本發(fā)明的主題是試劑盒以及使用所述試劑盒的夾心型方法，其用于對樣本中的靶核酸進(jìn)行靈敏且穩(wěn)健的檢測。本發(fā)明還涉及根據(jù)本發(fā)明的試劑盒或方法的用途，例如用于疾病或病癥的分子診斷。本發(fā)明屬于分子生物學(xué)測定領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

1、核酸被認(rèn)為是如癌癥或感染等疾病的重要標(biāo)志物，然而由于其以極低濃度存在，其檢測可能是困難的。

2、疾病相關(guān)的核酸生物標(biāo)志物通常以超低豐度存在，因此對主要在大量生物流體中的分析物進(jìn)行精確且穩(wěn)健的檢測對于生物學(xué)研究、精準(zhǔn)醫(yī)療和早期診斷非常重要。covid-19的大流行揭示了對用于控制迅速發(fā)展的大流行的快速、高靈敏度和高特異性檢測方法的迫切需要。在臨床診斷中，由于對在懸浮液中超低濃度rna分子的檢測具有挑戰(zhàn)性，因此尚未應(yīng)用對嚴(yán)重急性呼吸綜合征冠狀病毒2(sars-cov-2)的直接核酸檢測。直接檢測受到來自非特異性蛋白質(zhì)、核酸或其他生物分子的強(qiáng)背景的限制。

3、在分子診斷中，有各自具有特定優(yōu)勢的兩類測定：(1)靶標(biāo)放大測定和(2)信號放大測定。靶標(biāo)放大測定如pcr是靈敏的，但需要進(jìn)行靶標(biāo)提取和純化、酶促反應(yīng)，并且更容易出現(xiàn)假陽性。相反，信號放大測定更簡單，因為它們傾向于跳過核酸純化和酶促放大。因此，材料損失更少且假陽性率更低。然而，與基于pcr的靶標(biāo)放大方法相比，信號放大測定的靈敏度較低。已投入了許多努力開發(fā)檢測未放大核酸的超靈敏信號放大測定。與rt-pcr相比，潛在的便攜式微流控裝置顯示出對埃博拉核酸的特異且靈敏的檢測(cai,h.等人,2015)。有意思的是，這些工作中的一些能夠直接從全血裂解物中檢測靶核酸(ngo,h.t.等人，2018)(zheng,z.等人，2006)。

4、迄今為止，用于covid-19診斷的推薦方法是基于需要從咽拭子中提取核酸并進(jìn)行靶標(biāo)放大程序的定量反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(qrt-pcr)的。此類程序需要技術(shù)人員、特定設(shè)備和長處理時間(＞2h)，使得現(xiàn)場sars-cov-2核酸檢測難以實施。此外，對商業(yè)rna提取試劑盒的高需求導(dǎo)致了這些試劑的短缺，因此開發(fā)了幾種跨越長的中間rna提取步驟的診斷工作流程。在過去的十年中，幾項研究顯示了磁珠在分子檢測之前從生物流體中提取核酸的性能。磁珠由嵌入聚合物基體中的氧化鐵納米顆粒組成，并且能夠根據(jù)表面功能化不同地分離核酸。這種功能化影響結(jié)合動力學(xué)以及與分子檢測策略的相容性。例如，二氧化硅包被的珠通過靜電作用非選擇地結(jié)合所有核酸，因此它們主要用于耐受高濃度非靶標(biāo)背景核酸的檢測方法，如rt-pcr。寡核苷酸偶聯(lián)珠，如寡(dt)珠或具有特定序列的表面功能化的珠，用于mrna靶標(biāo)提取，并具有高回收率。這種純化可以手動使用、在微流控芯片內(nèi)使用或在自動化機(jī)器人設(shè)置中使用。除了核酸的分離和洗脫之外，已通過使用不同材料(例如生物素-抗生物素蛋白、蛋白-酶、熒光染料、量子點等)的雜交測定在珠表面直接檢測到了幾種特定核酸序列。然而，這些方法大多受到低信號強(qiáng)度或快速光漂白的限制(lim等人，2009年)。

5、ep3536806“oligonucleotide-functionalized?hydrophobic?polymernanoparticles”描述了包含疏水聚合物和發(fā)光組分的納米顆粒，作為供能元件，其可用于檢測靶核酸。所述納米顆?？膳c寡核苷酸偶聯(lián)，所述寡核苷酸與特定靶標(biāo)或靶標(biāo)的非特異性序列互補(bǔ)。靶標(biāo)特異性寡核苷酸與供能元件綴合，并且它們的核苷酸序列與標(biāo)記有激發(fā)能量受體化合物的另一核苷酸序列互補(bǔ)。在所述納米顆粒的受體化合物與供體化合物之間發(fā)生fret(熒光共振能量轉(zhuǎn)移)效應(yīng)。在所述方法中使用這些納米顆粒的檢測下限是靶核苷酸的濃度為5pm。

6、wo?2017/220453描述了使用磁珠檢測突變。磁珠結(jié)合探針與靶核酸的一端雜交，并且表面結(jié)合探針與所述靶核酸的另一端雜交。通過磁力和/或溫度對雜交復(fù)合物施加嚴(yán)格性。

7、仍需要簡單、快速、靈敏且穩(wěn)健的方法來檢測超低豐度的核酸。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、在本工作中，發(fā)明人旨在開發(fā)用于檢測來自樣本的低豐度核酸分子的夾心雜交方法。根據(jù)本發(fā)明的方法涉及雜交，其中通過使用特異性結(jié)合靶核酸不同區(qū)域的不同互補(bǔ)寡核苷酸的雙重直接雜交來檢測感興趣的核酸。

2、根據(jù)本發(fā)明的方法結(jié)合了：

3、·使用序列特異性探針與溶液中的靶標(biāo)的基于固體表面的雜交來捕獲靶核酸分子，其中捕獲探針固定在固體基材上，以允許以最少的處理直接從原始樣本中分離和富集靶標(biāo)分子，和

4、·至少第二序列特異性捕獲，其允許通過與超亮發(fā)光顆粒結(jié)合而在所述固體表面上直接檢測。

5、使用基于固體表面的雜交捕獲靶核酸分子涉及固體表面，其可以是固定化表面或固體顆粒的表面，固體顆粒如珠，例如磁珠或玻璃珠。復(fù)雜珠/靶標(biāo)的分離可通過例如施加磁力或重力、離心或過濾來實現(xiàn)，這取決于所述固體表面的性質(zhì)。這種分離對于去除過量的非結(jié)合dna修飾的納米探針和/或超亮發(fā)光顆粒是重要的。甚至從細(xì)胞裂解物中分離所述感興趣的靶核酸而不需要rna提取也是有用的。熒光信號的檢測通過熒光定量直接在固體表面進(jìn)行，因為熒光顆粒通過互補(bǔ)雜交與靶標(biāo)結(jié)合。

6、本發(fā)明的試劑盒和方法適用于檢測樣本如環(huán)境樣本或生物樣本中的靶核酸。根據(jù)本發(fā)明的試劑盒和方法也適用于診斷應(yīng)用。

7、根據(jù)本發(fā)明的試劑盒和方法的優(yōu)點是它們極高的靈敏度、它們的穩(wěn)健性和簡單性、以及它是無酶的擴(kuò)增檢測測定。

8、實際上，根據(jù)本發(fā)明的試劑盒和方法允許精確和穩(wěn)健地檢測核酸，檢測限為約1fm。發(fā)光顆粒的極端亮度對于通過簡單技術(shù)實現(xiàn)快速檢測靶標(biāo)的高信噪比至關(guān)重要。

9、此外，與根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)的檢測試劑盒和方法一樣，可以檢測和分離低豐度的靶核酸分子，而不需要補(bǔ)充的核酸提取步驟。

10、靶核酸分子可以是任何核酸分子，包括雙鏈dna分子和單鏈dna分子以及雙鏈rna分子和單鏈rna分子，并且包括長度短和長度長的核酸分子。使用本發(fā)明的試劑盒或方法可檢測點突變。

11、超亮顆粒亮度和高濃度的互補(bǔ)寡核苷酸附著于珠和超亮發(fā)光顆粒，是本發(fā)明的試劑盒和測試的巨大優(yōu)點，以提高核酸的檢測限。實際上，使用熒光讀板儀時，本發(fā)明測定的檢測限約為1fm。與現(xiàn)有技術(shù)測試相比，這代表了檢測限的顯著提高。根據(jù)本發(fā)明的試劑盒和測試能夠檢測不同長度的rna和dna，并可用于檢測樣本中的核酸。例如，根據(jù)本發(fā)明的試劑盒和測試可用于診斷疾病或用于檢測環(huán)境樣本中的病原體，例如寄生蟲。

12、本發(fā)明使得能夠在有限數(shù)量的步驟中進(jìn)行靶核酸檢測和從其原始培養(yǎng)基中對所述靶核酸的提取的步驟。擬定的檢測非常靈敏，因為其檢測極限約為1fm。本發(fā)明不需要擴(kuò)增，特別是通過pcr，也不需要使用酶。本發(fā)明使得能夠使用發(fā)光信號的直接檢測來檢測從長度短的微rna到長度長的核酸的核酸。

13、最后，根據(jù)本發(fā)明的測試產(chǎn)生的熒光信號可以通過使用讀板儀來讀取，這加速了大規(guī)模樣本中核酸的檢測。

14、在特別實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的方法利用了將使用基于珠、特別是基于磁珠的固體表面雜交的捕獲與超亮熒光顆粒相組合的協(xié)同作用。

15、在另一個特別實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的試劑盒和方法利用了將使用基于固體表面的雜交的捕獲與通過使用超亮熒光dna-納米顆粒(dna?np)的檢測相組合的協(xié)同作用，例如wo?2017/220453所公開的。

16、在第一方面，本發(fā)明涉及用于樣本中靶核酸的夾心測試檢測的試劑盒。在第二方面，本發(fā)明涉及使用本發(fā)明的試劑盒對樣本中的靶核酸進(jìn)行夾心測試檢測的方法。