本發(fā)明涉及生物，具體涉及一種檢測(cè)snca基因dna甲基化水平的引物探針組合物及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、帕金森病(pd)是一種常見的神經(jīng)退行性疾病，主要病理特征為黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元的丟失和路易小體的形成。路易小體的主要成分為異常聚集的α-突觸核蛋白(snca)，其異常表達(dá)與pd的發(fā)病機(jī)制密切相關(guān)。dna甲基化是一種重要的表觀遺傳修飾方式，調(diào)控基因表達(dá)。snca基因的甲基化狀態(tài)與α-突觸核蛋白的異常表達(dá)之間存在密切關(guān)聯(lián)，且snca基因的甲基化水平在pd患者中表現(xiàn)出低甲基化趨勢(shì)，提示其可能作為pd輔助診斷的潛在生物標(biāo)志物。

2、然而，目前關(guān)于snca基因甲基化pd中的研究多集中于小樣本隊(duì)列，缺乏多中心、大樣本的驗(yàn)證，且其動(dòng)態(tài)變化及與疾病進(jìn)展的關(guān)系仍需進(jìn)一步探索。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、為了彌補(bǔ)現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的在于提供一種檢測(cè)snca基因dna甲基化水平的引物探針組合物及其應(yīng)用，進(jìn)而評(píng)估snca基因dna甲基化水平在pd診斷中的應(yīng)用價(jià)值。

2、為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：

3、本發(fā)明第一方面提供一種引物探針組合物。

4、進(jìn)一步，所述的引物的核苷酸序列包括seq?id?no.1-2、seq?id?no.4-5、seq?idno.7-8、seq?id?no.10-11中的一對(duì)或以上；所述的探針的核苷酸序列包括seq?id?no.3、seq?id?no.6、seq?id?no.9、seq?id?no.12中的一條或以上。

5、進(jìn)一步，所述引物探針組合物包括seq?id?no.1-3組合、seq?id?no.4-6組合、seqid?no.7-9組合、seq?id?no.10-12組合中的一種或多種。

6、進(jìn)一步，所述引物探針組合物中還含有針對(duì)內(nèi)參基因檢測(cè)的引物和探針。

7、優(yōu)選地，所述內(nèi)參基因包括但不限于gapdh、β-actin、b2m、actb、sdha、hprt1、arbp等。

8、本技術(shù)所述“內(nèi)參基因”可以是各種持家基因(house-keeping?genes)，所述持家基因在細(xì)胞內(nèi)組成穩(wěn)定性表達(dá)，有助于保持細(xì)胞的功能。持家基因在生物體各類細(xì)胞中都表達(dá)，其產(chǎn)物是對(duì)維持細(xì)胞基本生命活動(dòng)所必需的蛋白質(zhì)編碼的基因，如微管蛋白基因、糖酵解酶系基因與核糖體蛋白基因等。

9、在本發(fā)明中，所述引物探針組合物用于檢測(cè)snca基因dna甲基化水平，所述snca基因定位于人染色體4q21-23上(nc_000004.12，89724099-89838324)，跨度大約121198bp，gene?id:6622，本研究區(qū)段位于基因第6704-7147bp之間，序列如下：

10、ggagcctaaggaaagagacttgacctggctttcgtcctgcttctgatattc

11、ccttctccacaagggctgagagattaggctgcttctccgggatccgctttt

12、ccccgggaaacgcgaggatgctccatggagcgtgagcatccaacttttctc

13、tcacataaaatctgtctgcccgctctcttggtttttctctgtaaagtaagca

14、agctgcgtttggcaaataatgaaatggaagtgcaaggaggccaagtcaac

15、aggtggtaacgggttaacaagtgctggcgcggggtccgctagggtggagg

16、ctgagaacgccccctcgggtggctggcgcggggttggagacggcccgcga

17、gtgtgagcggcgcctgctcagggtagatagctgagggcgggggtggatgt

18、tggatggattagaaccatcacacttgggcctgctgtttg(seq?id?no.13)。進(jìn)一步，所述引物探針組合物的核苷酸序列包括如下成分：

19、(1)用于snca基因cpg島位置1甲基化水平檢測(cè)的引物探針組合：

20、seq?id?no.1：5’-gggggggagattaggttgttttttcg-3’；

21、seq?id?no.2：5’-ggacctccaccctaacgaaccccgcgc-3’；

22、seq?id?no.3：5’-ccctttcgggaaacgcgaggatgtttt-3’；

23、(2)用于snca基因cpg島位置2甲基化水平檢測(cè)的引物探針組合：

24、seq?id?no.4：5’-aggttgttttttcgggattcgttttttttc-3’；

25、seq?id?no.5：5’-ctttacaaaaaaaaaccaaaaaaacg-3’；

26、seq?id?no.6：5’-cgcgaggatgttttatgg-3’；

27、(3)用于snca基因cpg島位置3甲基化水平檢測(cè)的引物探針組合：

28、seq?id?no.7：5’-gggggggaggaggttaagttaataggtggtaac-3’；

29、seq?id?no.8：5’-cccgccctcaactatctaccctaaacaaacgccgc-3’；

30、seq?id?no.9：5’-ggtggtaacgggttaataagtgttggcgcggg-3’；

31、(4)用于snca基因cpg島位置4甲基化水平檢測(cè)的引物探針組合：

32、seq?id?no.10：5’-cgggtggttggcgcggggttggagac-3’；

33、seq?id?no.11：5’-aactcaaacaaacaacaaacccaaatataataa-3’；

34、seq?id?no.12：5’-gcggcgtttgtttagggtagatagttgaggg-3’。

35、進(jìn)一步，所述位置1在snca基因6792bp處，所述位置2在snca基因6809bp處，所述位置3在snca基因6968bp處，所述位置4在snca基因7049bp處。

36、在本發(fā)明的各個(gè)方面中，所用的引物、探針不限于本發(fā)明所記載的具體序列，而是包括了與其具有至少80％，優(yōu)選至少85％，更優(yōu)選至少90％，更優(yōu)選至少95％，更優(yōu)選至少99％同一性，并且仍然保持其功能的那些序列。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以通過(guò)常規(guī)程序確定序列同一性。

37、在一些實(shí)施方案中，所述引物可使用標(biāo)記物質(zhì)標(biāo)記。所述標(biāo)記物質(zhì)包括但不限于熒光物質(zhì)、放射性同位素或酶。其中，熒光物質(zhì)包括但不限于tamrattm、alexa555、alexa647、花青染料系列的cy3、cy5、熒光素。放射性同位素包括但不限于32p、33p、35s。酶包括但不限于堿性磷酸酶、辣根過(guò)氧化物酶。

38、在一些實(shí)施方案中，所述探針的兩端，各自獨(dú)立地，設(shè)置有熒光標(biāo)記集團(tuán)和熒光淬滅集團(tuán)。優(yōu)選地，所述不同序列的探針兩端的標(biāo)記集團(tuán)和淬滅集團(tuán)可以相同或不同，優(yōu)選不同。

39、所述熒光標(biāo)記基團(tuán)各自獨(dú)立地選自fam、vic、hex、joe、cy3、rox和cy5中的一種。

40、所述熒光淬滅集團(tuán)各自獨(dú)立地選自bhq1、bhq2、bhq3、tamra和mgb中的一種。

41、本發(fā)明第二方面提供一種試劑盒。

42、進(jìn)一步，所述試劑盒包括本發(fā)明第一方面所述的引物探針組合物。

43、進(jìn)一步，所述試劑盒還包括亞硫酸氫鹽修飾試劑、常規(guī)pcr擴(kuò)增試劑。

44、進(jìn)一步，所述常規(guī)pcr擴(kuò)增試劑包括dntp、dna聚合酶、擴(kuò)增緩沖液。

45、進(jìn)一步，所述試劑盒還包括說(shuō)明書。

46、在本發(fā)明中，適合量的一種或多種引物或探針被提供在一個(gè)或多個(gè)容器中，或固定在基質(zhì)上，引物可以被提供成懸浮在水溶液中，或例如作為冷凍干燥的或凍干的粉末。其中，提供有核酸的容器可以是任何能夠容納所提供的形式的常規(guī)容器，例如微量離心管、安瓿瓶或瓶。

47、在某些應(yīng)用中，一個(gè)或多個(gè)引物或探針(如上所述)，可以預(yù)先測(cè)量好的單次使用量提供在獨(dú)立的、典型情況下用后即可拋棄的管或相當(dāng)?shù)娜萜髦?。使用這樣的設(shè)置，用于測(cè)試snca基因dna甲基化存在的樣品，可以加入到獨(dú)立的管中，直接進(jìn)行擴(kuò)增。

48、在某些實(shí)施方案中，試劑盒可以含有執(zhí)行pcr擴(kuò)增反應(yīng)所必需的反應(yīng)試劑，包括dna樣品制備試劑、用于pcr的酶、緩沖液、mg2+和脫氧核糖核苷酸(dntps)。

49、其中，pcr的酶包括dna聚合酶和/或rna聚合酶。

50、dntp是為了進(jìn)行基于pcr的dna擴(kuò)增的核苷源，datp、dgtp、dctp、dttp這4種是必要的。另外，關(guān)于dntp，可使用為了用于熱啟動(dòng)法而進(jìn)行了化學(xué)修飾的物質(zhì)，例如可使用trilink?biotechnologies，inc.制cleanamptm?dntp。

51、優(yōu)選地，所述試劑盒中還可以包括陽(yáng)性質(zhì)控品、陰性質(zhì)控品。具體地，所述陽(yáng)性質(zhì)控品為人甲基化標(biāo)準(zhǔn)品dna，陰性質(zhì)控品為人非甲基化標(biāo)準(zhǔn)品dna。

52、在本發(fā)明中，所述“亞硫酸氫鹽修飾試劑”是指在一些實(shí)施方案中包含亞硫酸氫鹽(bisulfite)、亞硫酸氫鹽(disulfite)、亞硫酸氫鹽(hydrogen?sulfite)或其組合的試劑，經(jīng)過(guò)亞硫酸氫鹽試劑處理的dna，其未經(jīng)過(guò)甲基化的胞嘧啶核苷酸將轉(zhuǎn)化為尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶及其他堿基維持不變，因此可以區(qū)分例如cpg二核苷酸序列中的甲基化和未甲基化胞苷。

53、優(yōu)選地，所述試劑盒中還可以包括dna純化試劑、dna提取試劑等。具體地，所述dna提取試劑可包括裂解緩沖液、結(jié)合緩沖液、清洗緩沖液和洗脫緩沖液。裂解緩沖液通常由蛋白變性劑、去垢劑、ph緩沖劑和核酸酶抑制劑組成。

54、更優(yōu)選地，所述試劑盒中還可以包括用于標(biāo)明檢測(cè)操作步驟和結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)的說(shuō)明書。

55、在其中一些實(shí)施例中，所述試劑盒可以用于以下檢測(cè)平臺(tái)：pcr擴(kuò)增法、熒光定量pcr法、數(shù)字pcr法、液相芯片法、三代測(cè)序法、二代測(cè)序法、焦磷酸測(cè)序法、重亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化測(cè)序法、甲基化芯片法、簡(jiǎn)化亞硫酸氫鹽測(cè)序技術(shù)或它們的組合。

56、實(shí)施本發(fā)明時(shí)，作為另外的必要的器具，可舉出移液器、移液器用槍頭、1.5ml微型管(microtube)等在分子生物學(xué)的實(shí)驗(yàn)中廣泛使用的器具類，作為裝置類，可舉出pcr、凈化臺(tái)、管用離心機(jī)等在分子生物學(xué)的實(shí)驗(yàn)中廣泛使用的儀器。

57、本發(fā)明第三方面提供一種檢測(cè)snca基因dna甲基化水平的方法。

58、進(jìn)一步，所述方法包括采用本發(fā)明第一方面所述的引物探針組合物對(duì)樣本dna進(jìn)行pcr擴(kuò)增。

59、進(jìn)一步，所述樣本dna為亞硫酸鹽處理后的人類基因組dna。

60、優(yōu)選地，所述人類基因組dna從人類全血樣本中獲得。

61、優(yōu)選地，所述pcr擴(kuò)增在相似的擴(kuò)增條件下進(jìn)行。

62、優(yōu)選地，所述pcr擴(kuò)增的體系包括：以總體積25μl計(jì)，所述pcr擴(kuò)增的體系包括：2×pcr反應(yīng)緩沖液12.5μl、上下游引物各1μl、探針1μl，樣本dna?5μl，余量為水。

63、優(yōu)選地，所述pcr擴(kuò)增的反應(yīng)條件為：

64、1)95℃預(yù)變性30秒；

65、2)95℃變性20秒，49～52℃退火20秒，72℃延伸30秒，10個(gè)循環(huán)；

66、3)95℃變性5秒，53℃退火30秒，35個(gè)循環(huán)。

67、進(jìn)一步，當(dāng)使用seq?id?no.1-3組合進(jìn)行pcr擴(kuò)增時(shí)，其退火溫度為51℃；

68、優(yōu)選地，當(dāng)使用seq?id?no.4-6組合進(jìn)行pcr擴(kuò)增時(shí)，其退火溫度為49℃；

69、優(yōu)選地，當(dāng)使用seq?id?no.7-9組合進(jìn)行pcr擴(kuò)增時(shí)，其退火溫度為50℃；

70、優(yōu)選地，當(dāng)使用seq?id?no.4-6組合進(jìn)行pcr擴(kuò)增時(shí)，其退火溫度為52℃。

71、本發(fā)明實(shí)施例部分提供了擴(kuò)增條件的示例性實(shí)施方案。然而，在此所使用的術(shù)語(yǔ)“擴(kuò)增條件”涉及適合于獲得靶的可檢測(cè)量的溫度和/或孵育時(shí)間。因此，術(shù)語(yǔ)“相似的擴(kuò)增條件”意指若是期望，可以對(duì)各靶在相似的溫度下進(jìn)行化驗(yàn)。術(shù)語(yǔ)“相似的擴(kuò)增條件”還指若是期望，可以對(duì)各靶在相似的孵育時(shí)間下進(jìn)行化驗(yàn)。在一些情況下，術(shù)語(yǔ)“相似的擴(kuò)增條件”還涉及擴(kuò)增循環(huán)的次數(shù)。然而，本領(lǐng)域內(nèi)熟知，循環(huán)的次數(shù)并不總是嚴(yán)格的。例如，一些樣品可以在其他樣品之前被移除或被留下進(jìn)行附加擴(kuò)增循環(huán)。在其他情況下，術(shù)語(yǔ)“相似的擴(kuò)增條件”還涉及所使用的緩沖液和擴(kuò)增試劑(酶、核苷酸、鹽等)的性質(zhì)。術(shù)語(yǔ)“相似的擴(kuò)增條件”還指條件(例如,時(shí)間、緩沖液、循環(huán)次數(shù)、溫度等)可以稍微改變或可以相同。

72、本發(fā)明第四方面提供本發(fā)明第一方面所述的引物探針組合物在制備用于檢測(cè)snca基因dna甲基化水平的產(chǎn)品中的應(yīng)用。

73、本發(fā)明第五方面提供本發(fā)明第一方面所述的引物探針組合物在制備用于診斷帕金森病的產(chǎn)品中的應(yīng)用。

74、相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和有益效果：

75、本研究采用基于qpcr平臺(tái)的snca基因甲基化檢測(cè)方法，相較于焦磷酸測(cè)序，不僅在成本上更為經(jīng)濟(jì)，而且操作流程簡(jiǎn)單快速、自動(dòng)化程度高，能夠顯著縮短分析時(shí)間，適合大規(guī)模篩查和臨床應(yīng)用。同時(shí)，qpcr具有較高的靈敏度和特異性，能夠精確檢測(cè)低豐度的甲基化dna，數(shù)據(jù)分析也更為簡(jiǎn)便。此外，新設(shè)計(jì)的引物和探針針對(duì)snca基因啟動(dòng)子區(qū)域中與帕金森病(pd)相關(guān)的特定甲基化位點(diǎn)，具有更高的特異性和準(zhǔn)確性，能夠有效避免非特異性干擾，顯著提高了檢測(cè)的靈敏度和重復(fù)性。相比之前的結(jié)果，新引物探針在檢測(cè)低甲基化樣本時(shí)表現(xiàn)更優(yōu)，能夠?yàn)閜d的輔助診斷提供更可靠的生物標(biāo)志物，具有更高的臨床應(yīng)用價(jià)值。

76、現(xiàn)有專利針對(duì)snca甲基化水平檢測(cè)的方法中只是展示了單個(gè)位點(diǎn)甲基化和非甲基化的擴(kuò)增曲線，并未應(yīng)用實(shí)際的臨床樣本進(jìn)行正常人群和帕金森病人群的甲基化檢測(cè)，對(duì)于真實(shí)樣本的區(qū)分度以及檢測(cè)效果不明確。而且，按專利中的計(jì)算公式進(jìn)行結(jié)果比較，理論上雖然可行，但僅通過(guò)擴(kuò)增的ct值進(jìn)行計(jì)算，存在精度度和重復(fù)性差的問(wèn)題，對(duì)于后期臨床端的真實(shí)場(chǎng)景應(yīng)用，會(huì)出現(xiàn)測(cè)試結(jié)果不穩(wěn)定，容易出現(xiàn)偏差。

77、我們是通過(guò)內(nèi)參和甲基化位點(diǎn)的質(zhì)粒分別對(duì)內(nèi)參和甲基化位點(diǎn)進(jìn)行擴(kuò)增，建立各自的標(biāo)準(zhǔn)曲線，然后通過(guò)標(biāo)曲計(jì)算各自的拷貝數(shù)，從而計(jì)算甲基化比例，這種方式得到的結(jié)果更加準(zhǔn)確，穩(wěn)定性更好。

78、現(xiàn)有文獻(xiàn)應(yīng)用焦磷酸測(cè)序的方式進(jìn)行幾個(gè)位點(diǎn)的甲基化檢測(cè)，通過(guò)臨床樣本測(cè)試，診斷效能不高。

79、我們通過(guò)熒光定量pcr的方法，設(shè)計(jì)每個(gè)位點(diǎn)特異性的引物探針，對(duì)臨床樣本進(jìn)行測(cè)試，結(jié)果顯示，能非常好的區(qū)分正常和pd病人樣本，具有很高的診斷靈敏度和特異性。