本發(fā)明涉及一種提高重組膠原蛋白可溶性表達(dá)及穩(wěn)定性的方法，屬于基因工程。

背景技術(shù)：

1、膠原蛋白是哺乳動(dòng)物中含量最多的蛋白質(zhì)，廣泛分布于皮膚、骨骼、肌腱、血管系統(tǒng)、肌肉結(jié)締組織等，至今已發(fā)現(xiàn)28種類型，主要分為纖維性膠原蛋白、網(wǎng)狀膠原蛋白、珠狀絲狀膠原蛋白、錨定纖維蛋白等，其中纖維性膠原蛋白中ⅰ型、ⅱ型、ⅲ型膠原蛋白占人體膠原蛋白的80％～90％。

2、膠原蛋白序列是由重復(fù)肽三聯(lián)體(gly-xaa-yaa)組成，其中xaa和yaa通常是脯氨酸和羥脯氨酸。膠原蛋白的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)是由3條α鏈交錯(cuò)形成聚脯氨酸ⅱ型的左手螺旋構(gòu)象，即三螺旋結(jié)構(gòu)，正確折疊的三螺旋結(jié)構(gòu)對(duì)于膠原蛋白在細(xì)胞外基質(zhì)實(shí)現(xiàn)細(xì)胞與細(xì)胞之間相互作用至關(guān)重要。對(duì)膠原蛋白序列的研究表明膠原蛋白三條鏈的緊密包裝、鏈之間形成的氫鍵、廣泛的水合網(wǎng)絡(luò)以及高含量的脯氨酸和羥脯氨酸是影響膠原蛋白三螺旋結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的重要因素。由于膠原蛋白具有良好的生物學(xué)特性，其在組織工程、臨床醫(yī)學(xué)、食品工業(yè)、包裝材料、化妝品、醫(yī)學(xué)美容、生物材料以及醫(yī)療器械等方面都有著廣泛的應(yīng)用。

3、目前，根據(jù)來源，膠原蛋白主要分為動(dòng)物提取膠原蛋白和重組膠原蛋白。動(dòng)物源膠原蛋白主要來源于陸生動(dòng)物以及海洋動(dòng)物，提取過程復(fù)雜且存在安全隱患。而重組膠原蛋白是將膠原蛋白基因克隆到選定的表達(dá)載體并轉(zhuǎn)化到表達(dá)細(xì)胞內(nèi)，最后通過純化技術(shù)所獲得的蛋白質(zhì)。重組膠原蛋白純度更高、可大批量生產(chǎn)、批次間差異小、有良好的水溶性、可加工性強(qiáng)、無病毒隱患、具有更低的排異反應(yīng)，更重要的是可通過對(duì)重組膠原中的基因序列進(jìn)行修改使其具備更多生物功能，從而在組織工程及再生醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用前景。

4、目前重組膠原蛋白常用的表達(dá)系統(tǒng)有大腸桿菌(escherichia?coli)，大腸桿菌作為研究最為詳盡的原核細(xì)菌，具有遺傳背景清晰、便于遺傳操作以及發(fā)酵周期短、表達(dá)量高等優(yōu)點(diǎn)，是蛋白質(zhì)異源表達(dá)最廣泛的宿主菌。但是由于缺乏翻譯后修飾，重組膠原蛋白往往難以正確折疊形成三螺旋結(jié)構(gòu)。

5、發(fā)明人團(tuán)隊(duì)前期研究中通過膠原蛋白的序列設(shè)計(jì)使得重組膠原蛋白可以正確折疊形成三螺旋結(jié)構(gòu)，齊靜靜碩士論文《仿生微纖維膠原蛋白的設(shè)計(jì)及異源表達(dá)》，通過蛋白質(zhì)計(jì)算分析和熱穩(wěn)定性預(yù)測對(duì)ι型膠原蛋白的α1鏈進(jìn)行分析，選取預(yù)測tm值接近37℃、三股螺旋傾向性高的序列，并在序列的n和c端加入(gpp)10序列，形成具有不同暗條紋長度的周期性明暗相間條紋的帶狀纖維。但是該序列產(chǎn)量低，熱穩(wěn)定性仍有待提高；胡金遠(yuǎn)論文《富脯氨酸膠原蛋白的重組表達(dá)及熱穩(wěn)性研究》，在膠原序列兩端添加(gpp)n(n＝5,10,15),發(fā)現(xiàn)膠原區(qū)域兩端嵌合一定長度的(gpp)n短肽可以促進(jìn)膠原區(qū)域的折疊，但是過長的(gpp)15會(huì)導(dǎo)致膠原區(qū)域無法正確折疊形成三股螺旋結(jié)構(gòu)；cn111333715b公開了一種類i型膠原蛋白纖維的制備方法，以n和c端(gpp)10序列為基礎(chǔ)，在中間插入連續(xù)的gly-xaa-yaa三聯(lián)體的膠原蛋白序列，形成具有周期性明暗相間條紋的帶狀纖維。但是現(xiàn)有技術(shù)均存在蛋白存在表達(dá)量低、穩(wěn)定性差等問題。

6、因此，有必要設(shè)計(jì)出可以提高重組膠原蛋白表達(dá)量，且穩(wěn)定性高、能夠促進(jìn)重組膠原蛋白正確折疊形成三螺旋結(jié)構(gòu)的方法。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、為解決現(xiàn)有技術(shù)膠原蛋白表達(dá)量低、穩(wěn)定性差的問題，本發(fā)明在重復(fù)序列(gpp)10的基礎(chǔ)上，將序列中的部分脯氨酸改造為天冬氨酸和賴氨酸。本發(fā)明的方法和重復(fù)序列改進(jìn)方式，具有通用性，適用于多種膠原蛋白域，改進(jìn)后的重復(fù)序列構(gòu)建得到的膠原蛋白較(gpp)10構(gòu)建得到的膠原蛋白，具有表達(dá)量提高、熱穩(wěn)定性保持或提高、溶解度提高的優(yōu)點(diǎn)，而且同時(shí)還能保持較好的耐鹽性。

2、本發(fā)明的第一個(gè)目的是提供一種膠原蛋白單鏈，所述單鏈包括如第一重復(fù)序列-膠原域-第二重復(fù)序列的結(jié)構(gòu)(如圖10所示)；其中，第一重復(fù)序列和第二重復(fù)序列中至少一個(gè)的氨基酸序列含有如seq?id?no.4(簡稱kd2)或seq?id?no.5(簡稱kd3)所示的序列；且當(dāng)?shù)谝恢貜?fù)序列為seq?id?no.4時(shí)，第二重復(fù)序列為seq?id?no.4或者seq?id?no.3。

3、在一種實(shí)施方式中，所述膠原蛋白單鏈的第一重復(fù)序列和第二重復(fù)序列中，有一條的氨基酸序列如seq?id?no.3(簡稱p10)所示。

4、在一種實(shí)施方式中，所述膠原蛋白單鏈的第一重復(fù)序列的氨基酸序列如seq?idno.5所示，第二重復(fù)序列的氨基酸序列如seq?id?no.3(簡稱p10)所示；

5、或者，膠原蛋白單鏈第一重復(fù)序列的氨基酸序列如seq?id?no.3所示，第二重復(fù)序列的氨基酸序列如seq?id?no.4所示；

6、或者，膠原蛋白單鏈第一重復(fù)序列的氨基酸序列如seq?id?no.3所示，第二重復(fù)序列的氨基酸序列如seq?id?no.5所示；

7、或者，膠原蛋白單鏈的第一重復(fù)序列和第二重復(fù)序列均如seq?id?no.4所示。

8、本發(fā)明的核心要點(diǎn)在于重復(fù)序列的設(shè)計(jì)，可以適用于不同的膠原域，都能產(chǎn)生表達(dá)量提高、穩(wěn)定性提高、溶解度提高中的任意一個(gè)或者多個(gè)效果?？蛇x地，膠原域可以是任一來自人源膠原蛋白的膠原域序列或細(xì)菌膠原蛋白的膠原域序列；比如，所述膠原域序列可以是cn111333715a中公開的膠原域序列，也可以是cn?117186210?a中公開的膠原域序列。

9、在一種實(shí)施方式中，所述膠原域的氨基酸序列如seq?id?no.16～22所示；或者由seq?id?no.16～18中任意兩條氨基酸序列組合得到；或者由seq?id?no.16～22中任一所示氨基酸序列進(jìn)行2～3次重復(fù)得到。可選地，所述膠原域的氨基酸序列是seq?id?no.16和seqid?no.17按照先后順序拼接得到的，或者使用2個(gè)seq?id?no.17拼接得到的。

10、在一種實(shí)施方式中，膠原域的氨基酸序列如seq?id?no.2所示。

11、在一種實(shí)施方式中，所述第一重復(fù)序列的n端還含有折疊域，結(jié)構(gòu)如圖9所示。

12、在一種實(shí)施方式中，折疊域與第一重復(fù)序列間通過酶切位點(diǎn)連接；可選地，所述酶切位點(diǎn)為lvprgsp。

13、在一種實(shí)施方式中，所述折疊域的氨基酸序列如seq?id?no.1所示。

14、在一種實(shí)施方式中，膠原蛋白單鏈的氨基酸序列結(jié)尾還可以添加一個(gè)甘氨酸。

15、在一種實(shí)施方式中，所述膠原蛋白單鏈的氨基酸序列如seq?id?no.6～9任一所示。

16、本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供編碼任一上述膠原蛋白單鏈的基因。

17、本發(fā)明還提供攜帶上述基因的質(zhì)?；蚣?xì)胞。

18、在一種實(shí)施方式中，包括：pcoldiii系列或pet系列的質(zhì)粒。

19、在一種實(shí)施方式中，質(zhì)粒為pcoldiii。

20、在一種實(shí)施方式中，是大腸桿菌細(xì)胞，包括e.coli?bl21、e.coli?bl21(de3)、e.coli?jm109、e.coli?dh5α或e.coli?top10。

21、在一種實(shí)施方式中，宿主細(xì)胞為e.coli?bl21(de3)。

22、本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供一種提高膠原蛋白穩(wěn)定性的方法，在膠原域的n端連接第一重復(fù)序列，c端連接第二重復(fù)序列，構(gòu)建結(jié)構(gòu)為第一重復(fù)序列-膠原域-第二重復(fù)序列(如圖10所示)的膠原蛋白單鏈；其中第一重復(fù)序列或第二重復(fù)序列中至少一個(gè)的氨基酸序列如seq?id?no.4或seq?id?no.5所示。

23、本發(fā)明還提供一種提高膠原蛋白可溶性的方法，在膠原域的n端連接第一重復(fù)序列，c端連接第二重復(fù)序列，構(gòu)建結(jié)構(gòu)為第一重復(fù)序列-膠原域-第二重復(fù)序列(如圖10所示)的膠原蛋白單鏈；其中第一重復(fù)序列或第二重復(fù)序列中至少一個(gè)的氨基酸序列如seq?idno.4或seq?id?no.5所示。

24、本發(fā)明還提供一種提高膠原蛋白產(chǎn)量的方法，在膠原域的n端連接第一重復(fù)序列，c端連接第二重復(fù)序列，構(gòu)建結(jié)構(gòu)為第一重復(fù)序列-膠原域-第二重復(fù)序列(如圖10所示)的膠原蛋白單鏈，并通過宿主細(xì)胞表達(dá)；其中第一重復(fù)序列或第二重復(fù)序列中至少一個(gè)的氨基酸序列如seq?id?no.4或seq?id?no.5所示。

25、本發(fā)明的第四個(gè)目的是提供一種膠原蛋白，由三條結(jié)構(gòu)為第一重復(fù)序列-膠原域-第二重復(fù)序列(如圖10所示)的膠原蛋白單鏈組成；其中，第一重復(fù)序列和第二重復(fù)序列中至少一個(gè)的氨基酸序列還含有如seq?id?no.4(簡稱kd2)或seq?id?no.5(簡稱kd3)所示的序列。

26、在一種實(shí)施方式中，所述膠原蛋白單鏈圍繞一個(gè)共同的中心軸盤繞，構(gòu)成三螺旋結(jié)構(gòu)。

27、在一種實(shí)施方式中，所述膠原蛋白是將上述膠原蛋白單鏈在宿主中進(jìn)行表達(dá)后，酶切去除折疊域而得到的。

28、在一種實(shí)施方式中，所述膠原蛋白單鏈第一重復(fù)序列和第二重復(fù)序列的氨基酸序列均如seq?id?no.4所示；或者，膠原蛋白單鏈第一重復(fù)序列的氨基酸序列如seq?id?no.5所示，第二重復(fù)序列的氨基酸序列如seq?id?no.3所示；或者，膠原蛋白單鏈第一重復(fù)序列的氨基酸序列如seq?id?no.3所示，第二重復(fù)序列的氨基酸序列如seq?id?no.4所示；或者膠原蛋白單鏈第一重復(fù)序列的氨基酸序列如seq?id?no.3所示，第二重復(fù)序列的氨基酸序列如seq?id?no.5所示。

29、本發(fā)明還提供由上述膠原蛋白高聚自組裝形成的膠原蛋白纖維。

30、在一種實(shí)施方式中，所述折疊域、第一重復(fù)序列之間通過酶切位點(diǎn)連接。可選地，所述折疊域和第一重復(fù)序列之間通過lvprgsp連接。

31、本發(fā)明還提供上述膠原單鏈或膠原蛋白或膠原蛋白纖維在制備膠原蛋白產(chǎn)品中的應(yīng)用。

32、本發(fā)明還提供一種膠原蛋白產(chǎn)品，所述產(chǎn)品含有任一上述膠原單鏈或膠原蛋白或膠原蛋白纖維。

33、在一種實(shí)施方式中，膠原蛋白產(chǎn)品還含有維生素、礦物質(zhì)、透明質(zhì)酸、天然多糖、精油、多酚類物質(zhì)、天然植物提取物等。

34、本發(fā)明還提供上述膠原單鏈或膠原蛋白或膠原蛋白纖維在制備膠原蛋白產(chǎn)品中的應(yīng)用。

35、在一種實(shí)施方式中，所述膠原蛋白產(chǎn)品是化妝品、食品或藥物。

36、在一種實(shí)施方式中，所述膠原蛋白產(chǎn)品可以是藥物載體、醫(yī)療用品或美容產(chǎn)品。

37、有益效果：

38、本發(fā)明對(duì)膠原蛋白表達(dá)中的重復(fù)序列進(jìn)行改進(jìn)，將序列中的部分脯氨酸改造為天冬氨酸和賴氨酸。

39、本發(fā)明的方法具有通用性，適用于多種膠原蛋白域。本發(fā)明利用該改造的重復(fù)序列和不同的膠原域構(gòu)建了多個(gè)膠原蛋白單鏈并實(shí)現(xiàn)了膠原蛋白單鏈的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)表達(dá)量均得以提高；純化酶切后得到的純膠原蛋白均具有穩(wěn)定性保持或提高、溶解度提高、保持較好的耐鹽性等特點(diǎn)。

40、本發(fā)明利用該改造重復(fù)序列的方法，得到了多個(gè)膠原蛋白，構(gòu)建得到的膠原蛋白純度達(dá)到90％以上，較未改造、由(gpp)10組成的膠原蛋白(v-p10bp10)相比，產(chǎn)量提高23.6％以上、耐熱溫度提高2℃、溶解性提高，同時(shí)還保持較好的耐鹽性。