本公開涉及光激化學(xué)發(fā)光，具體涉及一種免疫測定方法及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、化學(xué)發(fā)光免疫分析是目前世界公認(rèn)的先進(jìn)的體外免疫診斷技術(shù)，廣泛應(yīng)用于醫(yī)療診斷領(lǐng)域，其中酶促化學(xué)發(fā)光、直接化學(xué)發(fā)光、電化學(xué)發(fā)光是主流化學(xué)發(fā)光技術(shù)。

2、鉤狀效應(yīng)(hook效應(yīng))是指免疫檢測中采用雙抗體夾心法時，在一定濃度范圍內(nèi)，分析物濃度與檢測信號呈正比，但超出某一界定濃度后，信號值反而下降的現(xiàn)象。發(fā)生hook效應(yīng)時，化學(xué)發(fā)光儀一般沒有數(shù)據(jù)報警，除了結(jié)合臨床信息進(jìn)行研判和對比稀釋后結(jié)果外，并不能輕易察覺，如果不加以甄別處理，假性低值的報告會嚴(yán)重誤導(dǎo)臨床診斷。

3、在化學(xué)發(fā)光免疫分析中，傳統(tǒng)檢測方法的檢測范圍有限，常用解決方法是采用合適的稀釋方法，對存疑樣本進(jìn)行稀釋，但稀釋操作較為費時費力，且偶有發(fā)生不能一次稀釋達(dá)到符合檢測要求的情況。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、為了解決上述至少一個問題，本公開提供了一種免疫測定方法及其應(yīng)用。所述方法能夠改善hook效應(yīng)。

2、根據(jù)本公開的第一方面，提供了一種免疫測定方法，其特征在于，所述方法包括如下步驟：

3、1)對含待測目標(biāo)抗原/抗體的待測樣本進(jìn)行免疫反應(yīng)；

4、2)加入第一發(fā)光試劑和第二發(fā)光試劑，分別形成第一發(fā)光復(fù)合物a和第二發(fā)光復(fù)合物b；

5、3)經(jīng)激光照射，檢測所述第一發(fā)光復(fù)合物a的發(fā)光信號rlu1和所述第二發(fā)光復(fù)合物b的發(fā)光信號rlu2；和

6、4)基于所述發(fā)光信號rlu1或所述發(fā)光信號rlu2，計算所述待測樣本中的待測目標(biāo)抗原/抗體的濃度。

7、在一些實施方式中，所述發(fā)光信號rlu1和所述發(fā)光信號rlu2的波長不同。

8、在一些實施方式中，所述對含待測目標(biāo)抗原/抗體的待測樣本進(jìn)行免疫反應(yīng)的步驟包括：添加第一抗體/抗原包被的感光微球和配體修飾的第二抗體/抗原，以與目標(biāo)抗原/抗體形成第一夾心復(fù)合物和第一復(fù)合物；

9、其中，所述第一夾心復(fù)合物含有第一抗體/抗原包被的感光微球、目標(biāo)抗原/抗體和配體修飾的第二抗體/抗原，所述第一復(fù)合物含有包被有第一抗體/抗原包被的感光微球和目標(biāo)抗原/抗體。

10、在一些實施方式中，所述第一發(fā)光試劑包括受體修飾的發(fā)光微球fg1，所述受體修飾的發(fā)光微球fg1與所述第一夾心復(fù)合物結(jié)合形成第一發(fā)光復(fù)合物a；和/或，

11、所述第二發(fā)光試劑包括第三抗體/抗原包被的發(fā)光微球fg2，所述第三抗體/抗原包被的發(fā)光微球fg2和所述第一復(fù)合物形成第二發(fā)光復(fù)合物b。

12、在一些實施方式中，基于所述發(fā)光信號rlu1或所述發(fā)光信號rlu2，計算所述待測樣本中的待測目標(biāo)抗原/抗體的濃度的步驟，包括：

13、判定rlu1≤第一閾值，將rlu1代入第一定標(biāo)曲線計算所述待測目標(biāo)抗原/抗體的濃度；

14、判定rlu1＞第一閾值且第二閾值≤rlu2≤第三閾值時，將rlu2代入第二定標(biāo)曲線計算所述待測目標(biāo)抗原/抗體的濃度；

15、判定rlu1＞第一閾值且rlu2＞第三閾值時，報告所述待測目標(biāo)抗原/抗體的濃度超出檢測范圍。

16、在一些實施方式中，所述方法還包括所述定標(biāo)曲線的建立方法，其包括：

17、s1)對標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行免疫反應(yīng)，其中所述標(biāo)準(zhǔn)品包括多個經(jīng)梯度稀釋的目標(biāo)抗原/抗體；

18、s2)加入所述第一發(fā)光試劑和所述第二發(fā)光試劑，分別形成第一發(fā)光復(fù)合物a'和第二發(fā)光復(fù)合物b'；和

19、s3)經(jīng)激光照射，檢測所述第一發(fā)光復(fù)合物a'的發(fā)光信號rlu1'和所述第二發(fā)光復(fù)合物b'的發(fā)光信號rlu2'；

20、s4)將發(fā)光信號rlu1'與對應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)品中的目標(biāo)抗原/抗體濃度進(jìn)行線性擬合，得到第一定標(biāo)曲線，將發(fā)光信號rlu2'與對應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)品中的目標(biāo)抗原/抗體濃度進(jìn)行線性擬合，得到第二定標(biāo)曲線。

21、在一些實施方式中，所述第一定標(biāo)曲線對應(yīng)公式1，所述公式1如下：

22、公式1：rlu1＝a1×目標(biāo)抗原/抗體的濃度+b1。

23、在一些實施方式中，所述第二定標(biāo)曲線對應(yīng)公式2，所述公式2如下：

24、公式2：rlu2＝a2×目標(biāo)抗原/抗體的濃度+b2。

25、在一些實施方式中，所述方法還包括：計算發(fā)光信號rlu1'和發(fā)光信號rlu2'分別與對應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)品中的目標(biāo)抗原/抗體濃度的皮爾遜相關(guān)性系數(shù)，獲得第一閾值、第二閾值和第三閾值。

26、在一些實施方式中，與所述目標(biāo)抗原/抗體的濃度的皮爾遜相關(guān)系數(shù)≥0.99的發(fā)光信號rlu1'中的最高數(shù)值乘以預(yù)設(shè)倍數(shù)，確定為第一閾值。

27、在一些實施方式中，與所述目標(biāo)抗原/抗體的濃度的皮爾遜相關(guān)系數(shù)≥0.99的發(fā)光信號rlu2'中的最低數(shù)值乘以預(yù)設(shè)倍數(shù)，確定為第二閾值。

28、在一些實施方式中，與所述目標(biāo)抗原/抗體的濃度的皮爾遜相關(guān)系數(shù)≥0.99的發(fā)光信號rlu2'中的最高數(shù)值乘以預(yù)設(shè)倍數(shù)，確定為第三閾值。

29、在一些實施方式中，所述預(yù)設(shè)倍數(shù)選自1.0～1.5。

30、在一些實施方式中，所述預(yù)設(shè)倍數(shù)選自1.0、1.01、1.02、1.03、1.04、1.05、1.06、1.07、1.08、1.09、1.1、1.11、1.12、1.13、1.14、1.15、1.16、1.17、1.18、1.19、1.2、1.21、1.22、1.23、1.24、1.25、1.26、1.27、1.28、1.29、1.3、1.31、1.32、1.33、1.34、1.35、1.36、1.37、1.38、1.39、1.4、1.41、1.42、1.43、1.44、1.45、1.46、1.47、1.48、1.49或1.5。

31、在一些實施方式中，所述添加第一抗體/抗原包被的感光/發(fā)光微球相對于所述目標(biāo)抗原/抗體是過量的。

32、在一些實施方式中，配體和受體特異性結(jié)合。

33、在一些實施方式中，所述配體/受體包括納米金/碘乙酰(iodacetyl)-巰基、氨基-醛基/羧基/異硫氰基、硅烷基-丙烯酰胺或鏈霉親和素與生物素的組合。

34、在一些實施方式中，所述配體/受體包括鏈霉親和素和生物素的組合。

35、在一些實施方式中，所述配體修飾的第二抗體/抗原是生物素修飾的第二抗體/抗原。

36、在一些實施方式中，所述受體修飾的發(fā)光微球是鏈霉親和素修飾的發(fā)光微球。

37、在一些實施方式中，所述發(fā)光微球包含鑭系元素金屬。

38、在一些實施方式中，所述鑭系元素金屬可以鑭、鈰、鐠、釹、钷、釤、銪、釓、鋱、鏑、鈥、鉺、銩、鐿、镥中的至少一種。

39、在一些實施方式中，所述發(fā)光微球fg1和所述發(fā)光微球fg2包含不同的鑭系元素金屬以使其能夠發(fā)出不同波長的信號。

40、在一些實施方式中，所述第一抗體/抗原和所述第二抗體/抗原與所述目標(biāo)抗原/抗體上的不同位點結(jié)合。

41、在一些實施方式中，所述第一抗體/抗原和所述第三抗體/抗原與所述目標(biāo)抗原/抗體上的不同位點結(jié)合。

42、在一些實施方式中，所述第二抗體/抗原和所述第三抗體/抗原的與所述目標(biāo)抗原/抗體上的相同位點結(jié)合。

43、在一些實施方式中，所述待測樣本選自血液、血漿、血清、尿液、精液、唾液、細(xì)胞培養(yǎng)物、組織樣本中的一種或多種。

44、根據(jù)本公開的第二方面，提供了一種免疫測定系統(tǒng)，所述系統(tǒng)用于實現(xiàn)第一方面所述的方法，所述系統(tǒng)包括：

45、免疫反應(yīng)元件，用于與待測目標(biāo)抗原/抗體形成第一發(fā)光復(fù)合物a/a'和第二發(fā)光復(fù)合物b/b'；

46、獲取信號元件，用于激發(fā)和記錄信號值，

47、處理器，用于計算并獲得信號值對應(yīng)的待測目標(biāo)抗原/抗體在待測樣本中的濃度。

48、根據(jù)本公開的第三方面，提供了一種免疫檢測試劑盒，所述試劑盒包括：感光試劑、第一發(fā)光試劑和第二發(fā)光試劑，所述感光試劑能夠分別與所述第一發(fā)光試劑和第二發(fā)光試劑反應(yīng)發(fā)出不同波長的信號。

49、在一些實施方式中，所述感光試劑包括第一抗體/抗原包被的感光微球。

50、在一些實施方式中，所述第一發(fā)光試劑包括受體修飾的發(fā)光微球fg1。

51、在一些實施方式中，所述第二發(fā)光試劑包括第三抗體/抗原包被的發(fā)光微球fg2。

52、在一些實施方式中，所述發(fā)光微球fg1和所述發(fā)光微球fg2包含不同的鑭系元素金屬以使其能夠發(fā)出不同波長的信號。

53、在一些實施方式中，所述鑭系元素金屬選自鑭、鈰、鐠、釹、钷、釤、銪、釓、鋱、鏑、鈥、鉺、銩、鐿、镥中的至少一種。

54、在一些實施方式中，所述試劑盒還包括配體修飾的第二抗體/抗原。

55、在一些實施方式中，配體和受體特異性結(jié)合。

56、在一些實施方式中，所述配體/受體包括納米金/碘乙酰(iodacetyl)-巰基、氨基-醛基/羧基/異硫氰基、硅烷基-丙烯酰胺、親和素/鏈霉親和素與生物素/生物素類似物、抗體-抗抗體、半抗原-抗體、肽段標(biāo)簽-抗標(biāo)簽抗體、可基因編碼的多肽-蛋白質(zhì)反應(yīng)對的組合。

57、在一些實施方式中，所述第一抗體/抗原和所述第二抗體/抗原與所述目標(biāo)抗原/抗體上的不同位點結(jié)合。

58、在一些實施方式中，所述第一抗體/抗原和所述第三抗體/抗原與所述目標(biāo)抗原/抗體上的不同位點結(jié)合。

59、在一些實施方式中，所述第二抗體/抗原和所述第三抗體/抗原的與所述目標(biāo)抗原/抗體上的相同位點結(jié)合。

60、根據(jù)本公開的第四方面，提供了第一方面所述方法、第二方面所述系統(tǒng)或第三方面所述試劑盒在檢測目標(biāo)抗原/抗體中的應(yīng)用。

61、在一些實施方式中，所述目標(biāo)抗原/抗體包括疾病標(biāo)志物。

62、在一些實施方式中，所述疾病標(biāo)志物包括腫瘤標(biāo)志物、心肌標(biāo)志物、甲功標(biāo)志物、性激素標(biāo)志物、傳染病標(biāo)志物、炎癥標(biāo)志物等。

63、在一些實施方式中，所述腫瘤標(biāo)志物包括ca19-9抗原、ca15-3抗原、ca72-4抗原等。

64、本公開所述檢測方法，因待測樣本不需進(jìn)行稀釋操作而更加省時省力；與傳統(tǒng)方法的直接檢測相比，提升檢測范圍，可實現(xiàn)改善hook效應(yīng)的目標(biāo)。