以不同。

33、優(yōu)選地，步驟(2)和(4)中的催化劑為1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺(edc)，同時(shí)加入助劑提高交聯(lián)反應(yīng)效率。

34、優(yōu)選地，所述助劑選自n-羥基琥珀酰亞胺(nhs)、磺化n-羥基琥珀酰亞胺(sulfo-nhs)、叔丁醇、1-羥基苯并三唑(hobt)中的任一種或多種，進(jìn)一步優(yōu)選為nhs。所述助劑與催化劑的摩爾比為0.2～0.4。

35、優(yōu)選地，步驟(2)中催化劑與混合溶液a中透明質(zhì)酸或其鹽的摩爾比為0.6～3，例如0.6、1、1.5、2、2.5、3，進(jìn)一步優(yōu)選為1～2。

36、步驟(2)中的交聯(lián)反應(yīng)時(shí)間為1～3h，例如：1h、2h、3h。

37、步驟(2)第一步交聯(lián)反應(yīng)中，催化劑加入量較多可以形成更多的酯鍵，起到充分“占位”的作用，有利于提高第二步交聯(lián)反應(yīng)的交聯(lián)效率，同時(shí)減少了第二步交聯(lián)反應(yīng)中催化劑用量，使得交聯(lián)反應(yīng)在低劑量催化劑、安全交聯(lián)劑的反應(yīng)條件下，構(gòu)建更多的互鎖結(jié)構(gòu)以提高終產(chǎn)品抗降解性能。

38、優(yōu)選地，步驟(4)中，催化劑與混合溶液b中透明質(zhì)酸或其鹽的摩爾比為0.03～0.3，例如：0.03、0.05、0.1、0.15、0.2、0.25、0.3。

39、步驟(4)中的交聯(lián)反應(yīng)時(shí)間為1～24h，例如：1h、2h、3h、8h、12h、16h、20h、24h。

40、優(yōu)選地，步驟(4)所述透析為兩步透析，第一步為堿性透析，第二步為中性透析。

41、為了充分形成互鎖結(jié)構(gòu)凝膠，需在第一步交聯(lián)反應(yīng)中形成提前占位的酯鍵結(jié)構(gòu)物質(zhì)(包括edc活性酯、nhs活性酯、ha羥基與羧基形成的酯等)，但酯鍵結(jié)構(gòu)物質(zhì)具有不穩(wěn)定性，同時(shí)會(huì)影響凝膠產(chǎn)品的穩(wěn)定性，本發(fā)明通過后期的堿性透析處理，使得提前占位形成的酯鍵在堿性透析過程中打開，釋放出線性ha鏈，此部分ha鏈不僅起到潤滑作用，提高產(chǎn)品的可注射性，同時(shí)該ha鏈還可以與形成的互鎖結(jié)構(gòu)進(jìn)一步纏繞或穿插，增強(qiáng)分子間相互作用力，提高產(chǎn)品的粘滯性。

42、優(yōu)選地，所述堿性透析液中的氫氧根與步驟(1)和(3)所用總的透明質(zhì)酸或其鹽(混合溶液a和混合溶液b中的總量)的摩爾比為1:1～10:1，例如：1:1、5:1、10:1。

43、堿性透析液的溶質(zhì)選自氫氧化鈉或氫氧化鉀，堿性透析液的溶劑為純化水、生理鹽水或磷酸鹽緩沖液中的任意一種或多種的組合。

44、在兩步交聯(lián)反應(yīng)過程，產(chǎn)生的不穩(wěn)定的酯鍵結(jié)構(gòu)物質(zhì)，經(jīng)堿性透析過程后，可破壞上述不穩(wěn)定的酯鍵結(jié)構(gòu)，能夠提高最終凝膠產(chǎn)品耐濕熱滅菌能力及貯存穩(wěn)定性；同時(shí)在堿性條件會(huì)也一定程度上破壞ha的糖苷鍵，因此，需要控制堿性透析液中氫氧根與透明質(zhì)酸或其鹽的摩爾量之比，如果氫氧根摩爾量較低，則無法有效清除不穩(wěn)定的酯鍵結(jié)構(gòu)物質(zhì)，水凝膠產(chǎn)品穩(wěn)定性無法得到保證；如果氫氧根摩爾量較高，ha的糖苷鍵會(huì)被破壞，交聯(lián)ha的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)不夠穩(wěn)固容易降解，或者產(chǎn)品中ha濃度降低過快，無法滿足臨床注射要求。

45、進(jìn)一步優(yōu)選地，在所述堿性透析中，透析液與所述互鎖結(jié)構(gòu)的交聯(lián)凝膠體積比為15:1～25:1，透析的溫度為10～40℃，例如：10℃、15℃、20℃、25℃、30℃、35℃、40℃；透析時(shí)間為1～10h，例如：1h、2h、4h、6h、8h、10h。

46、優(yōu)選地，所述中性透析中，透析液包括純化水、生理鹽水或磷酸鹽緩沖液中的任意一種或多種的組合，中性透析液的ph可以為6.0～7.6。

47、進(jìn)一步優(yōu)選地，在所述中性透析中，透析液與所述互鎖結(jié)構(gòu)的交聯(lián)凝膠的體積比為15:1～30:1，例如：15:1、17:1、20:1、23:1、25:1、27:1、30:1；透析的溫度為10～40℃，透析時(shí)間為1～20h。

48、堿性透析處理之前，將第二步交聯(lián)反應(yīng)得到的互鎖結(jié)構(gòu)的交聯(lián)凝膠切成等效直徑為0.02～1cm小塊，例如：0.02cm、0.05cm、0.1cm、0.15cm、0.2cm、0.25cm、0.3cm、0.35cm、0.4cm、0.45cm、0.5cm、0.55cm、0.6cm、0.65cm、0.7cm、0.75cm、0.8cm、0.85cm、0.9cm、0.95cm、1cm。

49、優(yōu)選地，透析袋截留分子量(mwco)為1～100kda，例如：1kda、5kda、10kda、20kda、30kda、40kda、50kda、60kda、70kda、80kda、90kda、100kda。

50、任選地，所述的制備方法包括步驟(5)，透析后經(jīng)稀釋、粉碎、灌裝、濕熱滅菌，得到所述可注射的互鎖交聯(lián)透明質(zhì)酸或其鹽水凝膠。

51、優(yōu)選地，步驟(5)中互鎖結(jié)構(gòu)的交聯(lián)凝膠的稀釋溶液選自純化水、生理鹽水、磷酸鹽平衡溶液或磷酸鹽緩沖溶液中的一種或多種。當(dāng)使用純化水時(shí)，需使用磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉調(diào)節(jié)體系滲透壓在200mosmol/kg～400mosmol/kg范圍內(nèi)，ph值在6.0～7.6范圍內(nèi)。

52、優(yōu)選地，在步驟(5)中，在稀釋后的互鎖結(jié)構(gòu)的交聯(lián)凝膠中加入鹽酸利多卡因，再將凝膠粉碎。鹽酸利多卡因的加入可以減輕透明質(zhì)酸或其鹽水凝膠注射時(shí)的疼痛。

53、優(yōu)選地，鹽酸利多卡因濃度為1～5mg/ml，例如：1mg/ml、2mg/ml、3mg/ml、4mg/ml、5mg/ml。

54、優(yōu)選地，步驟(5)中粉碎后凝膠粒徑d50為50～450μm、d90為100～650μm。

55、優(yōu)選地，步驟(5)中濕熱滅菌參數(shù)為116～121℃、15～30min。

56、優(yōu)選地，步驟(5)中，所述可注射的互鎖交聯(lián)透明質(zhì)酸或其鹽水凝膠中，透明質(zhì)酸或其鹽的濃度為10～25mg/ml，例如：10mg/ml、15mg/ml、16mg/ml、17mg/ml、18mg/ml、19mg/ml、20mg/ml、21mg/ml、23mg/ml、25mg/ml。

57、第三方面，本發(fā)明提供第一方面所述的可注射互鎖交聯(lián)透明質(zhì)酸或其鹽水凝膠或按照第二方面所述的制備方法獲得的可注射的互鎖交聯(lián)透明質(zhì)酸或其鹽水凝膠在制備非治療目的的組織填充與修復(fù)材料或藥物載體方面的應(yīng)用。

58、具體地，所述組織填充可用于消除皺紋(如眼周皺紋、額頭紋、眉間紋、口周紋、鼻唇溝、淚溝、法令紋、頸紋、手部皺紋、妊娠紋等)、抗衰老、消除疤痕、創(chuàng)傷修復(fù)、術(shù)中及術(shù)后靜脈止血等。

59、所述組織修復(fù)材料可以為骨組織修復(fù)材料、軟骨組織修復(fù)材料、角膜組織修復(fù)材料、心血管組織修復(fù)材料、肝組織修復(fù)材料等。

60、所述藥物以互鎖交聯(lián)透明質(zhì)酸或其鹽水凝膠為載體，以實(shí)現(xiàn)緩釋、控釋、靶向給藥等目的。

61、本發(fā)明的有益效果：

62、一、本發(fā)明的互鎖交聯(lián)水凝膠以內(nèi)源性多胺為交聯(lián)劑，相較于現(xiàn)有的凝膠，該凝膠具有更高的安全性。

63、二、本發(fā)明的互鎖結(jié)構(gòu)交聯(lián)水凝膠采用雙重交聯(lián)互鎖技術(shù)(double?cross-linkedinterlock?technology，簡稱dcit)，先后經(jīng)歷兩次交聯(lián)反應(yīng)，通過控制交聯(lián)劑和催化劑的用量，在第一步交聯(lián)反應(yīng)中充分利用起到酯鍵占位作用，提高了第二步交聯(lián)反應(yīng)效率，實(shí)現(xiàn)互穿網(wǎng)絡(luò)到互鎖結(jié)構(gòu)的升級；進(jìn)一步通過堿性透析工藝，破壞了交聯(lián)反應(yīng)過程原本用于占位的酯鍵，釋放出ha鏈不僅增強(qiáng)了產(chǎn)品的可推注性，同時(shí)與互鎖結(jié)構(gòu)進(jìn)一步纏繞，增強(qiáng)了分子間的相互作用力，制備得凝膠表現(xiàn)出高支撐性能和粘滯性以及優(yōu)異的抗酶解能力，滿足臨床對注射產(chǎn)品的需求。

64、三、本發(fā)明的互鎖結(jié)構(gòu)交聯(lián)水凝膠使用了高效的堿性透析工藝，還能夠在短時(shí)間內(nèi)實(shí)現(xiàn)加工助劑的清除，保證了透析后凝膠的透明質(zhì)酸或其鹽濃度高于預(yù)期產(chǎn)品中透明質(zhì)酸或其鹽的濃度。既省去了后續(xù)的濃縮工序，提高了生產(chǎn)效率，也避免了濃縮過程對高分子晶格的破壞及不易復(fù)溶現(xiàn)象的發(fā)生。