本發(fā)明涉及藥物，具體涉及的是一種蛇毒血凝酶效價(jià)穩(wěn)定劑及其制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、蛇毒絲氨酸蛋白酶（snake?venome?serine?proteinases，svsps）是蛇毒中一類重要的蛋白水解酶，與凝血系統(tǒng)關(guān)系密切，具有重要的臨床應(yīng)用價(jià)值。

2、隨著蛋白質(zhì)純化分離技術(shù)的提高和生物化學(xué)、藥理學(xué)的深入研究，確定了蛇毒類血凝酶在臨床上止血應(yīng)用的巨大價(jià)值。經(jīng)過幾十年的研究和臨床應(yīng)用，已證明蛇毒血凝酶類產(chǎn)品具有卓越的止血功效，廣泛用于各種出血性疾病。蛇毒血凝酶是從蛇毒中經(jīng)過層析純化方法分離提取，并經(jīng)冷凍干燥制得的具有止血作用的蛋白酶類產(chǎn)品。蛇毒血凝酶在無酶活力穩(wěn)定劑保護(hù)情況下，配液和凍干過程中，效價(jià)會(huì)有明顯下降，長(zhǎng)期穩(wěn)定性也會(huì)有效價(jià)顯著下降的情況。

3、膠原蛋白肽是以牛骨、牛皮或魚皮為明膠的原料，通過定向酶解技術(shù)制得的多肽產(chǎn)品，目前已廣泛應(yīng)用于口服保健品，具有鎖水美白、修復(fù)細(xì)胞、水油平衡、延緩衰老等功效。目前已有生產(chǎn)廠家在輔料登記備案平臺(tái)獲得登記號(hào)，用于藥用用途。但將藥用級(jí)膠原蛋白肽及膠原蛋白肽與甘氨酸混合物用于蛇毒血凝酶的效價(jià)穩(wěn)定劑應(yīng)用未見報(bào)道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的是提供一種蛇毒血凝酶效價(jià)穩(wěn)定劑及其制備方法和應(yīng)用。

2、本發(fā)明首先提供了一種蛇毒血凝酶效價(jià)穩(wěn)定劑，其為膠原蛋白肽或質(zhì)量比為1~3:1的膠原蛋白肽與甘氨酸的混合物。

3、具體的，所述膠原蛋白肽與甘氨酸的混合物中，所述膠原蛋白肽與甘氨酸的質(zhì)量比為1:1、2:1或3:1。

4、上述的蛇毒血凝酶效價(jià)穩(wěn)定劑在穩(wěn)定蛇毒血凝酶效價(jià)中的應(yīng)用。

5、上述的應(yīng)用中，所述應(yīng)用為在配液、凍干和/或貯藏過程中的效價(jià)穩(wěn)定。

6、第二，本發(fā)明提供了一種蛇毒血凝酶制劑，其由上述蛇毒血凝酶效價(jià)穩(wěn)定劑和蛇毒血凝酶制備得到；

7、所述蛇毒血凝酶制劑中，所述蛇毒血凝酶的效價(jià)為0.5~2單位/支。

8、第三，本發(fā)明提供了一種制備蛇毒血凝酶制劑的方法，包括如下步驟：將膠原蛋白肽溶液或膠原蛋白肽與甘氨酸的混合物溶液和蛇毒血凝酶混合，得到所述蛇毒血凝酶制劑。

9、上述的方法中，所述膠原蛋白肽溶液的質(zhì)量百分濃度為2%~10%，具體可為8%；

10、所述膠原蛋白肽與甘氨酸的混合物溶液中，所述膠原蛋白肽的質(zhì)量百分濃度為2%~6%，具體可為2%、4%或6%；所述甘氨酸的質(zhì)量百分濃度為2%~4%，具體可為2%；

11、所述膠原蛋白肽溶液、膠原蛋白肽與甘氨酸的混合物溶液的溶劑為注射用水；

12、所述膠原蛋白肽的相對(duì)分子質(zhì)量≤2000da；

13、所述蛇毒血凝酶效價(jià)不少于400單位/ml；

14、所述膠原蛋白肽溶液或膠原蛋白肽與甘氨酸的混合物溶液和蛇毒血凝酶混合后的體系中，所述蛇毒血凝酶的效價(jià)為0.5~2單位/ml；

15、所述膠原蛋白肽溶液或膠原蛋白肽與甘氨酸的混合物溶液和蛇毒血凝酶混合后的體系ph為5.5~7.5；具體的，采用鹽酸或氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)其ph值。

16、所述ph具體可為6.6；

17、上述的方法還包括將膠原蛋白肽溶液或膠原蛋白肽與甘氨酸的混合物溶液和蛇毒血凝酶混合后的體系凍干的步驟；

18、所述凍干的條件如下：預(yù)凍溫度-40±2℃，保溫150min；抽真空至真空度保持在30~100pa（具體可為35pa），開始升溫，升溫至-35℃，保溫60min；升溫至-30℃，保溫60min；升溫至-25℃，保溫60min；升溫至-20℃，保溫60min；升溫至-15℃，保溫60min；升溫至-10℃，保溫60min；升溫至-5℃，保溫60min；升溫至0℃，保溫180~240min；升溫至5℃，保溫60min；升溫至10℃，保溫60min；升溫至15℃，保溫60min；升溫至20℃，保溫60min；升溫至25℃，保溫60min；升溫至30℃，保溫60min；升溫至35℃，保溫60min；升溫至40℃，保溫120min；以1分鐘內(nèi)壓力變化低于30pa作為凍干終點(diǎn)判斷。

19、第四，本發(fā)明提供了一種蛇毒血凝酶效價(jià)標(biāo)準(zhǔn)品，其由上述蛇毒血凝酶效價(jià)穩(wěn)定劑和蛇毒血凝酶制備得到；

20、所述蛇毒血凝酶效價(jià)標(biāo)準(zhǔn)品中，所述蛇毒血凝酶的效價(jià)為95~105單位/支。

21、第五，本發(fā)明提供了一種制備蛇毒血凝酶效價(jià)標(biāo)準(zhǔn)品的方法，包括如下步驟：將膠原蛋白肽溶液或膠原蛋白肽與甘氨酸的混合物溶液和蛇毒血凝酶混合，得到所述蛇毒血凝酶效價(jià)標(biāo)準(zhǔn)品。

22、上述的方法中，所述膠原蛋白肽溶液的質(zhì)量百分濃度為2%~10%，具體可為8%；

23、所述膠原蛋白肽與甘氨酸的混合物溶液中，所述膠原蛋白肽的質(zhì)量百分濃度為2%~6%，具體可為2%、4%或6%；所述甘氨酸的質(zhì)量百分濃度為2%~4%，具體可為2%；

24、所述膠原蛋白肽溶液、膠原蛋白肽與甘氨酸的混合物溶液的溶劑為注射用水；

25、所述膠原蛋白肽的相對(duì)分子質(zhì)量≤2000da；

26、所述蛇毒血凝酶效價(jià)不少于400單位/ml；

27、所述膠原蛋白肽溶液或膠原蛋白肽與甘氨酸的混合物溶液和蛇毒血凝酶混合后的體系中，所述蛇毒血凝酶的效價(jià)為95~105單位/ml；

28、所述膠原蛋白肽溶液或膠原蛋白肽與甘氨酸的混合物溶液和蛇毒血凝酶混合后的體系ph為5.5~7.5，具體可為6.6；具體的，采用鹽酸或氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)其ph值；

29、上述的方法還包括將膠原蛋白肽溶液或膠原蛋白肽與甘氨酸的混合物溶液和蛇毒血凝酶混合后的體系凍干的步驟；

30、所述凍干的條件如下：預(yù)凍溫度-40±2℃，保溫150min；抽真空至真空度保持在30~100pa（具體可為35pa），開始升溫，升溫至-35℃，保溫60min；升溫至-30℃，保溫60min；升溫至-25℃，保溫60min；升溫至-20℃，保溫60min；升溫至-15℃，保溫60min；升溫至-10℃，保溫60min；升溫至-5℃，保溫60min；升溫至0℃，保溫180~240min；升溫至5℃，保溫60min；升溫至10℃，保溫60min；升溫至15℃，保溫60min；升溫至20℃，保溫60min；升溫至25℃，保溫60min；升溫至30℃，保溫60min；升溫至35℃，保溫60min；升溫至40℃，保溫120min；以1分鐘內(nèi)壓力變化低于30pa作為凍干終點(diǎn)判斷。

31、本發(fā)明中所述蛇毒血凝酶為白眉蛇毒血凝酶。

32、本發(fā)明采用特定相對(duì)分子質(zhì)量范圍（≤2000da）的2~10%藥用級(jí)膠原蛋白肽及膠原蛋白肽與甘氨酸按1:1~3:1（質(zhì)量比）混合物作為白眉蛇毒血凝酶的效價(jià)穩(wěn)定劑，并通過優(yōu)化的凍干流程制得效價(jià)穩(wěn)定的白眉蛇毒血凝酶，這兩類穩(wěn)定劑可以應(yīng)用于蛇毒類血凝酶制劑及蛇毒類血凝酶效價(jià)標(biāo)準(zhǔn)品。

33、本發(fā)明具有如下有益效果：

34、（1）與其他大分子明膠類穩(wěn)定劑相比，本發(fā)明的穩(wěn)定劑不會(huì)隨濃度的增長(zhǎng)而出現(xiàn)蛇毒血凝酶活力的膨脹作用；在應(yīng)用濃度范圍內(nèi)，既保證產(chǎn)品在配液、凍干及貯藏條件下效價(jià)的穩(wěn)定性，又不會(huì)因蛇毒血凝酶活力的膨脹作用干擾效價(jià)檢測(cè)，導(dǎo)致效價(jià)準(zhǔn)確度的偏離。

35、（2）與甘氨酸這一常用的凍干賦形劑相比，膠原蛋白肽與甘氨酸的混合型穩(wěn)定劑對(duì)白眉蛇毒血凝酶在配液、凍干及貯藏條件下的效價(jià)穩(wěn)定作用極為顯著，在為期10天的40℃加速條件下及36個(gè)月的-20℃長(zhǎng)期穩(wěn)定性研究中效價(jià)均穩(wěn)定可控，變異系數(shù)均小于2%，符合血凝酶類制劑及蛇毒血凝酶效價(jià)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)效價(jià)范圍的要求。

36、（3）與膠原蛋白肽相比，膠原蛋白肽與甘氨酸的混合型穩(wěn)定劑凍干所得的制劑外觀光潔平整、無萎縮現(xiàn)象，更適于商業(yè)化產(chǎn)品應(yīng)用。

37、（4）本發(fā)明的穩(wěn)定劑相對(duì)分子質(zhì)量均小于2000da，與蛇毒血凝酶分子量（36000±5000da）差異明顯，不會(huì)干擾工作標(biāo)準(zhǔn)品的純度檢測(cè)和sds-page電泳檢測(cè)，符合作為工作標(biāo)準(zhǔn)品輔料的檢驗(yàn)要求。

38、（5）本發(fā)明的血凝酶效價(jià)穩(wěn)定劑的應(yīng)用，對(duì)蛇毒血凝酶類制劑（0.5單位~2單位/支）及蛇毒血凝酶效價(jià)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（95單位~105單位/支）的制備技術(shù)有指導(dǎo)作用。