本發(fā)明涉及一種細(xì)胞培養(yǎng)插入件，特別涉及一種用于3d細(xì)胞培養(yǎng)方法中的細(xì)胞培養(yǎng)插入件。

背景技術(shù)：

1、在實驗室中培養(yǎng)細(xì)胞和組織在藥物開發(fā)、醫(yī)學(xué)及其他領(lǐng)域中具有許多潛在應(yīng)用。在進行藥物開發(fā)研究中，最常見的機制之一是使用動物模型。然而，這存在諸多缺點。動物不能很好地預(yù)測人類對藥物反應(yīng)。由于小鼠等實驗室動物與人類之間存在遺傳和代謝差異，成功率非常低，在動物中測試的治療方法中，只有不到5％能成功進入人體試驗。

2、動物模型的替代方案是使用工程化人類組織。然而，目前的3d細(xì)胞培養(yǎng)方法涉及非常昂貴且復(fù)雜的生物反應(yīng)器，許多實驗室由于費用或運行和維護能力的原因無法使用。另外，目前的3d細(xì)胞培養(yǎng)方法通量較低，因為它們通常一次只能生成2或3個組織工程化肌肉。這無法滿足制藥行業(yè)的需求，因為他們需要高通量平臺來篩選大量候選藥物。目前的高通量肌肉培養(yǎng)方法涉及在二維(2d)方向(單層)上培養(yǎng)細(xì)胞。在二維中培養(yǎng)肌肉細(xì)胞意味著組織的結(jié)構(gòu)與在體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的并不相同。因此，使用二維培養(yǎng)意味著人類疾病模型不夠準(zhǔn)確，或者當(dāng)用于治療受試者時，工程化組織無法準(zhǔn)確匹配其被移植到的組織。

3、在研究之外，移植工程化組織可用于治療容積性肌肉損失、食管缺損、腹部缺損或運動損傷等病癥。然而，目前的二維組織培養(yǎng)方法并未很好適合這種情況。例如，對于肌肉組織，二維培養(yǎng)未精確復(fù)制受試者肌肉的結(jié)構(gòu)，或未呈現(xiàn)出如收縮性等功能成熟標(biāo)志。另外，目前的工程化肌肉組織培養(yǎng)技術(shù)在可生長組織的尺寸方面存在限制，最大長度約為2厘米。工程化肌肉組織培養(yǎng)技術(shù)也很昂貴，并且需要高端專業(yè)設(shè)備，這對許多機構(gòu)來說造成限制。

4、細(xì)胞培養(yǎng)的其他用途包括生產(chǎn)基于實驗室的肉類產(chǎn)品。目前這是一個正在經(jīng)歷大量增長的領(lǐng)域，因為基于實驗室的肉類產(chǎn)品相較于使用動物具有多種優(yōu)勢。例如，基于實驗室的肉類產(chǎn)品不涉及宰殺牲畜，因此可以被認(rèn)為更符合倫理；另外，用于生產(chǎn)肉制品的設(shè)備空間利用效率更高，這使得基于實驗室的肉制品在空間緊張的環(huán)境中具有應(yīng)用潛力。目前，基于實驗室的肉類生產(chǎn)方法非常昂貴，需要大量空間，并且在成為可行的食物來源方面還面臨其他挑戰(zhàn)。

5、本發(fā)明旨在解決或改善其中一個或多個問題。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、根據(jù)本發(fā)明的第一方面，提供了一種用于培養(yǎng)組織的插入件，包括：

2、基座，其包括溝槽，所述溝槽被配置為對添加待培養(yǎng)細(xì)胞提供引導(dǎo)；

3、第一支柱，其從所述基座直立延伸(upstand)并被配置為支撐第一錨定件；以及

4、第二支柱，其從所述基座直立延伸并被配置為支撐第二錨定件，

5、其中，所述插入件被配置為使得細(xì)胞可以利用用于支撐的錨定件在第一支柱和第二支柱之間進行培養(yǎng)以形成組織。

6、基座包括溝槽，所述溝槽被配置為對添加待培養(yǎng)細(xì)胞提供引導(dǎo)。細(xì)胞可以添加到溝槽本身中，或者接種在預(yù)先注入在溝槽中的水凝膠的頂部。溝槽可以在第一和第二支柱之間延伸，并穿過基座的中心。如前所述，該溝槽為用戶向插入件添加細(xì)胞時提供引導(dǎo)。有利地，這使得用戶能夠在插入件中接種細(xì)胞，以便在培養(yǎng)過程中細(xì)胞在兩個錨定件之間生長并形成組織。用于細(xì)胞培養(yǎng)的初始接種和生長的插入件可被稱為初級插入件。

7、有利地，使用該插入件培養(yǎng)的組織具有與生物體內(nèi)的等效組織極為相似的結(jié)構(gòu)。該組織可以用作研究模型，或植入受試者內(nèi)以治療疾病或損傷。進一步有利地，該插入件可以是可擴展的且生產(chǎn)可靠，從而降低研究的抑制性成本(inhibitive?cost)。

8、第一和/或第二錨定件的位置可被配置為進行調(diào)節(jié)以拉伸組織。有利地，這可使利用該插入件的組織生長更接近地模擬體內(nèi)的組織生長。

9、在插入件制造過程中，基座上支柱的位置可以變化，并且支柱可以根據(jù)需要更靠近彼此或更遠(yuǎn)離彼此。另外或可替選地，至少一個支柱可以是可調(diào)節(jié)的。該可調(diào)節(jié)支柱可以移動得更靠近或更遠(yuǎn)離另一支柱?？商孢x地，可調(diào)節(jié)支柱的角度可以改變。

10、溝槽還可以包括凹部。有利地，該凹部使用戶能夠共培養(yǎng)額外的細(xì)胞類型。

11、溝槽的位置可設(shè)置為在第一和第二支柱與基座的相交點之間延伸。溝槽的尺寸可設(shè)計為使得它能夠容納懸浮在水凝膠中的細(xì)胞。如果存在多于兩個的支柱，則溝槽可以在每個支柱與基座的相交點之間延伸。在一個實施例中，可以有附接至基座的多達(dá)12個支柱。在這種情況下，溝槽可以從中心向外延伸到每個支柱。

12、在一個實施例中，細(xì)胞可以嵌入水凝膠中。

13、在一個實施例中，所述組織為肌肉組織。在一個實施例中，所述肌肉可以是人類肌肉組織。在一個實施例中，所述組織可以是家畜組織，其中所述家畜可以是牛(cow)、豬、羊或雞(chicken)。

14、在一個實施例中，所述支柱由生物相容性材料制成，任選地，所述生物相容性材料是生物相容性樹脂。生物相容性材料的優(yōu)點在于，它除了為組織生長提供支撐外，不會影響細(xì)胞培養(yǎng)?？捎糜诨椭е牟牧鲜纠ǖ幌抻谟袡C材料，例如樹脂、聚己內(nèi)酯、硅橡膠(silicone)，以及無機材料，例如硅、二氧化硅、玻璃、金屬、磷酸鈣，以及有機材料和無機材料的混合物。

15、在一個實施例中，支柱包括可生物降解材料?？缮锝到獠牧鲜怯欣模驗樗鼈儠S著時間的推移分解成不會干擾細(xì)胞生長的無毒成分。

16、在一個實施例中，錨定件包括生物相容性非織造織物。同樣地，生物相容性非織造織物是有利的，因為它在培養(yǎng)過程中支撐組織，并允許以模擬體內(nèi)組織的方式對組織進行拉伸。

17、在一個實施例中，錨定件包括可生物降解的非織造織物?？缮锝到獾腻^定件可能是有利的，因為它可以用于將組織移植物固定到受試者體內(nèi)而不干擾正常的生理功能，然后分解成無毒成分?？捎糜阱^定件的材料示例包括但不限于非織造或機織織物。這些織物可是合成的或由天然材料制成，例如纖維素和絲綢。這些織物可以具有涂層，也可以在沒有涂層的情況下單獨使用。這些織物可以是可拉伸的或不可拉伸的。

18、錨定件可穿設(shè)有一個或多個孔洞(hole)。當(dāng)支柱穿過孔洞以將錨定件固定到位時，這些孔洞可以提供連接支柱的方式。在細(xì)胞培養(yǎng)的不同階段，可以使用不同的孔洞作為連接點。

19、在一個實施例中，錨定件可從支柱上拆卸。在一個實施例中，錨定件在細(xì)胞培養(yǎng)期間可以是可拆卸的，以便于將培養(yǎng)的組織轉(zhuǎn)移到第二組支柱上。第二組支柱可以在相同的插入件上，或者在不同的插入件上。

20、每個錨定件可以包括一個或多個孔洞。這些孔洞可以用于將錨定件連接到各自的支柱上。

21、錨定件的位置可以通過使用錨定件上的一個或多個孔洞來調(diào)整，以拉伸工程化組織。可替選地，工程化組織可以通過將其轉(zhuǎn)移到具有相距更遠(yuǎn)的支柱的插入件上，或通過滑動其中一個支柱至更遠(yuǎn)的位置來進行拉伸。錨定件的位置可以手動、自動和半自動調(diào)整。

22、在一個實施例中，插入件可以與插入件的其他單元堆疊。插入件的基座可以包括一個或多個凹部。這些一個或多個凹部可以位于基座的底面。每個凹部可以被配置為容納來自另一個插入件的支柱。凹部可以沿著垂直于溝槽的平面布置，使得多個插入件以每層之間旋轉(zhuǎn)90度的方式堆疊(即，以ababab…的形式)?？商孢x地，凹部可以布置在基部的底面，使它們與同一插入件的直立支柱相對應(yīng)。這使得插入件可以在每層之間不旋轉(zhuǎn)地堆疊(即，以aaaaa的形式)。

23、還可提供其他用于儲存和/或堆疊插入件的機制。例如，多個插入件中的每一個均可作為可拆卸的“擱板”位于配置為容納多個插入件的較大結(jié)構(gòu)內(nèi)。有利地，這允許在不干擾其他相鄰插入件的情況下移除單個插入件。

24、所述插入件還可以包括一個或多個間隔件。這些一個或多個間隔件中的每一個都可設(shè)置在支柱的底部。在提供兩對支柱的實施例中，其中一對支柱可設(shè)置有間隔件。有利地，在支柱的基部設(shè)置間隔件可以用于抬高所支撐的錨定件，從而使正在生長的組織在懸浮狀態(tài)下生長。有利地，在懸浮狀態(tài)下生長的細(xì)胞培養(yǎng)物有助于在生長過程中進行營養(yǎng)物質(zhì)和氣體的交換。

25、間隔件可以包括位于支柱底部的珠子。間隔件可包括配置為置于支柱上的可拆卸頸環(huán)。有利地，這可以使終端用戶選擇哪些支柱在使用中抬高相關(guān)錨定件的高度，來定制插入件。

26、插入件還可以包括自基座直立延伸且被配置于支撐錨定件的第三支柱；以及自基部直立延伸且被配置于支撐錨定件的第四支柱。第三和第四支柱可以沿著垂直于溝槽的平面設(shè)置。任選地，第三和第四支柱中的至少一個可在所討論的支柱的底部包括間隔件，從而使被支撐的錨定件高于插入件的基座。第三和第四支柱可以被稱為第二對支柱，使得插入件包括旋轉(zhuǎn)對稱性(rotational?symmetry)為4的兩對支柱?？紤]到溝槽，整個插入件的旋轉(zhuǎn)對稱性可為2，但支柱的旋轉(zhuǎn)對稱性可為4。

27、有利地，按照上述布置提供第三和第四支柱，使用戶能夠更換支撐錨定件的支柱，從而改變施加在使用該插入件生長的組織上的張力的方向?？蛇x擇性添加間隔件提供第一和第二支柱與第三和第四支柱之間的差異。通過使用第三和第四支柱支撐錨定件，使組織懸浮在水凝膠中，而不是坐落在插入件的溝槽內(nèi)。

28、另外或可替選地，插入件可包括一個或多個額外的支柱，其用于支撐一個或多個相應(yīng)的額外錨定件，任選地或優(yōu)選地，其中第一、第二和一個或多個額外支柱圍繞插入件的基座等距隔開。與“兩對”系統(tǒng)描述的實施例不同，每個支柱可支撐不同的錨定件，而不是用戶從一個支柱轉(zhuǎn)移錨定件。

29、在一個實施例中，第一和第二支柱可以布置為間隔至少10mm、20mm、間隔至少22mm、間隔至少25mm、間隔至少28mm、間隔至少30mm、間隔至少32mm、間隔至少35mm、間隔至少38mm、間隔至少40mm。

30、令人驚訝地，使用插入件培養(yǎng)細(xì)胞，能夠生長出比以往更長的組織片。更長的組織片在醫(yī)學(xué)上使用具有優(yōu)勢，因為它們用途更廣，可用于治療更廣泛的病癥。

31、在一個實施例中，支柱可以在相同或不同的平面中以不同的高度和角度設(shè)置。有利地，這可以改變錨定件的位置并促進定向生長。

32、在一個實施例中，插入件包括力傳感器，任選地或優(yōu)選地，其中所述力傳感器連接到第一或第二錨定件上。力傳感器可以用于測量收縮性，從而證明肌肉功能正常。力傳感器可以與插入件同時制造，或單獨制造隨后進行連接。收縮性可使用物理傳感器(如壓阻傳感器)或光纖傳感器(如光纖)進行測量。傳感器接口電路可以被集成作為插入件的一部分，或位于細(xì)胞培養(yǎng)孔板的外部。

33、在一個實施例中，插入件被配置為向使用該插入件生長的組織提供電刺激。電刺激可以由插入件的蓋子提供。所述蓋子可包括一對沿表面設(shè)置的電極，其被配置為接觸在插入件中生長的組織。這對電極可連接到外部電源。

34、根據(jù)本發(fā)明的第二方面，提供了一種用于培養(yǎng)組織的系統(tǒng)，包括：

35、根據(jù)第一方面任一實施例的插入件；以及

36、包括至少一個孔的板；

37、其中，所述至少一個孔容納所述插入件，并且工程化組織懸浮在插入件中。

38、所述系統(tǒng)還可以包括蓋子，其被配置為至少覆蓋存放插入件的孔。所述蓋子可包括兩個或更多個電極，其被配置為向孔中的內(nèi)容物提供電刺激。電極可以包括金屬材料，如銀和銅，或?qū)щ娋酆衔?，如pedot:pss，或非金屬材料，如碳、石墨烯或石墨。電極可以是剛性的、半柔性的或柔性的。電極可以成對設(shè)置?？商孢x地，可以設(shè)置奇數(shù)個電極。在奇數(shù)配置中，公共接地電極可以與其他電極共享，而在偶數(shù)配置中，每對電極可具有自己的接地電極。每對電極可以提供相同的持續(xù)刺激?？商孢x地，每對電極可以不同的間隔提供不同水平的刺激。每對電極的刺激可以同時或依次提供。

39、本文描述的系統(tǒng)還可以包括次級插入件，其中所述次級插入件包括：主體，其包含孔口；第一對支柱，其從所述主體直立延伸并被配置為支撐第一對錨定件；以及第二對支柱，其從所述主體直立延伸并被配置為支撐第二對錨定件；其中，所述次級插入件配置為容納在組織生長過程中從初級插入件的支柱上拆除的一對或多對錨定件。

40、在一個實施例中，成對的支柱是平行的。有利地，平行的成對支柱可以比其他替代布置更節(jié)省空間。

41、所述次級插入件可包括一對支柱、兩對支柱、三對支柱、四對支柱、五對支柱或多于五對的支柱。

42、次級插入件上容納的細(xì)胞可以來自多于1個的初級插入件，或來自同一個初級插入件。

43、次級插入件的孔口可以是溝槽。次級插入件的孔口可以包括多個溝槽。

44、在一個實施例中，細(xì)胞可以在初級插入件上培養(yǎng)至少48小時、60小時、72小時、4天、5天、6天、1周、2周、3周或1個月，然后轉(zhuǎn)移到次級插入件。

45、在本發(fā)明的另一個方面，提供了一種使用本文所述的插入件進行細(xì)胞培養(yǎng)的體外方法。

46、在一個實施例中，所述組織為肌肉組織；可選地，其中所述組織為哺乳動物組織；可選地，其中所述組織為人類組織；優(yōu)選地，其中所述組織為人類肌肉組織。在一個實施例中，所述組織可以是禽類組織；優(yōu)選地，其中所述組織來自家禽。

47、該方法中使用的細(xì)胞可以是包括心肌細(xì)胞在內(nèi)的肌細(xì)胞，或其他細(xì)胞，如平滑肌細(xì)胞、成肌細(xì)胞、肌衛(wèi)星細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、肌肉祖細(xì)胞、誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(ipscs)和肌腱細(xì)胞。

48、包括脂肪細(xì)胞和/或運動神經(jīng)元細(xì)胞的其他細(xì)胞類型也可以在插入件上培養(yǎng)。

49、所述細(xì)胞可以在水凝膠中培養(yǎng)。水凝膠可包括層粘連蛋白、巢蛋白、膠原蛋白、纖維蛋白、基質(zhì)膠和硫酸乙酰肝素蛋白聚糖。

50、在將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到水凝膠中并將其接種到細(xì)胞插入件上之前，可以使用常規(guī)方法擴增和生長細(xì)胞來制備用于插入件培養(yǎng)的細(xì)胞。

51、細(xì)胞可以接種到細(xì)胞培養(yǎng)插入件的溝槽中。可替選地，細(xì)胞可以以共培養(yǎng)的方式接種到插入件的溝槽中和基座上，或接種在水凝膠本身的頂部。一旦水凝膠凝固，就可以添加細(xì)胞培養(yǎng)基。所述溝槽可以包括凹部。凹部可被配置用于脂肪細(xì)胞和/或運動神經(jīng)元細(xì)胞的共培養(yǎng)。

52、在培養(yǎng)過程中，細(xì)胞將與插入件的錨定件整合。細(xì)胞將形成具有在錨定件之間延伸的肌纖維的組織。

53、在一個實施例中，插入件包括多達(dá)12個錨定件，并且肌肉組織可以形成小塊(patch)。

54、在一個實施例中，細(xì)胞可以從第一和第二支柱轉(zhuǎn)移到包括第三和第四支柱的第二對支柱。第二對支柱可以沿著垂直于如第一方面所述的第一對支柱所限定平面的平面從基座直立延伸。有利地，將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到第二對支柱上可實現(xiàn)單軸拉伸和機械拉張，其作為一種成熟信號。

55、細(xì)胞可以培養(yǎng)至少48小時、60小時、72小時、4天、5天、6天、1周、2周、3周或1個月。

56、在本發(fā)明的另一個方面，根據(jù)本文所述方法培養(yǎng)的組織用于醫(yī)藥(medicine)。

57、在本發(fā)明的另一個方面，提供了一種治療方法，包括移植使用本文所述的插入件培養(yǎng)的組織。所述方法可包括將插入件的錨定件與組織一起植入至需要其的受試者中。

58、在本發(fā)明的另一個方面，提供了如本文所述培養(yǎng)的組織，用于制備藥物。

59、在一個實施例中，用于醫(yī)藥、治療方法或藥物制造的組織的長度為至少20mm、至少22mm、至少25mm、至少28mm、至少30mm、至少32mm、至少35mm、至少38mm、至少40mm。

60、在一個實施例中，用于醫(yī)藥的培養(yǎng)組織用于治療由創(chuàng)傷引起的肌肉疾病和損傷。肌肉疾病可以是腹壁或食管缺陷。

61、使用本文所述方法培養(yǎng)的組織可以用于醫(yī)藥。該組織可以植入需要其的受試者中以治療疾病或損傷。所述醫(yī)藥可以是再生醫(yī)藥。

62、所述組織可利用錨定件移植。錨定件可用于將組織固定在適當(dāng)位置。

63、所述組織可用于治療肌肉疾病或病癥，包括：腹壁缺陷和食管缺陷，或創(chuàng)傷引起的容積性肌肉損失。其他用途可包括治療：肌肉減少癥、杜氏肌營養(yǎng)不良癥、貝克肌營養(yǎng)不良癥、杜氏肌營養(yǎng)不良(dmd)相關(guān)擴張型心肌病、肢帶型肌營養(yǎng)不良癥(limb?girdlemuscular?dystrophies-lgmd)、lama2相關(guān)(merosin缺乏)先天性肌營養(yǎng)不良癥(埃默里-德賴弗斯(emery-dreifuss)肌營養(yǎng)不良癥)、vi型膠原相關(guān)肌營養(yǎng)不良癥(貝特萊姆(bethlem)肌病、烏爾里希(ullrich)先天性肌營養(yǎng)不良癥)、α-肌營養(yǎng)不良聚糖病(沃克-沃伯格(walker-warburg)綜合征、肌肉-眼-腦病)、核纖層蛋白病、遠(yuǎn)端肌營養(yǎng)不良癥、肌原纖維肌病、線狀體肌病(nemaline?myopathy)、中央軸空病(central?core?myopathy)、中央核肌病、先天性纖維類型比例失調(diào)、多/微核肌病、圓柱螺旋肌病(cylindrical?spiralsmyopathy)、線粒體肌病、糖原貯積病、代謝性疾病、炎癥性肌病、運動神經(jīng)元疾病(例如肌萎縮側(cè)索硬化癥和脊髓性肌萎縮癥)、脊髓和延髓肌萎縮癥、夏科-馬里-圖思(charcot-marie-tooth)病和肯尼迪病(kennedy’sdisease)。

64、在本發(fā)明的一個方面，細(xì)胞插入件用于培養(yǎng)肉制品。用于生產(chǎn)肉制品的細(xì)胞可以是家畜細(xì)胞。細(xì)胞可以是牛、羊、家禽或豬的細(xì)胞。

65、細(xì)胞培養(yǎng)插入件可以使用增材制造技術(shù)(例如3d打印)或減材技術(shù)(例如銑削)制造?？商孢x地，插入件可以使用模塑、成形、鑄造、機械加工和連接來制造。

66、一個或多個插入件可以串聯(lián)使用。例如，可以將多個插入件放置在單個系統(tǒng)中，以同時生產(chǎn)多個樣品。另外和/或可替選地，插入件可具有多于一對的支柱和相應(yīng)的錨定件。有利地，這允許擴大肌肉組織的生產(chǎn)，以用于研究、醫(yī)藥或培養(yǎng)肉制品。

67、錨定件：在本文中，術(shù)語“錨定件”是指在培養(yǎng)過程中為細(xì)胞提供支撐的材料。錨定件也可用于在培養(yǎng)后移動組織以用于下游實驗，以及用于在懸浮狀態(tài)下培養(yǎng)組織。錨定件可以由非織造織物制成。形成錨定件的材料可以是網(wǎng)狀物。

68、基座：在本文中，術(shù)語“基座”是指細(xì)胞培養(yǎng)插入件的結(jié)構(gòu)，其為支柱提供支撐。細(xì)胞也可以被接種在基座上?；梢杂缮锵嗳菪詷渲瞥?。

69、細(xì)胞：在本文中，術(shù)語“細(xì)胞”是指在細(xì)胞培養(yǎng)插入件上培養(yǎng)的那些細(xì)胞。細(xì)胞可以是哺乳動物細(xì)胞，優(yōu)選是人類細(xì)胞。所述細(xì)胞可以來自家畜。所述細(xì)胞可以來自牛、豬、羊或雞。所述細(xì)胞可以是肌肉細(xì)胞。在一個實施例中，細(xì)胞可以來源于已建立的細(xì)胞系，如c2c12或人類成肌細(xì)胞。在一個實施例中，所述細(xì)胞可以源自患者。在一個實施例中，所述細(xì)胞是干細(xì)胞，任選地是誘導(dǎo)多能干細(xì)胞。所述細(xì)胞可以是骨骼肌細(xì)胞、心肌細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞或肌腱細(xì)胞。

70、可生物降解：在本文中，“可生物降解”是指一種隨時間分解為無毒成分的材料。

71、生物相容性材料：如在本文中所用的，“生物相容性材料”是指可用于培養(yǎng)細(xì)胞或植入受試者而不會造成任何損害或不會以其他方式干擾細(xì)胞或組織功能的材料。所述材料可以是樹脂。所述材料可以是非織造網(wǎng)狀物。

72、肌肉疾病：本文所述的肌肉疾病可影響哺乳動物，特別是人類。肌肉疾病可包括腹壁缺陷等。