本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，特別是針對(duì)一種基于級(jí)聯(lián)反應(yīng)的質(zhì)粒消除模塊。
背景技術(shù)：
1、游離型質(zhì)粒是動(dòng)植物、微生物細(xì)胞遺傳操作的通用平臺(tái)，可用于基因組編輯、異源蛋白表達(dá)、基因電路搭建等目的。但當(dāng)使用基因組編輯或基因電路質(zhì)粒實(shí)現(xiàn)基因組編輯或基因電路設(shè)計(jì)目的后，搭載在質(zhì)粒上的基因組編輯工具或基因電路就成了細(xì)胞基因組的不穩(wěn)定因素，此時(shí)需要對(duì)質(zhì)粒進(jìn)行消除，以獲得無(wú)質(zhì)粒細(xì)胞?，F(xiàn)行的質(zhì)粒消除技術(shù)主要分為3種，分別是溫敏復(fù)制子質(zhì)粒消除、sacb質(zhì)粒消除以及crispr蛋白相關(guān)質(zhì)粒消除技術(shù)。
2、溫敏復(fù)制子質(zhì)粒消除效率偏低，常用于低拷貝質(zhì)粒消除，對(duì)于中高拷貝質(zhì)粒消除效果不佳。且同個(gè)細(xì)胞內(nèi)同種復(fù)制子一般只能同時(shí)服務(wù)一種質(zhì)粒，若用溫敏復(fù)制子服務(wù)多種質(zhì)粒則可能加劇質(zhì)粒的自發(fā)丟失，不利于相關(guān)實(shí)驗(yàn)或生產(chǎn)工作的開(kāi)展；
3、基于sacb基因質(zhì)粒消除能同時(shí)服務(wù)于多個(gè)質(zhì)粒，但當(dāng)多種質(zhì)粒存在細(xì)胞內(nèi)時(shí)，基于sacb基因的質(zhì)粒消除方法無(wú)法準(zhǔn)確的消除特定種類(lèi)的質(zhì)粒，且其對(duì)突變的耐受能力較弱，容易出現(xiàn)失效的情況；
4、crispr蛋白相關(guān)質(zhì)粒消除。基于crispr蛋白的質(zhì)粒消除技術(shù)能夠同時(shí)消除多種質(zhì)粒，并自由選擇需要消除的質(zhì)粒種類(lèi)，但基于crispr蛋白的質(zhì)粒消除技術(shù)存在crispr蛋白基因突變失效或crispr蛋白切割脫靶的風(fēng)險(xiǎn)，且crispr相關(guān)蛋白元件基因序列較長(zhǎng)，不利于在難以轉(zhuǎn)入大質(zhì)粒的底盤(pán)微生物中使用。當(dāng)?shù)妆P(pán)細(xì)胞內(nèi)無(wú)天然crispr蛋白可利用時(shí)，需要額外的轉(zhuǎn)入帶有crispr蛋白的質(zhì)粒，而帶crispr蛋白的質(zhì)粒自靶向消除失敗率較高。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
1、本發(fā)明提出了一種基于反義rna的質(zhì)粒消除技術(shù)，設(shè)計(jì)了質(zhì)粒消除模塊，該模塊能促進(jìn)細(xì)胞中游離型質(zhì)粒發(fā)生丟失，能高效實(shí)現(xiàn)多種游離型質(zhì)粒的選擇消除或同步消除，能應(yīng)用于真核、原核細(xì)胞中的不同種類(lèi)(拷貝數(shù))游離型質(zhì)粒的選擇消除或同步消除，對(duì)于序列突變的耐受性?xún)?yōu)于基于crispr蛋白的質(zhì)粒消除技術(shù)。相關(guān)蛋白元件基因序列長(zhǎng)度小于crispr，對(duì)于難以轉(zhuǎn)入大質(zhì)粒的底盤(pán)細(xì)胞依然適用。
2、針對(duì)代謝關(guān)鍵基因設(shè)計(jì)的反義rna，可以降低該代謝關(guān)鍵基因的表達(dá)，從而影響細(xì)胞生長(zhǎng)速率。在細(xì)胞擴(kuò)增和傳代時(shí)，質(zhì)粒隨機(jī)分配到子代，含有這種消除模塊的質(zhì)粒的子代細(xì)胞數(shù)量會(huì)越來(lái)越少，不含有該消除模塊的質(zhì)粒的子代細(xì)胞因生長(zhǎng)迅速會(huì)變得越來(lái)越多，從而達(dá)到富集無(wú)質(zhì)粒細(xì)胞實(shí)現(xiàn)質(zhì)粒消除的目的。
3、本發(fā)明設(shè)計(jì)的質(zhì)粒消除模塊，除反義rna表達(dá)區(qū)域須部署在待消除質(zhì)粒上以外，其余區(qū)域部署于待消除質(zhì)粒所在的細(xì)胞內(nèi)即可。完成部署后，本發(fā)明設(shè)計(jì)的質(zhì)粒消除模塊可在部署范圍內(nèi)高效的實(shí)現(xiàn)質(zhì)粒消除。
4、本發(fā)明的意義在于提出了一種便捷可用、可編程、適應(yīng)性廣、穩(wěn)定性強(qiáng)、所需序列較短的通用的質(zhì)粒消除模塊構(gòu)建思路，在滿(mǎn)足前置條件的情況下，該質(zhì)粒消除模塊可用于基因工程菌構(gòu)建后的構(gòu)建質(zhì)粒消除、人工構(gòu)建的質(zhì)粒消除。
5、為了實(shí)現(xiàn)上述目標(biāo)，本發(fā)明采用如下的技術(shù)方案：
6、根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，一種基于級(jí)聯(lián)反應(yīng)的質(zhì)粒消除模塊，包括三類(lèi)相互獨(dú)立的表達(dá)區(qū)域，其中一類(lèi)區(qū)域?yàn)榉戳xrna表達(dá)區(qū)域，包括反義rna、反義rna的啟動(dòng)子及終止子構(gòu)成；所述反義rna為代謝關(guān)鍵基因mrna的反義rna，能與代謝關(guān)鍵基因mrna結(jié)合阻礙代謝關(guān)鍵基因mrna翻譯；一類(lèi)區(qū)域?yàn)榉戳x中和rna表達(dá)區(qū)域，包括反義中和rna、反義中和rna的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子及終止子構(gòu)成；最后一類(lèi)區(qū)域?yàn)檗D(zhuǎn)錄因子區(qū)域，由轉(zhuǎn)錄因子片段自帶的組成型啟動(dòng)子，其包括rna聚合酶結(jié)合位點(diǎn)及轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)、核糖體結(jié)合位點(diǎn)、轉(zhuǎn)錄因子翻譯區(qū)、終止子構(gòu)成；所述反義中和rna是與反義rna序列互補(bǔ)，能結(jié)合反義rna使之無(wú)法與代謝關(guān)鍵基因mrna結(jié)合并抑制反義rna對(duì)代謝關(guān)鍵基因mrna產(chǎn)生翻譯阻礙的rna片段。
7、根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例，述的轉(zhuǎn)錄因子為能與特定化合物結(jié)合后，誘導(dǎo)結(jié)合位點(diǎn)下游基因轉(zhuǎn)錄的蛋白質(zhì)；或未與特定化合物結(jié)合前能誘導(dǎo)下游基因轉(zhuǎn)錄，與特定化合物結(jié)合后無(wú)法誘導(dǎo)結(jié)合位點(diǎn)下游基因轉(zhuǎn)錄的蛋白質(zhì)。
8、根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例，所述的轉(zhuǎn)錄因子為阿拉伯糖轉(zhuǎn)錄因子。
9、根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例，所述的轉(zhuǎn)錄因子片段自帶的組成型啟動(dòng)子為阿拉伯糖轉(zhuǎn)錄因子自帶組成型啟動(dòng)子。
10、根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例，所述的反義rna啟動(dòng)子包括j23119啟動(dòng)子、t7、tet、trc、trp、tac以及谷氨酸桿菌常用抗生素氯霉素、卡那霉素、青霉素抗性基因相關(guān)的的組成型啟動(dòng)子、或tef1啟動(dòng)子，所述反義rna終止子包括cyc1終止子、rrnb?t1終止子或rrnb?t2終止子。
11、根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例，所述的反義中和rna誘導(dǎo)型啟動(dòng)子包括gal1啟動(dòng)子、阿拉伯糖啟動(dòng)子，所述反義rna終止子包括cyc1終止子、rrnb?t1終止子或t7終止子。
12、根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例，所述的質(zhì)粒消除模塊搭載于待消除質(zhì)粒中。
13、根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例，所述的待消除質(zhì)粒包括pet28a、pec-xk99e、酵母2μ質(zhì)粒中任意一項(xiàng)。
14、根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例，所述的代謝關(guān)鍵基因?yàn)閠ca循環(huán)相關(guān)基因、蛋白質(zhì)合成相關(guān)基因、有氧呼吸相關(guān)基因、無(wú)氧呼吸相關(guān)基因、脂質(zhì)合成相關(guān)基因、細(xì)胞壁合成相關(guān)基因、糖類(lèi)轉(zhuǎn)運(yùn)途徑相關(guān)基因、氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)途徑相關(guān)基因、atp合成相關(guān)基因、細(xì)胞骨架合成相關(guān)基因、nadph/nadp+合成相關(guān)基因、nadh/nad+合成相關(guān)基因、維生素合成相關(guān)基因、一碳轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)相關(guān)基因、二氧化碳固定相關(guān)基因、dna/rna合成相關(guān)基因、氨基酸合成相關(guān)基因、核糖合成相關(guān)基因、核糖體合成相關(guān)基因、核糖體組裝相關(guān)基因、氨酰trna合成酶相關(guān)基因及上述基因的同工酶基因。
15、根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例，所述質(zhì)粒消除模塊的消除對(duì)象為所有具備穩(wěn)定游離質(zhì)粒、游離質(zhì)粒有一定概率不會(huì)分配給子細(xì)胞、且游離質(zhì)粒消除后不會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞死亡或無(wú)法增殖的微生物、動(dòng)物或植物細(xì)胞。。
16、本發(fā)明提出的質(zhì)粒消除模塊設(shè)計(jì)思路是本發(fā)明創(chuàng)意的核心，該設(shè)計(jì)通過(guò)誘導(dǎo)增加含質(zhì)粒與不含質(zhì)粒的細(xì)胞生長(zhǎng)速率差異，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)質(zhì)粒消除。可應(yīng)用于所有存在自發(fā)丟失現(xiàn)象但自發(fā)丟失效率偏低的質(zhì)粒上。級(jí)聯(lián)反應(yīng)的特點(diǎn)使之便于組成多重信號(hào)系統(tǒng)，進(jìn)行時(shí)序性的生物行為控制。
17、為便于本專(zhuān)業(yè)技術(shù)人員理解本發(fā)明，主要詞匯解釋如下：
18、基因電路：將特定的基因元件如啟動(dòng)子、終止子、蛋白質(zhì)翻譯區(qū)、特定蛋白質(zhì)結(jié)合區(qū)按照一定規(guī)律組合在一起單位點(diǎn)或多位點(diǎn)布置以實(shí)現(xiàn)特定功能的dna序列的組合。
19、便捷可用：該模塊可以以pcr產(chǎn)物/質(zhì)粒等形式保存，可通過(guò)吉布森組裝、金門(mén)克隆、酶切酶連、基因組編輯等形式插入細(xì)胞外或細(xì)胞內(nèi)的質(zhì)粒上。
20、可編程：該模塊的使用不受質(zhì)粒拷貝數(shù)限制，且可通過(guò)組合不同的調(diào)控蛋白在含有復(fù)數(shù)種質(zhì)粒的細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)選擇性消除。
21、適應(yīng)性廣：該模塊可通過(guò)密碼子優(yōu)化/替換相關(guān)控制的元件的形式跨物種使用。
22、穩(wěn)定性強(qiáng)：即使反義rna與目的mrna存在一定的序列偏差也不影響本發(fā)明提出的模塊的功能。
23、所需序列較短：當(dāng)使用細(xì)胞本底調(diào)控因子時(shí)，本發(fā)明提出的質(zhì)粒消除模塊序列總長(zhǎng)通?？尚∮?kbp，甚至小于100bp，當(dāng)自帶調(diào)控因子時(shí)，本發(fā)明提出的質(zhì)粒消除模塊序列總長(zhǎng)通常不會(huì)超過(guò)3kbp。
24、構(gòu)建質(zhì)粒：主要指搭在了基因組編輯必須功能蛋白用于輔助實(shí)現(xiàn)基因工程細(xì)胞基因組編輯目的的工具質(zhì)粒，這類(lèi)質(zhì)粒在完成工程細(xì)胞基因組編輯后通常需要消除，以避免在工程細(xì)胞應(yīng)用中引入或造成額外的突變。
25、人工構(gòu)建質(zhì)粒：主要是指不涉及基因組編輯的、人工搭建的表達(dá)同源/異源蛋白或一些功能基因電路的質(zhì)粒。
26、反義中和rna：與反義rna序列互補(bǔ)，能結(jié)合反義rna使之無(wú)法與代謝關(guān)鍵基因mrna結(jié)合并抑制反義rna對(duì)代謝關(guān)鍵基因mrna翻譯的阻礙。
27、時(shí)序性：可控時(shí)間差的。
28、游離質(zhì)粒：能在細(xì)胞中自主輔助或隨基因組共同復(fù)制，能伴隨細(xì)胞增殖分配給子細(xì)胞，且能穩(wěn)定游離余基因組之外的線性或環(huán)狀雙鏈dna。
29、質(zhì)粒的骨架：搭載質(zhì)粒復(fù)制子與質(zhì)粒維持基因的dna序列。
30、組成型啟動(dòng)子：能被大腸桿菌σ因子識(shí)別并招募rna聚合酶亞基對(duì)下游進(jìn)行轉(zhuǎn)錄的特定dna序列。
31、舉例說(shuō)明如下：
32、大腸桿菌相關(guān)序列：
33、大腸桿菌acnb基因干擾區(qū)全序列：
34、actatgacaatgagagcgaggagaaccgtcgtgctagaagaataccgtaagcacgtagctgagcgtgccgctgaggggattgcgcccaaacccctggatgcaaaccaaatggccgcacttgtagagctgctgaaaaacccgcccgcgggcgaagaagaattcctgttagatctgttaaccaaccgtgttcccccaggcgtcgatgaagccgcctatgtcaaagcaggcttcctggctgctatcgctaaaggcgaagccaaatcccctctgctgactccggaaaaagccatcgaactgctgggcaccatgcagggtggttacaacattcatccgctgatcgacgcgctggatgatgccaaactggcaccgatcgctgccaaagcactttctcacacactgctgatgttcgataacttctatgacgtagaagagaaagcgaaagcaggcaacgaatatgcgaagcaggtaatgcagtcctgggcggatgccgaatggttcctgaatcgcccggcgctggctgaaaaactgaccgttaccgtcttcaaagtcactggcgaaaccaacaccgatgacctctctccggcaccggatgcgtggtcacgcccggatatcccactgcacgcgctggcgatgctgaaaaacgcccgtgaaggcatcgagccagaccagccaggtgttgttggtccgatcaagcaaatcgaagctctgcaacagaaaggtttcccgctggcgtacgtcggtgacgttgtgggtacgggttcatcgcgtaaatccgccacgaactccgtactgtggtttatgggtgatgatattccacatgtgccgaacaaacgcggcggtggtttgtgcctcggcggtaaaattgcaccaatcttctttaacacaatggaagacgcaggtgcactgccaatcgaagtcgacgtctctaacctgaacatgggcgacgtaattgacgtttacccgtacaaaggtgaagtgcgtaaccacgaaaccggcgaactgctggcgaccttcgaactgaaaaccgacgtgctgattgatgaagtgcgtgctggcggccgtattccgctgattattgggcgtggcctgaccaccaaagcgcgtgaagcacttggtctgccgcacagtgatgtgttccgtcaggcgaaagatgtcgctgagagcgatcgcggcttctcgctggcgcaaaaaatggtaggccgtgcctgtggcgtgaaaggcattcgtccgggcgcgtactgcgaaccgaaaatgacttctgtaggctctcaggacaccaccggcccgatgacccgtgatgaactgaaagacctggcgtgcctgggcttctcggctgacctggtgatgcagtctttctgccacaccgcggcgtatccgaagccagttgacgtgaacacgcaccacacgctgccggacttcattatgaaccgtggcggtgtgtcgctgcgtccgggtgacggcgtcattcactcctggctgaaccgtatgctgctgccggataccgtcggtaccggtggtgactcccatacccgtttcccgatcggtatctctttcccggcgggttctggtctggtggcgtttgctgccgcaactggcgtaatgccgctggatatgccggaatccgttctggtgcgcttcaaaggcaaaatgcagccgggcatcaccctgcgcgatctggtacacgcgatcccgctgtatgcgatcaaacaaggtctgctgaccgttgagaagaaaggcaagaaaaacatcttctctggccgcatcctggaaattgaaggtctgccggatctgaaagttgagcaggcctttgagctaaccgatgcgtccgccgagcgttctgccgctggttgtaccatcaagctgaacaaagaaccgatcatcgaatacctgaactctaacatcgtcctgctgaagtggatgatcgcggaaggttacggcgatcgtcgtaccctggaacgtcgtattcagggcatggaaaaatggctggcgaatcctgagctgctggaagccgatgcagatgcggaatacgcggcagtgatcgacatcgatctggcggatattaaagagccaatcctctgtgcaccgaacgacccggacgacgcacgtccgctgtctgcggtacagggcgagaagatcgacgaagtgtttatcggttcctgcatgaccaacatcggtcacttccgtgctgcgggtaaactgctggatgcgcacaaaggccagttgccgacgcgcctgtgggtggcaccgccaacccgtatggatgccgcgcagttgaccgaagaaggctactatagcgtcttcggtaagagcggtgcgcgtatcgagatccctggctgttccctgtgtatgggtaaccaggcgcgtgtagcagacggtgcgacggtggtttccacctctacccgtaacttcccgaaccgtctggggactggcgcgaatgtcttcctggcttctgcggaactggcggctgttgcggcgctgattggcaaactgccgacgccggaagagtaccagacctacgtggcgcaagtagataaaactgccgttgatacttatcgttatctgaacttcaaccagctttctcagtacaccgaaaaagccgatggggtgattttccagactgcggtttaa(seq?id?no：1)
35、pet28a質(zhì)粒全序列：
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106、aacgccggaacattagtgcaggcagcttccacagcaatggcatcctggtcatccagcgg
107、atagttaatgatcagcccactgacgcgttgcgcgagaagattgtgcaccgccgctttac
108、aggcttcgacgccgcttcgttctaccatcgacaccaccacgctggcacccagttgatcg
109、gcgcgagatttaatcgccgcgacaatttgcgacggcgcgtgcagggccagactggagg
110、tggcaacgccaatcagcaacgactgtttgcccgccagttgttgtgccacgcggttggga
111、atgtaattcagctccgccatcgccgcttccactttttcccgcgttttcgcagaaacgtgg
112、ctggcctggttcaccacgcgggaaacggtctgataagagacaccggcatactctgcgac
113、atcgtataacgttactggtttcacattcaccaccctgaattgactctcttccgggcgctat
114、catgccataccgcgaaaggttttgcgccattcgatggtgtccgggatctcgacgctctcc
115、cttatgcgactcctgcattaggaagcagcccagtagtaggttgaggccgttgagcaccg
116、ccgccgcaaggaatggtgcatgcaaggagatggcgcccaacagtcccccggccacggg
117、gcctgccaccatacccacgccgaaacaagcgctcatgagcccgaagtggcgagcccga
118、tcttccccatcggtgatgtcggcgatataggcgccagcaaccgcacctgtggcgccggt
119、gatgccggccacgatgcgtccggcgtagaggatcgagatctcgatcccgcgaaattaat
120、acgactcactataggggaattgtgagcggataacaattcccctctagaaataattttgtt
121、taactttaagaaggagatataccatgtaacaaagcccgaaaggaagctgagttggctgc
122、tgccaccgctgagcaataactagcataaccccttggggcctctaaacgggtcttgaggggttttttgctgaaaggaggaactatatccggat(seq?id?no：2)
123、阿拉伯糖啟動(dòng)子序列(箭頭為轉(zhuǎn)錄起始方向)：
124、aagaaaccaattgtccatattgcatcagacattgccgtcactgcgtcttttactggctcttctcgctaaccaaaccggtaaccccgcttattaaaagcattctgtaacaaagcgggaccaaagccatgacaaaaacgcgtaacaaaagtgtctataatcacggcagaaaagtccacattgattatttgcacggcgtcacactttgctatgccatagcatttttatccataagattagcggatcctacctgacgctttttatcgcaactctctactgtttctccat→(seq?idno：3)
125、t7終止子序列(箭頭為轉(zhuǎn)錄終止方向)：
126、→ctagcataaccccttggggcctctaaacgggtcttgaggggttttttg(seq?id?no：4)
127、阿拉伯糖轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)框(包含啟動(dòng)子、cds區(qū)、終止子)：
128、ggatttctgttcatgggggtaatgataccgatggcgcacatttccccgaaaagtgccacctgcatcgatttattatgacaacttgacggctacatcattcactttttcttcacaaccggcacggaactcgctcgggctggccccggtgcattttttaaatacccgcgagaaatagagttgatcgtcaaaaccaacattgcgaccgacggtggcgataggcatccgggtggtgctcaaaagcagcttcgcctggctgatacgttggtcctcgcgccagcttaagacgctaatccctaactgctggcggaaaagatgtgacagacgcgacggcgacaagcaaacatgctgtgcgacgctggcgatatcaaaattgctgtctgccaggtgatcgctgatgtactgacaagcctcgcgtacccgattatccatcggtggatggagcgactcgttaatcgcttccatgcgccgcagtaacaattgctcaagcagatttatcgccagcagctccgaatagcgcccttccccttgcccggcgttaatgatttgcccaaacaggtcgctgaaatgcggctggtgcgcttcatccgggcgaaagaaccccgtattggcaaatattgacggccagttaagccattcatgccagtaggcgcgcggacgaaagtaaacccactggtgataccattcgcgagcctccggatgacgaccgtagtgatgaatctctcctggcgggaacagcaaaatatcacccggtcggcaaacaaattctcgtccctgatttttcaccaccccctgaccgcgaatggtgagattgagaatataacctttcattcccagcggtcggtcgataaaaaaatcgagataaccgttggcctcaatcggcgttaaacccgccaccagatgggcattaaacgagtatcccggcagcaggggatcattttgcgcttcagccatacttttcatactcccgccattcagagaagaaaccaattgtccatattgcatcagacattgccgtcactgcgtcttttactggctcttctcgctaaccaaaccggtaaccccgcttattaaaagcattctgtaacaaagcgggaccaaagccatgacaaaaacgcgtaacaaaagtgtct(seq?id?no：5)
129、j23119啟動(dòng)子：
130、ttgacagctagctcagtcctaggtataatgctagc→(seq?id?no：6)
131、rrnb?t1終止子：
132、caaataaaacgaaaggctcagtcgaaagactgggcctttcgttttatctgttgtttgtcggtgaacgctctc(seq?id?no：7)
133、谷氨酸棒桿菌相關(guān)序列：
134、谷氨酸棒桿菌acn基因cds區(qū)全序列：
135、ttggagctcactgtgactgaaagcaagaactccttcaatgctaagagcacccttgaagttggcgacaagtcctatgactacttcgccctctctgcagtgcctggcatggagaagctgccgtactccctcaaggttctcggagagaaccttcttcgtaccgaagacggcgcaaacatcaccaacgagcacattgaggctatcgccaactgggatgcatcttccgatccaagcatcgaaatccagttcaccccagcccgtgttctcatgcaggacttcaccggtgtcccttgtgtagttgacctcgcaaccatgcgtgaggcagttgctgcactcggtggcgaccctaacgacgtcaacccactgaacccagccgagatggtcattgaccactccgtcatcgtggaggctttcggccgcccagatgcactggctaagaacgttgagatcgagtacgagcgcaacgaggagcgttaccagttcctgcgttggggttccgagtccttctccaacttccgcgttgttcctccaggaaccggtatcgtccaccaggtcaacattgagtacttggctcgcgtcgtcttcgacaacgagggccttgcatacccagatacctgcatcggtaccgactcccacaccaccatggaaaacggcctgggcatcctgggctggggcgttggtggcattgaggctgaagcagcaatgctcggccagccagtgtccatgctgatccctcgcgttgttggcttcaagttgaccggcgagatcccagtaggcgttaccgcaactgacgttgtgctgaccatcaccgaaatgctgcgcgaccacggcgtcgtccagaagttcgttgagttctacggctccggtgttaaggctgttccactggctaaccgtgcaaccatcggcaacatgtccccagagttcggctccacctgtgcgatgttcccaatcgacgaggagaccaccaagtacctgcgcctcaccggccgcccagaagagcaggttgcactggtcgaggcttacgccaaggcgcagggcatgtggctcgacgaggacaccgttgaagctgagtactccgagtacctcgagctggacctgtccaccgttgttccttccatcgctggccctaagcgcccacaggaccgcatccttctctccgaggcaaaggagcagttccgtaaggatctgccaacctacaccgacgacgctgtttccgtagacacctccatccctgcaacccgcatggttaacgaaggtggcggacagcctgaaggcggcgtcgaagctgacaactacaacgcttcctgggctggctccggcgagtccttggctactggcgcagaaggacgtccttccaagccagtcaccgttgcatccccacagggtggcgagtacaccatcgaccacggcatggttgcaattgcatccatcacctcttgcaccaacacctctaacccatccgtgatgatcggcgctggcctgatcgcacgtaaggcagcagaaaagggcctcaagtccaagccttgggttaagaccatctgtgcaccaggttcccaggttgtcgacggctactaccagcgcgcagacctctggaaggaccttgaggccatgggcttctacctctccggcttcggctgcaccacctgtattggtaactccggcccactgccagaggaaatctccgctgcgatcaacgagcacgacctgaccgcaaccgcagttttgtccggtaaccgtaacttcgagggacgtatctcccctgacgttaagatgaactacctggcatccccaatcatggtcattgcttacgcaatcgctggcaccatggacttcgacttcgagaacgaagctcttggacaggaccaggacggcaacgacgtcttcctgaaggacatctggccttccaccgaggaaatcgaagacaccatccagcaggcaatctcccgtgagctttacgaagctgactacgcagatgtcttcaagggtgacaagcagtggcaggaactcgatgttcctaccggtgacaccttcgagtgggacgagaactccacctacatccgcaaggcaccttacttcgacggcatgcctgtcgagccagtggcagtcaccgacatccagggcgcacgcgttctggctaagctcggcgactctgtcaccaccgaccacatctcccctgcttcctccattaagccaggtacccctgcagctcagtacttggatgagcacggtgtggaacgccacgactacaactccctgggttccaggcgtggtaaccacgaggtcatgatgcgcggcaccttcgccaacatccgcctccagaaccagctggttgacatcgcaggtggctacacccgcgacttcacccaggagggtgctccacaggcgttcatctacgacgcttccgtcaactacaaggctgctggcattccgctggtcgtcttgggcggcaaggagtacggcaccggttcttcccgtgactgggcagctaagggcactaacctgctcggaattcgcgcagttatcaccgagtccttcgagcgtattcaccgctccaacctcatcggtatgggcgttgtcccactgcagttccctgcaggcgaatcccacgagtccctgggccttgacggcaccgagaccttcgacatcaccggactgaccgcactcaacgagggcgagactcctaagactgtcaaggtcaccgcaaccaaggagaacggcgacgtcgtcgagttcgacgcagttgtccgcatcgacaccccaggtgaggctgactactaccgccacggcggcatcctgcagtacgtgctgcgtcagatggctgcttcttctaagtaa(seq?id?no：8)
136、谷氨酸棒桿菌pec-xk99e質(zhì)粒序列：
137、gaattcgagctcggtacccggggatcctctagagtcgacctgcaggcatgcaagcttggctgttttggcggatgagagaagattttcagcctgatacagattaaatcagaacgcagaagcggtctgataaaacagaatttgcctggcggcagtagcgcggtggtcccacctgaccccatgccgaactcagaagtgaaacgccgtagcgccgatggtagtgtggggtctccccatgcgagagtagggaactgccaggcatcaaataaaacgaaaggctcagtcgaaagactgggcctttcgttttatctgttgtttgtcggtgaacgctctcctgagtaggacaaatccgccgggagcggatttgaacgttgcgaagcaacggcccggagggtggcgggcaggacgcc
138、cgccataaactgccaggcatcaaattaagcagaaggccatcctgacggatggccttttt
139、gcgtttctacaaactctttttgtttatttttctaaatacattcaaatatgtatccgctcatg
140、aattaattccgctagatgacgtgcggcttcgacctcctgggcgtggcgcttgttggcgc
141、gctcgcggctggctgcggcacgacacgcgtctgagcagtattttgcgcgccgtcctcgt
142、gggtcaggccggggtgggatcaggccaccgcagtaggcgcagctgatgcgatcctcca
143、ctactgcgcgtcctcctggcgctgccgagcacgcagctcgtcggccagctcttcaaggt
144、cggccacaagcgtttctaggtcgctcgcggcacttgcccagtcgcgtgatgctggcgcg
145、tctgtcgtatcgagggcgcggaaaaatccgatcaccgtttttaaatcgacggcggcatc
146、gagtgcgtcggactccagcgcgacatcggagagatccaccgctgatgcttcaggccag
147、ttttggtacttcgtcgtgaaggtcatgacaccattataacgaacgttcgttaaaaattct
148、agccccaattctgataatttcttccggcactcctgcgaaaacctgcgagacttcttgccc
149、agaaaaaacgccaagcgcagcggttaccgcactttttttccaggtgatttcaccctgac
150、cagcgaagcggcactttagtgcatgaggtgtgcccctggtttcccctctttggagggtt
151、caacccaaaaaagcacacaagcaaaaatgaaaatcatcatgagcaagttggtgcgaag
152、cagcaacgcgctagctccaaaaaggtctccaggatctcgaggagatttttgaggggga
153、gggagtcgaggaagagccagagcagaaggcggggaaccgttctctgccgacagcgtg
154、agccccccttaaaaatcaggccggggaggaaccggggagggatcagagctaggagcg
155、agacaccctaaagggggggaaccgttttctgctgacggtgtttcgtttattagttttcag
156、cccgtggatagcggagggtgagggcaagtgagagccagagcaaggacgggaccccta
157、aaggggggaaccgttttctgctgacggtgtttcgtttattagttttcagcccgtggacg
158、gccgcgtttagcttccattccaagtgcctttctgacttgttggatgcgcctttcactgac
159、acctagttcgcctgcaagctcacgagtcgagggatcagcaaccgattgagaacgggca
160、tccaggatcgcagttttgacgcgaagttcgagcaactcgcctgtcatttctcggcgttt
161、gtttgcttccgctaatcgctgtcgcgtctcctgcgcatacttactttctgggtcagcccat
162、ctgcgtgcattcgatgtagctgcgccccgtcgccccatcgtcgctagagctttccgccct
163、cggctgctctgcgtttccacccgacgagcagggacgactggctggcctttagccacgta
164、gccgcgcacacgacgcgccatcgtcaggcgatcacgcatggcgggaagatccggctcc
165、cggccgtctgcaccgaccgcctgggcaacgttgtacgccacttcatacgcgtcgatgat
166、cttggcatcttttaggcgctcaccagcagctttgagctggtatcccacggtcaacgcgt
167、ggcgaaacgcggtctcgtcgcgcgctcgctctggatttgtccagagcactcgcacgccg
168、tcgatcaggtcgccggacgcgtccagggcgctcggcaggctcgcgtccaaaatcgcta
169、gcgccttggcttctgcggtggcgcgttgtgccgcttcaatgcgggcgcgtccgctggaa
170、aagtcctgctcaatgtactttttcggcttctgtgatccggtcatcgttcgagcaatctcca
171、ttaggtcggccagccgatccacacgatcatgctggcagtgccatttataggctgtcggat
172、cgtctgagacgtgcagcggccaccggctcagcctatgcgaaaaagcctggtcagcgcc
173、gaaaacacgagtcatttcttccgtcgttgcagccagcaggcgcatatttgggctggtttt
174、acctgctgcggcatacaccgggtcaatgagccagatgagctggcatttcccgctcagcg
175、gattcacgccgatccaagccggcgctttttctaggcgtgcccatttctctaaaatcgcgt
176、agacctgcgggtttacgtgctcaatcttcccgccggcctggtggctgggcacatcgatg
177、tcaagcacgatcaccgcggcatgttgcgcgtgcgtcagcgcaacgtactggcaccgcgt
178、cagcgcttttgagccagcccggtagagctttggttgggtttcgccggtatccgggttttt
179、aatccaggcgctcgcgaaatctcttgtcttgctgccctggaagctttcgcgtcccaggt
180、gagcgagcagttcgcggcgatcttctgccgtccagccgcgtgagccgcagcgcatagct
181、tcggggtgggtgtcgaacagatcggcggacaatttccacgcgctagctgtgactgtgtc
182、ctgcggatcggctagagtcatgtcttgagtgctttctcccagctgatgactgggggttag
183、ccgacgccctgtgagttcccgctcacggggcgttcaactttttcaggtatttgtgcagct
184、tatcgtgttttcttcgtaaatgaacgcttaactaccttgttaaacgtggcaaataggcag
185、gattgatggggatctagcttcacgctgccgcaagcactcagggcgcaagggctgctaaa
186、ggaagcggaacacgtagaaagccagtccgcagaaacggtgctgaccccggatgaatgt
187、cagctactgggctatctggacaagggaaaacgcaagcgcaaagagaaagcaggtagct
188、tgcagtgggcttacatggcgatagctagactgggcggttttatggacagcaagcgaacc
189、ggaattgccagctggggcgccctctggtaaggttgggaagccctgcaaagtaaactgg
190、atggctttcttgccgccaaggatctgatggcgcaggggatcaagatctgatcaagagac
191、aggatgaggatcgtttcgcatgattgaacaagatggattgcacgcaggttctccggccg
192、cttgggtggagaggctattcggctatgactgggcacaacagacaatcggctgctctgat
193、gccgccgtgttccggctgtcagcgcaggggcgcccggttctttttgtcaagaccgacct
194、gtccggtgccctgaatgaactccaagacgaggcagcgcggctatcgtggctggccacg
195、acgggcgttccttgcgcagctgtgctcgacgttgtcactgaagcgggaagggactggc
196、tgctattgggcgaagtgccggggcaggatctcctgtcatctcaccttgctcctgccgag
197、aaagtatccatcatggctgatgcaatgcggcggctgcatacgcttgatccggctacctgc
198、ccattcgaccaccaagcgaaacatcgcatcgagcgagcacgtactcggatggaagccg
199、gtcttgtcgatcaggatgatctggacgaagagcatcaggggctcgcgccagccgaactg
200、ttcgccaggctcaaggcgcggatgcccgacggcgaggatctcgtcgtgacccatggcga
201、tgcctgcttgccgaatatcatggtggaaaatggccgcttttctggattcatcgactgtgg
202、ccggctgggtgtggcggaccgctatcaggacatagcgttggctacccgtgatattgctg
203、aagagcttggcggcgaatgggctgaccgcttcctcgtgctttacggtatcgccgctccc
204、gattcgcagcgcatcgccttctatcgccttcttgacgagttcttctgagcgggactctgg
205、ggttcgcggaatcatgaccaaaatcccttaacgtgagttttcgttccactgagcgtcag
206、accccgtagaaaagatcaaaggatcttcttgagatcctttttttctgcgcgtaatctgct
207、gcttgcaaacaaaaaaaccaccgctaccagcggtggtttgtttgccggatcaagagct
208、accaactctttttccgaaggtaactggcttcagcagagcgcagataccaaatactgtcc
209、ttctagtgtagccgtagttaggccaccacttcaagaactctgtagcaccgcctacatacc
210、tcgctctgctaatcctgttaccagtggctgctgccagtggcgataagtcgtgtcttaccg
211、ggttggactcaagacgatagttaccggataaggcgcagcggtcgggctgaacgggggg
212、ttcgtgcacacagcccagcttggagcgaacgacctacaccgaactgagatacctacagc
213、gtgagctatgagaaagcgccacgcttcccgaagggagaaaggcggacaggtatccggt
214、aagcggcagggtcggaacaggagagcgcacgagggagcttccagggggaaacgcctg
215、gtatctttatagtcctgtcgggtttcgccacctctgacttgagcgtcgatttttgtgatgc
216、tcgtcaggggggcggagcctatggaaaaacgccagcaacgcggcctttttacggttcct
217、ggccttttgctggccttttgctcacatgttctttcctgcgttatcccctgattctgtggat
218、aaccgtattaccgcctttgagtgagctgataccgctcgccgcagccgaacgaccgagcg
219、cagcgagtcagtgagcgaggaagcggaagagcgcctgatgcggtattttctccttacgc
220、atctgtgcggtatttcacaccgcatatggtgcactctcagtacaatctgctctgatgccgc
221、atagttaagccagtatacactccgctatcgctacgtgactgggtcatggctgcgccccga
222、cacccgccaacacccgctgacgcgccctgacgggcttgtctgctcccggcatccgctta
223、cagacaagctgtgaccgtctccgggagctgcatgtgtcagaggttttcaccgtcatcac
224、cgaaacgcgcgaggcagcagatcaattcgcgcgcgaaggcgaagcggcatgcatttac
225、gttgacaccatcgaatggtgcaaaacctttcgcggtatggcatgatagcgcccggaaga
226、gagtcaattcagggtggtgaatgtgaaaccagtaacgttatacgatgtcgcagagtatg
227、ccggtgtctcttatcagaccgtttcccgcgtggtgaaccaggccagccacgtttctgcg
228、aaaacgcgggaaaaagtggaagcggcgatggcggagctgaattacattcccaaccgcg
229、tggcacaacaactggcgggcaaacagtcgttgctgattggcgttgccacctccagtctg
230、gccctgcacgcgccgtcgcaaattgtcgcggcgattaaatctcgcgccgatcaactggg
231、tgccagcgtggtggtgtcgatggtagaacgaagcggcgtcgaagcctgtaaagcggcg
232、gtgcacaatcttctcgcgcaacgcgtcagtgggctgatcattaactatccgctggatgac
233、caggatgccattgctgtggaagctgcctgcactaatgttccggcgttatttcttgatgtc
234、tctgaccagacacccatcaacagtattattttctcccatgaagacggtacgcgactgggc
235、gtggagcatctggtcgcattgggtcaccagcaaatcgcgctgttagcgggcccattaag
236、ttctgtctcggcgcgtctgcgtctggctggctggcataaatatctcactcgcaatcaaat
237、tcagccgatagcggaacgggaaggcgactggagtgccatgtccggttttcaacaaacc
238、atgcaaatgctgaatgagggcatcgttcccactgcgatgctggttgccaacgatcagat
239、ggcgctgggcgcaatgcgcgccattaccgagtccgggctgcgcgttggtgcggatatct
240、cggtagtgggatacgacgataccgaagacagctcatgttatatcccgccgtcaaccacca
241、tcaaacaggattttcgcctgctggggcaaaccagcgtggaccgcttgctgcaactctct
242、cagggccaggcggtgaagggcaatcagctgttgcccgtctcactggtgaaaagaaaaa
243、ccaccctggcgcccaatacgcaaaccgcctctccccgcgcgttggccgattcattaatgc
244、agctggcacgacaggtttcccgactggaaagcgggcagtgagcgcaacgcaattaatg
245、tgagttagcgcgaattgatctggtttgacagcttatcatcgactgcacggtgcaccaatg
246、cttctggcgtcaggcagccatcggaagctgtggtatggctgtgcaggtcgtaaatcact
247、gcataattcgtgtcgctcaaggcgcactcccgttctggataatgttttttgcgccgacat
248、cataacggttctggcaaatattctgaaatgagctgttgacaattaatcatccggctcgtataatgtgtggaattgtgagcggataacaatttcacacaggaaacagaccatg(seq?id?no：9)
249、阿拉伯糖啟動(dòng)子序列(箭頭為轉(zhuǎn)錄起始方向)：
250、aagaaaccaattgtccatattgcatcagacattgccgtcactgcgtcttttactggctcttctcgctaaccaaaccggtaaccccgcttattaaaagcattctgtaacaaagcgggaccaaagccatgacaaaaacgcgtaacaaaagtgtctataatcacggcagaaaagtccacattgattatttgcacggcgtcacactttgctatgccatagcatttttatccataagattagcggatcctacctgacgctttttatcgcaactctctactgtttctccat→(seq?idno：10)
251、t7終止子序列(箭頭為轉(zhuǎn)錄終止方向)：
252、→ctagcataaccccttggggcctctaaacgggtcttgaggggttttttg(seq?id?no：11)
253、阿拉伯糖轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)框(包含啟動(dòng)子、cds區(qū)、終止子)：
254、ggatttctgttcatgggggtaatgataccgatggcgcacatttccccgaaaagtgccacctgcatcgatttattatgacaacttgacggctacatcattcactttttcttcacaaccggcacggaactcgctcgggctggccccggtgcattttttaaatacccgcgagaaatagagttgatcgtcaaaaccaacattgcgaccgacggtggcgataggcatccgggtggtgctcaaaagcagcttcgcctggctgatacgttggtcctcgcgccagcttaagacgctaatccctaactgctggcggaaaagatgtgacagacgcgacggcgacaagcaaacatgctgtgcgacgctggcgatatcaaaattgctgtctgccaggtgatcgctgatgtactgacaagcctcgcgtacccgattatccatcggtggatggagcgactcgttaatcgcttccatgcgccgcagtaacaattgctcaagcagatttatcgccagcagctccgaatagcgcccttccccttgcccggcgttaatgatttgcccaaacaggtcgctgaaatgcggctggtgcgcttcatccgggcgaaagaaccccgtattggcaaatattgacggccagttaagccattcatgccagtaggcgcgcggacgaaagtaaacccactggtgataccattcgcgagcctccggatgacgaccgtagtgatgaatctctcctggcgggaacagcaaaatatcacccggtcggcaaacaaattctcgtccctgatttttcaccaccccctgaccgcgaatggtgagattgagaatataacctttcattcccagcggtcggtcgataaaaaaatcgagataaccgttggcctcaatcggcgttaaacccgccaccagatgggcattaaacgagtatcccggcagcaggggatcattttgcgcttcagccatacttttcatactcccgccattcagagaagaaaccaattgtccatattgcatcagacattgccgtcactgcgtcttttactggctcttctcgctaaccaaaccggtaaccccgcttattaaaagcattctgtaacaaagcgggaccaaagccatgacaaaaacgcgtaacaaaagtgtct(seq?id?no：12)
255、trc啟動(dòng)子：
256、ttgacaattaatcatccggctcgtataatg→(seq?id?no：13)
257、rrnb?t2終止子：
258、→agaaggccatcctgacggatggcctttt(seq?id?no：14)
259、釀酒酵母相關(guān)序列：
260、釀酒酵母aco1/glu1基因cds區(qū)全序列：
261、atgctgtctgcacgttctgccatcaagagacccattgttcgtggtcttgcgacagtctccaacttgactagagattcaaaagtcaaccaaaacttattagaagatcattcttttattaactacaagcagaatgtggaaacgctggatatcgtaagaaaaagattaaacaggccatt
262、tacctacgcggaaaagattttgtacggtcacttggatgaccctcatggtcaagatattca
263、gagaggtgtttcatacctaaaattaagaccagatcgtgttgcctgtcaagatgctactgc
264、tcaaatggctattttacaatttatgtccgctggtttaccacaggttgctaagccagtcact
265、gtccactgtgaccatttgattcaagcacaagttggtggtgaaaaagatttgaagagagc
266、tatagatctaaacaaggaagtttatgatttcttggcctctgccactgcgaaatataacatg
267、ggtttctggaagccaggttccggtatcattcaccaaattgttctggaaaactacgctttc
268、ccaggtgctttgatcattggtactgactcccatacaccaaatgctggtggtttaggtcaa
269、ttggctattggtgttggtggtgctgatgccgttgatgttatggcaggtcgtccatgggaa
270、ttgaaggctccaaagatcttaggtgttaagttgactggtaagatgaacggttggacttc
271、tccaaaggatattattttgaaattggctggtatcacaactgtcaaaggtggtactggtaa
272、aattgttgaatatttcggtgatggtgttgacaccttctccgctactggtatgggtaccatt
273、tgtaatatgggtgctgaaatcggtgctaccacatctgttttcccattcaacaaatctatga
274、ttgaatatttggaagcaactggtcgtggtaagatcgctgactttgctaaattataccaca
275、aggacctattatctgctgataaggatgctgaatacgatgaggtcgtcgaaattgacttga
276、acactctggaaccatacatcaatgggccatttacccccgatttggctactccagtttcta
277、agatgaaggaagttgctgttgctaataactggccattggatgtcagagtcggtttgatc
278、ggttcttgtaccaattcctcttatgaagatatgtctcgttcagcatccattgtcaaggatg
279、ctgctgctcatggtttgaaatccaagaccattttcactgttactccaggttctgaacaaa
280、tcagagccactattgaacgtgatggccaattagaaaccttcaaagaatttggtggtatcg
281、ttttggcaaacgcctgtggcccatgtattggtcaatgggatcgtagagatatcaagaaag
282、gtgacaagaatactatcgtttcctcttacaacagaaatttcacttctagaaatgatggta
283、acccacaaactcatgcttttgttgcatctccagaattagtaactgcgttcgccattgcgg
284、gtgatttgagattcaaccctctaacagacaaattaaaggacaaggatggtaatgagttc
285、atgttgaaaccaccacatggtgatggtttgcctcaaagaggttatgatgctggtgagaa
286、cacttaccaagctccacctgcagaccgtagcaccgttgaagttaaagtttctccaactt
287、cagaccgtctacaactgttgaaaccattcaaaccttgggatggtaaggatgctaaagac
288、atgccaatcttgattaaggccgtcggtaagacaactactgatcatatttctatggctggtc
289、catggttgaaatacagaggtcatttagaaaacatttctaataactatatgattggtgctat
290、taatgctgaaaacaagaaggctaactgtgttaaaaatgtatatactggtgaatacaaag
291、gtgttccagacactgctagagattacagagaccaaggtatcaagtgggttgttattggt
292、gatgaaaactttggtgaaggttcctctcgtgaacacgctgctttggaaccaagattctt
293、gggcggtttcgctatcatcacaaagtctttcgctcgtatccatgaaactaacttgaaaaa
294、acaaggtctattgccattgaacttcaagaacccagctgactatgacaagatcaaccctg
295、atgacagaatcgatattctgggtctagctgaattggctccaggtaagcctgtaacaatga
296、gagttcatccaaagaatggtaagccatgggatgctgtgttgacccatactttcaacgatg
297、agcaaattgaatggttcaaatatggttctgccttaaataaaattaaggccgatgagaagaaataa(seqid?no：15)
298、釀酒酵母2u穿梭質(zhì)粒序列：
299、caactttgtatagaaaagttgacggattagaagccgccgagcgggtgacagccctccgaaggaagactctcctccgtgcgtcctcgtcttcaccggtcgcgttcctgaaacgcagatgtgcctcgcgccgcactgctccgaacaataaagattctacaatactagcttttatggttatgaagaggaaaaattggcagtaacctggccccacaaaccttcaaatgaacgaatcaaattaacaaccataggatgataatgcgattagttttttagccttatttctggggtaattaatcagcgaagcgatgatttttgatctattaacagatatataaatgcaaaaactgcataaccactttaactaatactttcaacattttcggtttgtattacttcttattcaaatgtaataaaagtatcaacaaaaaattgttaatatacctctatactttaacgtcaaggagaaaaaacccaagtttgtacaaaaaagcaggctgccaccatggtgagcaagggcgaggagctgttcaccggggtggtgcccatcctggtcgagctggacggcgacgtaaacggccacaagttcagcgtgtccggcgagggcgagggcgatgccacctacggcaagctgaccctgaagttcatctgcaccaccggcaagctgcccgtgccctggcccaccctcgtgaccaccctgacctacggcgtgcagtgcttcagccgctaccccgaccacatgaagcagcacgacttcttcaagtccgccatgcccgaaggctacgtccaggagcgcaccatcttcttcaaggacgacggcaactacaagacccgcgccgaggtgaagttcgagggcgacaccctggtgaaccgcatcgagctgaagggcatcgacttcaaggaggacggcaacatcctggggcacaagctggagtacaactacaacagccacaacgtctatatcatggccgacaagcagaagaacggcatcaaggtgaacttcaagatccgccacaacatcgaggacggcagcgtgcagctcgccgaccactaccagcagaacacccccatcggcgacggccccgtgctgctgcccgacaaccactacctgagcacccagtccgccctgagcaaagaccccaacgagaagcgcgatcacatggtcctgctggagttcgtgaccgccgccgggatcactctcggcatggacgagctgtacaagtaaacccagctttcttgtacaaagtggtagcggccgctcgagcatgcatctagagggccgcatcatgtaattagttatgtcacgcttacattcacgccctccccccacatccgctctaaccgaaaaggaaggagttagacaacctgaagtctaggtccctatttatttttttatagttatgttagtattaagaacgttat
300、ttatatttcaaatttttcttttttttctgtacagacgcgtgtacgcatgtaacattatactg
301、aaaaccttgcttgagaaggttttgggacgctcgaaggctttaatttgcaagctgcggcc
302、ctgcattaatgaatcggccaacgcgcggggagaggcggtttgcgtattgggcgctcttc
303、cgcttcctcgctcactgactcgctgcgctcggtcgttcggctgcggcgagcggtatcag
304、ctcactcaaaggcggtaatacggttatccacagaatcaggggataacgcaggaaagaac
305、atgtgagcaaaaggccagcaaaaggccaggaaccgtaaaaaggccgcgttgctggcg
306、tttttccataggctccgcccccctgacgagcatcacaaaaatcgacgctcaagtcagag
307、gtggcgaaacccgacaggactataaagataccaggcgtttccccctggaagctccctcg
308、tgcgctctcctgttccgaccctgccgcttaccggatacctgtccgcctttctcccttcgg
309、gaagcgtggcgctttctcatagctcacgctgtaggtatctcagttcggtgtaggtcgttc
310、gctccaagctgggctgtgtgcacgaaccccccgttcagcccgaccgctgcgccttatcc
311、ggtaactatcgtcttgagtccaacccggtaagacacgacttatcgccactggcagcagc
312、cactggtaacaggattagcagagcgaggtatgtaggcggtgctacagagttcttgaagt
313、ggtggcctaactacggctacactagaagaacagtatttggtatctgcgctctgctgaag
314、ccagttaccttcggaaaaagagttggtagctcttgatccggcaaacaaaccaccgctgg
315、tagcggtggtttttttgtttgcaagcagcagattacgcgcagaaaaaaaggatctcaag
316、aagatcctttgatcttttctacggggtctgacgctcagtggaacgaaaactcacgttaa
317、gggattttggtcatgagattatcaaaaaggatcttcacctagatccttttaaattaaaaat
318、gaagttttaaatcaatctaaagtatatatgagtaaacttggtctgacagttaccaatgctt
319、aatcagtgaggcacctatctcagcgatctgtctatttcgttcatccatagttgcctgactc
320、cccgtcgtgtagataactacgatacgggagggcttaccatctggccccagtgctgcaatg
321、ataccgcgagacccacgctcaccggctccagatttatcagcaataaaccagccagccgg
322、aagggccgagcgcagaagtggtcctgcaactttatccgcctccatccagtctattaattg
323、ttgccgggaagctagagtaagtagttcgccagttaatagtttgcgcaacgttgttgccat
324、tgctacaggcatcgtggtgtcacgctcgtcgtttggtatggcttcattcagctccggttc
325、ccaacgatcaaggcgagttacatgatcccccatgttgtgcaaaaaagcggttagctcct
326、tcggtcctccgatcgttgtcagaagtaagttggccgcagtgttatcactcatggttatgg
327、cagcactgcataattctcttactgtcatgccatccgtaagatgcttttctgtgactggtga
328、gtactcaaccaagtcattctgagaatagtgtatgcggcgaccgagttgctcttgcccgg
329、cgtcaatacgggataataccgcgccacatagcagaactttaaaagtgctcatcattggaa
330、aacgttcttcggggcgaaaactctcaaggatcttaccgctgttgagatccagttcgatg
331、taacccactcgtgcacccaactgatcttcagcatcttttactttcaccagcgtttctggg
332、tgagcaaaaacaggaaggcaaaatgccgcaaaaaagggaataagggcgacacggaaa
333、tgttgaatactcatactcttcctttttcaatgggtaataactgatataattaaattgaagct
334、ctaatttgtgagttgagtatacatgcatttacttataatacagtttttcagaagaactcgt
335、caagaaggcgatagaaggcgatgcgctgcgaatcgggagcggcgataccgtaaagcac
336、gaggaagcggtcagcccattcgccgccaagctcttcagcaatatcacgggtagccaacg
337、ctatgtcctgatagcggtccgccacacccagccggccacagtcgatgaatccagaaaag
338、cggccattttccaccatgatattcggcaagcaggcatcgccatgggtcacgacgagatcc
339、tcgccgtcgggcatgctcgccttgagcctggcgaacagttcggctggcgcgagcccctg
340、atgctcttcgtccagatcatcctgatcgacaagaccggcttccatccgagtacgtgctcg
341、ctcgatgcgatgtttcgcttggtggtcgaatgggcaggtagccggatcaagcgtatgca
342、gccgccgcattgcatcagccatgatggatactttctcggcaggagcaaggtgagatgac
343、aggagatcctgccccggcacttcgcccaatagcagccagtcccttcccgcttcagtgac
344、aacgtcgagcacagctgcgcaaggaacgcccgtcgtggccagccacgatagccgcgct
345、gcctcgtcttgcagttcattcagggcaccggacaggtcggtcttgacaaaaagaaccg
346、ggcgcccctgcgctgacagccggaacacggcggcatcagagcagccgattgtctgttg
347、tgcccagtcatagccgaatagcctctccacccaagcggccggagaacctgcgtgcaatc
348、catcttgttcaatcatgatttatcttcgtttcctgcaggtttttgttctgtgcagttgggtt
349、aagaatactgggcaatttcatgtttctttcaacactacatatgcgtatatataccaatctaa
350、gtctgtgctccttccttcgttcttccttctgttcggagattaccgaatcaaaaaaatttc
351、aaggaaaccgaaatcaaaaaaaagaataaaaaaaaaatgatgaattgaaaagctagct
352、tatcgatgataagctgtcaaacatgagaattaattccacggactatagactatacctagta
353、tactccgtctactgtacgatacacttccgctcaggtccttgtcctttaacgaggccttac
354、cactcttttgttactctattgatccagctcagcaaaggcagtgtgatctaagattctatct
355、tcgcgatgtagtaaaactagctagaccgagaaagagactagaaatgcaaaaggcactt
356、ctacaatggctgccatcattattatccgatgtgacgctgcagcttctcaatgatattcgaa
357、tacgctttgaggagatacagcctaatatccgacaaactgttttacagatttacgatcgta
358、cttgttacccatcattgaattttgaacatccgaacctgggagttttccctgaaacagata
359、gtatatttgaacctgtataataatatatagtctagcgctttacggaagacaatgtatgtatt
360、tcggttcctggagaaactattgcatctattgcataggtaatcttgcacgtcgcatccccg
361、gttcattttctgcgtttccatcttgcacttcaatagcatatctttgttaacgaagcatctg
362、tgcttcattttgtagaacaaaaatgcaacgcgagagcgctaatttttcaaacaaagaat
363、ctgagctgcatttttacagaacagaaatgcaacgcgaaagcgctattttaccaacgaag
364、aatctgtgcttcatttttgtaaaacaaaaatgcaacgcgagagcgctaatttttcaaaca
365、aagaatctgagctgcatttttacagaacagaaatgcaacgcgagagcgctattttacca
366、acaaagaatctatacttcttttttgttctacaaaaatgcatcccgagagcgctatttttct
367、aacaaagcatcttagattactttttttctcctttgtgcgctctataatgcagtctcttgat
368、aactttttgcactgtaggtccgttaaggttagaagaaggctactttggtgtctattttct
369、cttccataaaaaaagcctgactccacttcccgcgtttactgattactagcgaagctgcgg
370、gtgcattttttcaagataaaggcatccccgattatattctataccgatgtggattgcgcat
371、actttgtgaacagaaagtgatagcgttgatgattcttcattggtcagaaaattatgaacg
372、gtttcttctattttgtctctatatactacgtataggaaatgtttacattttcgtattgttttc
373、gattcactctatgaatagttcttactacaatttttttgtctaaagagtaatactagagata
374、aacataaaaaatgtagaggtcgagtttagatgcaagttcaaggagcgaaaggtggatg
375、ggtaggttatatagggatatagcacagagatatatagcaaagagatacttttgagcaatgt
376、ttgtggaagcggtattcgcaatgggaagctccaccccggttgataatcagaaaagcccc
377、aaaaacaggaagattgtataagcaaatatttaaattgtaagcgttaatattttgttaaaat
378、tcgcgttaaatttttgttaaatcagctcattttttaaccaataggccgaaatcggcaaaat
379、cccttataaatcaaaagaatagaccgagatagggttgagtgttgttccagtttggaaca
380、agagtccactattaaagaacgtggactccaacgtcaaagggcgaaaaaccgtctatca
381、gggcgatggcccactacgtgaaccatcaccctaatcaagttttttggggtcgaggtgcc
382、gtaaagcactaaatcggaaccctaaagggagcccccgatttagagcttgacggggaaa
383、gccggcgaacgtggcgagaaaggaagggaagaaagcgaaaggagcgggcgctaggg
384、cgctggcaagtgtagcggtcacgctgcgcgtaaccaccacacccgccgcgcttaatgcgccgctacagggcgcgtggggatcgatccactagt(seq?id?no：16)
385、釀酒酵母硫酸新霉素抗性基因序列(包含啟動(dòng)子、表達(dá)框、終止子)：
386、gtgagttgagtatacatgcatttacttataatacagtttttcagaagaactcgtcaagaaggcgatagaaggcgatgcgctgcgaatcgggagcggcgataccgtaaagcacgaggaagcggtcagcccattcgccgccaagctcttcagcaatatcacgggtagccaacgctatgtcctgatagcggtccgccacacccagccggccacagtcgatgaatccagaaaagcggccattttccaccatgatattcggcaagcaggcatcgccatgggtcacgacgagatcctcgccgtcgggcatgctcgccttgagcctggcgaacagttcggctggcgcgagcccctgatgctcttcgtccagatcatcctgatcgacaagaccggcttccatccgagtacgtgctcgctcgatgcgatgtttcgcttggtggtcgaatgggcaggtagccggatcaagcgtatgcagccgccgcattgcatcagccatgatggatactttctcggcaggagcaaggtgagatgacaggagatcctgccccggcacttcgcccaatagcagccagtcccttcccgcttcagtgacaacgtcgagcacagctgcgcaaggaacgcccgtcgtggccagccacgatagccgcgctgcctcgtcttgcagttcattcagggcaccggacaggtcggtcttgacaaaaagaaccgggcgcccctgcgctgacagccggaacacggcggcatcagagcagccgattgtctgttgtgcccagtcatagccgaatagcctctccacccaagcggccggagaacctgcgtgcaatccatcttgttcaatcatgatttatcttcgtttcctgcaggtttttgttctgtgcagttgggttaagaatactgggcaatttcatgtttctttcaacactacatatgcgtatatataccaatctaagtctgtgctccttccttcgttcttccttctg(seq?idno：17)
387、穿梭載體大腸桿菌復(fù)制子序列：
388、tttccataggctccgcccccctgacgagcatcacaaaaatcgacgctcaagtcagaggtggcgaaacccgacaggactataaagataccaggcgtttccccctggaagctccctcgtgcgctctcctgttccgaccctgccgcttaccggatacctgtccgcctttctcccttcgggaagcgtggcgctttctcatagctcacgctgtaggtatctcagttcggtgtaggtcgttcgctccaagctgggctgtgtgcacgaaccccccgttcagcccgaccgctgcgccttatccggtaactatcgtcttgagtccaacccggtaagacacgacttatcgccactggcagcagccactggtaacaggattagcagagcgaggtatgtaggcggtgctacagagttcttgaagtggtggcctaactacggctacactagaagaacagtatttggtatctgcgctctgctgaagccagttaccttcggaaaaagagttggtagctcttgatccggcaaacaaaccaccgctggtagcggtggtttttttgtttgcaagcagcagattacgcgcagaaaaaaaggatctcaa(seq?id?no：18)
389、穿梭載體氨芐青霉素抗性基因表達(dá)框(包含啟動(dòng)子、表達(dá)框、終止子)：
390、ggatcttcacctagatccttttaaattaaaaatgaagttttaaatcaatctaaagtatatatgagtaaacttggtctgacagttaccaatgcttaatcagtgaggcacctatctcagcgatctgtctatttcgttcatccatagttgcctgactccccgtcgtgtagataactacgatacgggagggcttaccatctggccccagtgctgcaatgataccgcgagacccacgctcaccggctccagatttatcagcaataaaccagccagccggaagggccgagcgcagaagtggtcctgcaactttatccgcctccatccagtctattaattgttgccgggaagctagagtaagtagttcgccagttaatagtttgcgcaacgttgttgccattgctacaggcatcgtggtgtcacgctcgtcgtttggtatggcttcattcagctccggttcccaacgatcaaggcgagttacatgatcccccatgttgtgcaaaaaagcggttagctccttcggtcctccgatcgttgtcagaagtaagttggccgcagtgttatcactcatggttatggcagcactgcataattctcttactgtcatgccatccgtaagatgcttttctgtgactggtgagtactcaaccaagtcattctgagaatagtgtatgcggcgaccgagttgctcttgcccggcgtcaatacgggataataccgcgccacatagcagaactttaaaagtgctcatcattggaaaacgttcttcggggcgaaaactctcaaggatcttaccgctgttgagatccagttcgatgtaacccactcgtgcacccaactgatcttcagcatcttttactttcaccagcgtttctgggtgagcaaaaacaggaaggcaaaatgccgcaaaaaagggaataagggcgacacggaaatgttgaatactcatactcttcctttttcaatgggtaataactgatataattaaattgaagctctaatttgtgagttgagtatacatgc(seq?id?no：19)
391、釀酒酵母誘導(dǎo)型啟動(dòng)子gal1序列：
392、acggattagagccgccgagcgacgagcgagcggagcgcagcagcgccgaaggaagactctcctccgtgcgctcctcgtctcgtcttcaccggtcgtcgtcctgaaacgagatgtgtgcctcgcgccgcactgctccgaacaataatacaataaagattctacaatactagctatggttatggttatgaagagaaaaatggcagtacctggccccaaacctcaaatgaacgaatcaattaacaaccataggatgatgataatgcgattagttagcttattctatttctggggtaattaatcagcgaagcgatgatgattttgatctattacagatatataatgcaaaactgcataaccacttaactaactaatataatactttcaacattttcgtgttgattacttcttatcaaatgtaatacaaaaattgtaatatatacctatactactactacttaacgtcaaggagacc(seq?id?no：20)
393、酵母終止子cyc1序列：
394、atcatgtaattagttatgtcacgcttacattcacgccctccccccacatccgctctaaccgaaaaggaaggagttagacaacctgaagtctaggtccctatttatttttttatagttatgttagtattaagaacgttatttatatttcaaatttttcttttttttctgtacagacgcgtgtacgcatgtaacattatactgaaaaccttgcttgagaaggttttgggacgctcgaaggctttaatttgcaagct(seq?id?no：21)
395、釀酒酵母組成型啟動(dòng)子tef1序列：
396、ccacacaccatagcttcaaaatgtttctactccttttttactcttccagattttctcggactccgcgcatcgccgtaccacttcaaaacacccaagcacagcatactaaatttcccctctttcttcctctagggtgtcgttaattacccgtactaaaggtttggaaaagaaaaaagagaccgcctcgtttctttttcttcgtcgaaaaaggcaataaaaatttttatcacgtttctttttcttgaaaatttttttttttgatttttttctctttcgatgacctcccattgatatttaagttaataaacggtcttcaatttctcaagtttcagtttcatttttcttgttctattacaactttttttacttcttgctcattagaaagaaagcatagcaatctaatctaag(seq?id?no：22)
397、本發(fā)明的有益效果在于：本發(fā)明設(shè)計(jì)了一種基于反義rna的、模塊化的質(zhì)粒消除技術(shù)，構(gòu)建質(zhì)粒消除模塊所需元件簡(jiǎn)單易得，質(zhì)粒模塊消除效率高，可根據(jù)需要自由設(shè)置消除對(duì)象，可實(shí)現(xiàn)多種質(zhì)粒的選擇性或同步消除。且本發(fā)明應(yīng)用范圍廣，真核原核生物中均可應(yīng)用該技術(shù)，中心代謝途徑相關(guān)基因皆可結(jié)合反義rna用于質(zhì)粒消除，中心代謝途徑之外的氨基酸、核酸、脂質(zhì)合成途徑、轉(zhuǎn)錄翻譯、dna復(fù)制、細(xì)胞壁、細(xì)胞膜、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等代謝相關(guān)基因的反義rna同樣可應(yīng)用于本技術(shù)，若消除效果不佳還可通過(guò)增加反義rna種類(lèi)、延長(zhǎng)反義rna長(zhǎng)度等策略強(qiáng)化消除效果。