本發(fā)明屬于細(xì)胞培養(yǎng)，尤其是一種從尿液提取上皮細(xì)胞和間充質(zhì)干細(xì)胞的方法。
背景技術(shù)：
1、?人尿源性干細(xì)胞（human?urine?derived?stem?cells，huscs）是一種來源于尿液的干細(xì)胞。與其他干細(xì)胞相比，其具有取材無創(chuàng)，提取分離步驟簡便，較高的端粒酶活性和較長的端粒序列，良好的多向分化潛能以及安全性高、無致瘤性等優(yōu)點(diǎn)。許多實(shí)驗(yàn)證明它們更容易被誘導(dǎo)分化成為機(jī)體的各種細(xì)胞，因此用于臨床治療的潛能就更大，也就具有更大的市場。
2、人間充質(zhì)干細(xì)胞（msc）移植在治療多種疾病包括治療退行性神經(jīng)病變、卵巢早衰、泌尿生殖系損傷修復(fù)、脊髓損傷、腦損傷、心肌缺損、血管內(nèi)皮缺損、軟骨缺損、肺部損傷等疾病，以及癌癥治療中有廣泛的研究，并且已經(jīng)在多個(gè)領(lǐng)域得到臨床應(yīng)用，并在這些研究中未見到腫瘤發(fā)生。
3、通過檢索，發(fā)現(xiàn)如下幾篇與本專利申請(qǐng)相關(guān)的專利公開文獻(xiàn)：
4、?1、一種原始間充質(zhì)干細(xì)胞的制備方法（cn101629165b）。公開了一種原始間充質(zhì)干細(xì)胞的制備方法，它是采用人新鮮臍帶，提取華通膠，經(jīng)膠原酶消化后分離培養(yǎng)而成，適于冷凍保存。該發(fā)明還涉及按上述方法制備的原始間充質(zhì)干細(xì)胞，按照國際細(xì)胞療法協(xié)會(huì)制訂的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行生物學(xué)表型鑒定確認(rèn)為間充質(zhì)干細(xì)胞。
5、上述發(fā)明方法的步驟比較多，取材不易獲取且需要嚴(yán)格的倫理限制，臨床應(yīng)用受到限制。
6、一種從臍帶和胎盤羊膜組織同時(shí)提取上皮細(xì)胞和間充質(zhì)干細(xì)胞的方法（cn105420179a）。該發(fā)明涉及一種從臍帶和胎盤羊膜組織同時(shí)提取上皮細(xì)胞和間充質(zhì)干細(xì)胞的方法，步驟如下：臍帶和胎盤羊膜取材和接種，間充質(zhì)干細(xì)胞和羊膜上皮細(xì)胞在培養(yǎng)瓶中擴(kuò)增和傳代，間充質(zhì)干細(xì)胞和羊膜上皮細(xì)胞的鑒定，細(xì)胞培養(yǎng)傳到第三代時(shí)，胰酶消化后鑒定培養(yǎng)細(xì)胞的純度，驗(yàn)證細(xì)胞純度達(dá)到90％以上，即是符合標(biāo)準(zhǔn)，即得上皮細(xì)胞和間充質(zhì)干細(xì)胞的混合物。
7、上述發(fā)明方法存在同樣步驟多、取樣相對(duì)困難、成本較高等限制，且來源決定了應(yīng)用的受限。
8、通過技術(shù)對(duì)比，本專利申請(qǐng)與上述兩篇專利公開文獻(xiàn)存在較大的不同。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
1、本發(fā)明目的克服現(xiàn)有技術(shù)的不足之處，提供一種低成本、簡單快速、無創(chuàng)地從尿液提取間充質(zhì)干細(xì)胞的方法。此方法可以來源于患者本身，減少了細(xì)胞來源異質(zhì)性問題。為干細(xì)胞治療、基因編輯治療基因遺傳病及重大疑難疾病打下基礎(chǔ)。
2、為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案如下：
3、一種從尿液提取間充質(zhì)干細(xì)胞的方法，步驟如下：
4、（1）尿液取材和接種：
5、?①高溫消毒手術(shù)器械和大玻璃皿，同時(shí)紫外線消毒超凈工作臺(tái)；
6、?②配制培養(yǎng)基：干細(xì)胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基的組成是：dmem/f12/ksfm/regm?bullet?kit/regm?singlequot?kit加完全培養(yǎng)基總體積10％的胎牛血清，1%青霉素-鏈霉素，4℃保存。
7、?所述dmem/f12/ksfm/regm?bullet?kit/regm?singlequot?kit中dmem：f12：ksfm：regm?bullet?kit：regm?singlequot?kit的體積比為1:1:1:1:1。
8、嚴(yán)格篩選供者，排除泌尿系統(tǒng)疾病、傳染病、代謝性疾病和惡性腫瘤；
9、收集健康成人約200?ml新鮮中段尿，操作過程嚴(yán)格遵循無菌操作，避免尿液受到污染。志愿者在留取尿液前洗手（七步洗手法），用碘伏和70%酒精充分清潔消毒尿道外口及周圍（1～3次）。無菌容器（玻璃瓶500?ml，經(jīng)高溫高壓烘干冷卻后使用）內(nèi)預(yù)先放入2.5?ml雙抗及5?ml?fbs，立即轉(zhuǎn)入500ml培養(yǎng)瓶中（經(jīng)高溫高壓烘干冷卻），拿到超凈工作臺(tái)操作。
10、將培養(yǎng)瓶中尿樣即時(shí)分裝至4個(gè)50?ml無菌離心管，1500?r/min室溫離心10?min后棄上清，每管均剩余約0.3～0.5?ml液體，每管加入3?ml干細(xì)胞基礎(chǔ)培養(yǎng)液重懸沉淀。輕輕吹打混勻后的細(xì)胞懸液加至6孔板或者24孔板中，每孔加約0.5?ml懸液和1?ml干細(xì)胞培養(yǎng)液，在培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)，6?h后觀察細(xì)胞貼壁情況，無異常情況下24?h后更換huscs完全培養(yǎng)基（半換液），將未貼壁的細(xì)胞棄除，完成初步篩選。
11、繼續(xù)培養(yǎng)，每隔2天換液，6、24孔板分別加入培養(yǎng)液1、0.5?ml，進(jìn)行不斷地篩選純化。同時(shí)每天通過普通光學(xué)顯微鏡觀察細(xì)胞的形態(tài)、生長情況及細(xì)菌污染情況，若出現(xiàn)細(xì)菌污染及時(shí)清理，待貼壁細(xì)胞融合率至90％時(shí)消化傳代，此為p0代huscs。
12、間充質(zhì)干細(xì)胞的擴(kuò)增和傳代：
13、初次傳代時(shí)，棄除原培養(yǎng)基，用pbs緩沖液洗滌1～2遍后，加入0.5?ml?0.25%胰蛋白酶。37℃孵育2～3?min，以1:1比例轉(zhuǎn)移至6孔板。
14、在培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)，2～3天換液1次，待細(xì)胞融合至90％時(shí)傳代。
15、?胰酶消化傳代：再次傳代時(shí)，以1:?3比例傳代至6孔板。2～3天換液1次，待細(xì)胞融合至90％時(shí)再次傳代。
16、尿液干細(xì)胞的鑒定：
17、干細(xì)胞的生長形態(tài)：細(xì)胞貼壁成纖維樣生長。
18、干細(xì)胞表面抗原的表達(dá)：cd44、cd73高表達(dá)，cd45、hla-dr低表達(dá)或者不表達(dá)。
19、流式細(xì)胞儀驗(yàn)證細(xì)胞純度達(dá)到90％以上，化驗(yàn)排除常見的傳染病，并排除細(xì)菌，支原體污染，即是符合標(biāo)準(zhǔn)，即得上皮細(xì)胞和間充質(zhì)干細(xì)胞的混合物。
20、干細(xì)胞向成脂方向的誘導(dǎo)分化能力。
21、成脂誘導(dǎo)液配制：干細(xì)胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基、胰島素、吲哚美辛、地塞米松、3-異丁基甲基黃嘌呤。
22、?6孔板中第3代的干細(xì)胞融合至80～90％時(shí)，每孔加入2?ml成骨/成脂誘導(dǎo)液，并標(biāo)記。
23、?21天后進(jìn)行油紅o染色和茜素紅染色以判定誘導(dǎo)結(jié)果。
24、尿液干細(xì)胞的冷凍保存和復(fù)蘇方法，步驟如下：
25、?①當(dāng)細(xì)胞傳代至第3代時(shí)胰酶消化、離心，用pbs清洗培養(yǎng)基，0.25%胰蛋白酶消化，每孔用0.5?ml，37℃，2～3?min，待細(xì)胞懸浮后每孔加入0.5?ml?dmem以中和胰酶反應(yīng)。在1500?r/min離心3?min；
26、②再按細(xì)胞密度（1～3）×106/ml懸浮于細(xì)胞凍存液中，分裝到2ml凍存管中，梯度降溫至液氮中。
27、?梯度降溫順序：-20℃?2h；-40℃?2h；-80℃?過夜；液氮。
28、所述細(xì)胞凍存液組成：10％～20％的dmso，70％～80％的人胎牛血清和干細(xì)胞基礎(chǔ)培養(yǎng)液。
29、?使用細(xì)胞前，將凍存管中細(xì)胞在37℃水浴中1?min內(nèi)迅速解凍，加入含有6?ml培養(yǎng)液的15?ml離心管中，1500?r/min離心3?min，再懸浮于pbs中，制備成細(xì)胞密度為（1～3）×106/ml的細(xì)胞懸液以用作包括移植在內(nèi)的實(shí)驗(yàn)和臨床應(yīng)用，使用之前一直保存在4℃。
30、本發(fā)明取得的優(yōu)點(diǎn)和積極效果是：
31、本方法成本低、簡單快速，使用的培養(yǎng)液全部為商業(yè)化，購買使用非常方便。提取周期的前2周使用干細(xì)胞專用培養(yǎng)液，當(dāng)傳代后，獲得了足量的干細(xì)胞時(shí)可更換為普通的dmem培養(yǎng)基，又大大降低了制作成本。其次，取材簡單快速、無創(chuàng)，尿液提取間充質(zhì)干細(xì)胞的方法樣本來源于患者本身，減少了細(xì)胞來源異質(zhì)性問題。為干細(xì)胞治療、基因編輯治療基因遺傳病及重大疑難疾病打下基礎(chǔ)。