本發(fā)明涉及生物。具體地，本發(fā)明涉及一種用于遞送外源目的基因至視網(wǎng)膜、特別是遞送aipl1至視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞和感光細(xì)胞的重組腺相關(guān)病毒載體。通過玻璃體內(nèi)施用或視網(wǎng)膜下施用所述重組腺相關(guān)病毒載體，在視網(wǎng)膜中能夠?qū)崿F(xiàn)外源目的基因的增加且特異性的表達(dá)，由此緩解或治療leber先天性黑朦。

背景技術(shù)：

1、人類超過95％的認(rèn)知活動來源于視覺，視網(wǎng)膜作為視覺處理的第一站，對于光電信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和視覺信息逐級呈遞起到了至關(guān)重要的作用。leber先天性黑朦(lca)是一種嚴(yán)重先天性致盲的視網(wǎng)膜疾病，發(fā)病年齡很早，占遺傳性視網(wǎng)膜疾病的5％以上。患病的個體在出生時或出生后的頭幾個月會被診斷患有眼球震顫、視力嚴(yán)重受損或失明，以及視網(wǎng)膜電圖異?；驘o波形。迄今為止，有20個不同的基因突變導(dǎo)致lca表型，約占所有病例的70％。這些基因包括gucy2d、rpe65、spata7、aipl1、lca5、rpgrip1、crx、crb1、nmnat1、cep290、impdh1、rd3、rdh12、lrat、tulp1、iqcb1、cluap1、prph2、kcnj13和ift140基因。

2、根據(jù)突變基因所在的染色體所處的位置，對17個lca進(jìn)行分類，其中l(wèi)eber先天性黑朦4型(lca4)主要由芳烴相互作用類蛋白1(aryl-hydrocarbon-interacting?protein-like?1，aipl1)突變引起。aipl1基因位于17號染色體，迄今為止已鑒定出79個可導(dǎo)致lca的突變。aipl1包含384個氨基酸，僅在光感受器和松果體中表達(dá)。aipl1有一個n末端fk506結(jié)合蛋白(fkbp)樣結(jié)構(gòu)域，一個三角四肽重復(fù)序列(tetratricopeptide?repeat，tpr)結(jié)構(gòu)域，以及一個在靈長類動物獨特的c末端富含脯氨酸的結(jié)構(gòu)域。aipl1突變是lca4的原因，約占lca的5.3％。

3、在視網(wǎng)膜中，aipl1作為hsp90和環(huán)核苷酸磷酸二酯酶pde6復(fù)合物的分子伴侶，是光轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中必不可少的酶效應(yīng)子。pde6被光激活后通過水解環(huán)gmp(cgmp)，觸發(fā)cgmp依賴性ca2+離子通道的閉合，并通過質(zhì)膜的超極化來傳播“光”電信號。

4、aipl1基因突變破壞aipl1與hsp90或異戊二烯化pde6a(ped6復(fù)合物的一個亞基)的相互作用，影響pde6全酶的組裝，導(dǎo)致pde6亞基快速被蛋白酶體降解。pde6功能降低導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)cgmp升高，環(huán)核苷酸門控通道長時間打開和ca2+過度流入，從而導(dǎo)致光感受器退化，視力變差。

5、目前尚無批準(zhǔn)的針對lca4的治療方法，大多數(shù)情況下，治療方法僅限于視力低下的輔助治療，這些方法沒有解決基本的病理學(xué)問題，也沒有報道會改變臨床病程。因此，本領(lǐng)域需要一種能特異性感染視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞和感光細(xì)胞，并提高外源目的基因如aipl1基因表達(dá)量的用于眼部基因遞送的重組腺相關(guān)病毒載體。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明提供了一種攜帶目的基因表達(dá)框的重組aav病毒載體，所述重組aav病毒載體能特異性感染視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞和感光細(xì)胞，并提高外源目的基因如aipl1基因的表達(dá)量，由此發(fā)揮緩解或治療視網(wǎng)膜疾病(如leber先天性黑朦)的作用。

2、因此，在第一方面，本發(fā)明提供了攜帶外源目的基因的表達(dá)框，所述表達(dá)框包含欲在視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞和感光細(xì)胞特異地表達(dá)的外源目的基因和指導(dǎo)其表達(dá)的調(diào)控序列。

3、在一些實施方案中，本發(fā)明的調(diào)控序列作為分離的核酸分子，包含有效連接的：

4、a.seq?id?no：18所示的irbp增強子序列或者與其具有至少約90％同一性的增強子序列，例如，與其具有約95％、96％、97％、98％、99％或更高的同一性的增強子序列，或者

5、seq?id?no：43所示的cmv增強子序列或者與其具有至少約90％同一性的增強子序列，例如，與其具有約95％、96％、97％、98％、99％或更高的同一性的增強子序列，

6、b.感光細(xì)胞特異性啟動子序列，例如，所述感光細(xì)胞特異性啟動子序列選自：

7、seq?id?no：19所示的視紫紅質(zhì)激酶(rk)啟動子序列，或者與其具有至少約90％同一性的啟動子序列，例如，與其具有約95％、96％、97％、98％、99％或更高的同一性的啟動子序列，

8、seq?id?no：44所示的hirbp啟動子序列，或者與其具有至少約90％同一性的啟動子序列，例如，與其具有約95％、96％、97％、98％、99％或更高的同一性的啟動子序列，

9、seq?id?no：45所示的crx啟動子序列，或者與其具有至少約90％同一性的啟動子序列，例如，與其具有約95％、96％、97％、98％、99％或更高的同一性的啟動子序列，和

10、seq?id?no：46所示的rho啟動子序列，或者與其具有至少約90％同一性的啟動子序列，例如，與其具有約95％、96％、97％、98％、99％或更高的同一性的啟動子序列，

11、或者，

12、組成型啟動子序列，例如，所述組成型啟動子序列選自：

13、seq?id?no：47所示的cba啟動子序列，或者與其具有至少約90％同一性的啟動子序列，例如，與其具有約95％、96％、97％、98％、99％或更高的同一性的啟動子序列，

14、seq?id?no：48所示的ef1α啟動子序列，或者與其具有至少約90％同一性的啟動子序列，例如，與其具有約95％、96％、97％、98％、99％或更高的同一性的啟動子序列，

15、seq?id?no：49所示的ubc啟動子序列，或者與其具有至少約90％同一性的啟動子序列，例如，與其具有約95％、96％、97％、98％、99％或更高的同一性的啟動子序列，

16、seq?id?no：50所示的cmv啟動子序列，或者與其具有至少約90％同一性的啟動子序列，例如，與其具有約95％、96％、97％、98％、99％或更高的同一性的啟動子序列，

17、seq?id?no：51所示的sffv啟動子序列，或者與其具有至少約90％同一性的啟動子序列，例如，與其具有約95％、96％、97％、98％、99％或更高的同一性的啟動子序列，和

18、seq?id?no：52所示的sv40啟動子序列，或者與其具有至少約90％同一性的啟動子序列，例如，與其具有約95％、96％、97％、98％、99％或更高的同一性的啟動子序列，

19、以及

20、c.seq?id?no：20所示的cag內(nèi)含子序列、seq?id?no：53所示的ubc內(nèi)含子序列、seqid?no：54所示的人globin內(nèi)含子序列、seq?id?no：55所示的cmv內(nèi)含子序列、seq?id?no：56所示的ef1α內(nèi)含子序列；seq?id?no：57所示的cmv?globin內(nèi)含子序列、或者與它們分別具有至少約90％同一性的內(nèi)含子序列，例如，與它們分別具有約95％、96％、97％、98％、99％或更高的同一性的內(nèi)含子序列；

21、在一些具體實施方案中，本發(fā)明的調(diào)控序列作為分離的核酸分子包含有效連接的：

22、a.seq?id?no：18所示的irbp增強子序列或者與其具有至少約90％同一性的增強子序列，例如，與其具有約95％、96％、97％、98％、99％或更高的同一性的增強子序列，

23、b.感光細(xì)胞特異性啟動子序列，例如，所述感光細(xì)胞特異性啟動子序列為seq?idno：19所示的視紫紅質(zhì)激酶(rk)啟動子序列，或者與其具有至少約90％同一性的啟動子序列，例如，與其具有約95％、96％、97％、98％、99％或更高的同一性的啟動子序列，以及

24、c.seq?id?no：20所示的cag內(nèi)含子序列或者與其具有至少約90％同一性的內(nèi)含子序列，例如，與其具有約95％、96％、97％、98％、99％或更高的同一性的內(nèi)含子序列。

25、在一些實施方案中，本發(fā)明的外源目的基因表達(dá)框包含有效連接的本發(fā)明的調(diào)控序列和外源目的基因。

26、在一些具體實施方案中，本發(fā)明的外源目的基因表達(dá)框是aipl1基因表達(dá)框。所述aipl1基因表達(dá)框包含有效連接的本發(fā)明的調(diào)控序列和編碼aipl1的核苷酸序列。例如，所述編碼aipl1的核苷酸序列為編碼seq?id?no：5所示的或與seq?id?no：4，或與seq?id?no：3具有至少約90％同一性(例如，約95％、96％、97％、98％、99％或更高的同一性)的aipl1的核苷酸序列，例如，seq?id?no：2-5所示的核苷酸序列。

27、在第二方面，本發(fā)明提供了一種核酸表達(dá)載體，所述核酸表達(dá)載體包含本發(fā)明第一方面所述的外源目的基因表達(dá)框(例如，aipl1基因表達(dá)框)。

28、在一些實施方案中，本發(fā)明的核酸表達(dá)載體在本發(fā)明第一方面所述的外源目的基因表達(dá)框(例如，aipl1基因表達(dá)框)的側(cè)翼是一個或多個反向末端重復(fù)(itr)序列，例如，兩個itr序列，分別為5’itr序列和3’itr序列。在一些實施方案中，本發(fā)明的核酸表達(dá)載體還包含聚腺苷酸化信號序列，例如，人生長激素聚腺苷酸化信號。

29、在第三方面，本發(fā)明提供了重組腺相關(guān)病毒(raav)載體，其包含衣殼和病毒載體基因組，所述病毒載體基因組從5’末端到3’末端包含5’itr序列或其變體、本發(fā)明第一方面所述的外源目的基因表達(dá)框、以及3’itr序列或其變體，任選地，兩個側(cè)翼itr之一是允許產(chǎn)生自互補病毒載體基因組的經(jīng)修飾的aavitr序列，例如，所述itr具有seq?mno：42所示的核苷酸序列。

30、在一些實施方案中，本發(fā)明的raav載體的衣殼包含以下衣殼蛋白中的任一者：aav2衣殼蛋白或其變體、aav5衣殼蛋白或其變體、aav7衣殼蛋白或其變體、aav8衣殼蛋白或其變體、aav9衣殼蛋白或其變體，

31、在一些實施方案中，本發(fā)明的raav載體的衣殼包含aav2衣殼蛋白變體，其中所述aav2衣殼蛋白變體是相對于aav2衣殼蛋白具有587-lalgdvtrpa-588插入片段(seq?id?no：28)，以及i240t和v708i；或具有587-alalgdvtrpa-588插入片段(seq?id?no：32)，以及i240t和v708i；其中所述氨基酸位置參考seq?id?no：38的氨基酸序列位置確定。

32、在一些實施方案中，本發(fā)明的raav載體的衣殼包含aav9衣殼蛋白變體，其中所述aav9衣殼蛋白變體是將aav9衣殼vp1的可變區(qū)viii(584-598aa)的15個功能氨基酸(hqsaqaqaqtgwvqn，seq?id?no：40)突變替換為25個特定氨基酸(lqrgnlalgdvtrparqaatadvnt，seq?id?no：41)，其中所述氨基酸位置參考seq?id?no：39的氨基酸序列位置確定。

33、在第四方面，本發(fā)明提供了一種藥物，其包含本發(fā)明第一方面的基因表達(dá)框、本發(fā)明第二方面的核酸表達(dá)載體、或者本發(fā)明第三方面的raav載體。所述藥物任選地還包含可藥用載體，例如，緩沖劑、稀釋劑或賦形劑。

34、在第五方面，本發(fā)明提供了本發(fā)明第一方面的基因表達(dá)框、本發(fā)明第二方面的核酸表達(dá)載體、或者本發(fā)明第三方面的raav載體的用途，用于制備緩解或治療視網(wǎng)膜退行性眼病，例如，leber先天性黑朦的藥物組合物，優(yōu)選地，通過玻璃體內(nèi)注射或視網(wǎng)膜下注射施用所述藥物組合物。