本公開涉及用于測量光發(fā)射的系統(tǒng)和方法，并且更具體地，涉及用于測量從熒光標(biāo)記的生物細(xì)胞發(fā)出的光的光學(xué)系統(tǒng)，該光學(xué)系統(tǒng)可以用于分析生物細(xì)胞群體。

背景技術(shù)：

1、流式細(xì)胞術(shù)(flow?cytometry)是一種用于探測和測量生物細(xì)胞群體的物理和化學(xué)特性的技術(shù)。大致來說，該過程涉及用熒光染料(fluorescent?dye)來標(biāo)記細(xì)胞生物標(biāo)記物(cell?biomarker)，并且使細(xì)胞流過流動池(flow?cell)。在細(xì)胞通過流動池時，細(xì)胞會被調(diào)整到使得熒光染料發(fā)出熒光的頻率的光源照射。該熒光被測量以揭示與細(xì)胞群體和特性有關(guān)的信息。

2、實(shí)際上，大多數(shù)流式細(xì)胞術(shù)涉及多色流式細(xì)胞術(shù)，其檢查混合細(xì)胞群體，例如，在血液和組織中發(fā)現(xiàn)的不同細(xì)胞類型。這些細(xì)胞類型通常通過下述方式來彼此區(qū)分：用在不同波長下發(fā)出熒光的不同熒光染料對特定于不同生物標(biāo)記物的抗體或抗體片段進(jìn)行標(biāo)記。由于生物系統(tǒng)的復(fù)雜性，用于標(biāo)記的生物標(biāo)記物的數(shù)量大幅增加。同樣，越來越多的熒光染料變得可用，這大大擴(kuò)展了在一個實(shí)驗(yàn)中分析更多生物標(biāo)記物的能力。

3、此外，先進(jìn)的電子系統(tǒng)已經(jīng)被設(shè)計(jì)用于同時地并且以極快的速度從更多的熒光通道獲取數(shù)據(jù)。然而，即使有了先進(jìn)的電子設(shè)備，傳統(tǒng)流式細(xì)胞儀(flow?cytometer)的能力仍然有限，因?yàn)樗鼈兓趯⑹占降臒晒庑盘柗至褳殡x散通道，并且使用覆蓋狹窄波長段的單個通道來探測一種特定熒光染料，并且因此具有相似發(fā)射光譜的一些熒光染料無法在一個實(shí)驗(yàn)中同時使用。此外，使用傳統(tǒng)流式細(xì)胞儀(如果可能的話)會顯著犧牲同時探測具有顯著光譜重疊的一些熒光染料的能力。近年來，光譜流式細(xì)胞儀的發(fā)展已經(jīng)通過下述方式解決了傳統(tǒng)流式細(xì)胞儀的局限性：收集較寬波長范圍內(nèi)的光，包含多個離散通道，其中來自每個通道的光被共同地收集(即，光譜數(shù)據(jù))。去卷積算法被應(yīng)用于用多個熒光染料染色的樣本(多染色樣本)的收集到的光譜數(shù)據(jù)，來計(jì)算樣本中使用的每個熒光染料的熒光信號強(qiáng)度，使用了來自每個單獨(dú)熒光染料(單染色樣本)的光譜數(shù)據(jù)作為參考。然而，設(shè)計(jì)光譜流式細(xì)胞儀的關(guān)鍵挑戰(zhàn)是：(1)如何在熒光染料被每個激光器激發(fā)時收集來自細(xì)胞或顆粒的發(fā)出的熒光；(2)如何將發(fā)出的熒光分散或分裂為較大波長范圍(即，360-900nm)內(nèi)的連續(xù)光譜，并且探測特定較窄波長范圍(即，一個熒光探測通道)內(nèi)的分散光。

4、對于光譜流式細(xì)胞儀和大多數(shù)流式細(xì)胞儀，光收集是通過使用光纖來實(shí)現(xiàn)的。該方法使用光收集光學(xué)元件從每個不同激光器收集熒光，這些不同激光器通常沿著流動通道在空間上分離，并且將熒光成像到不同聚焦點(diǎn)。對于每個激發(fā)激光器，需要一個光纖來收集由其激發(fā)的熒光。因此，對于n個激光器，需要使用n個光纖來收集由所有激光器激發(fā)的熒光。光收集光學(xué)元件可以是專門設(shè)計(jì)的物鏡(objective)，或者多個光學(xué)元件(例如，透鏡)，其收集來自單個激光器的發(fā)射光并且將該發(fā)射光聚焦到單個聚焦點(diǎn)，從而將所有發(fā)射光成像到不同聚焦點(diǎn)。在聚焦平面處放置光纖陣列，其中每個光纖匹配來自一個激光器的一個聚焦點(diǎn)，并且用于引導(dǎo)每個聚焦點(diǎn)處的光通過分光組件(并且然后在不同且連續(xù)波長范圍處的分裂光或分散光將傳播到針對每個激光器的離散光電探測器陣列)。為了將光耦合到放置在聚焦平面處的靠近光收集光學(xué)元件的光纖陣列，光收集光學(xué)元件系統(tǒng)通常被設(shè)計(jì)具有低放大倍率(例如，<10倍)和短聚焦距離。例如，激光器通常沿著流式細(xì)胞儀中的流動通道在空間上分離50μm至200μm。光纖陣列通常間隔500μm至1mm。因此，光收集光學(xué)元件的放大倍率不能太高。否則，聚焦平面處的光無法有效地耦合到光纖。光纖陣列與每個聚焦光斑的對準(zhǔn)非常重要，并且需要非常高的機(jī)械對準(zhǔn)精度。然而，即使有對準(zhǔn)良好的光纖陣列，由于通過流動池的每個細(xì)胞或顆粒的位置不同，聚焦光斑也會發(fā)生變化。這導(dǎo)致每個光纖收集到的光信號強(qiáng)度發(fā)生變化，從而導(dǎo)致探測到的熒光信號的變異系數(shù)(coefficient?ofvariation，cv)較大。特別是在較高樣本流速下，cv可能會變得不合理地校大。樣本流速越高，流動通道內(nèi)的樣本流的核心直徑越大。細(xì)胞和顆粒具有偏離樣本核心流的中心的較大空間。因此，相對于位置固定的光纖，在光收集光學(xué)元件之后的聚焦光斑在位置上變化更多。并且作為結(jié)果，在每個聚焦光斑處耦合到光纖的光強(qiáng)度發(fā)生變化，并且導(dǎo)致較大cv。因此，在光收集系統(tǒng)中使用光纖會產(chǎn)生較大(例如，較差)信號cv，特別是在高通量流式細(xì)胞術(shù)分析中樣本流速較高時。此外，由于光纖的數(shù)值孔徑較小(參見例如，光纖中的數(shù)值孔徑(questtel.com))，系統(tǒng)的整體光收集效率降低，這導(dǎo)致熒光信號探測靈敏度下降。此外，光纖還會隨著時間的推移而退化，并且需要頻繁維護(hù)或維修服務(wù)。對光纖的這類持續(xù)維護(hù)增加了額外的擁有成本。與光纖方法相關(guān)聯(lián)的另一個問題是，一個激光器需要一組分光光學(xué)元件，這可能涉及光分散元件和/或諸如二色鏡(dichroic?mirror)和帶通濾波器之類的光學(xué)組件。在激光器的數(shù)量增加時，用于對光進(jìn)行分散或分裂的光學(xué)組件的數(shù)量也增加，系統(tǒng)變得非常復(fù)雜，并且成本顯著增加。

5、兩種通用方法(光學(xué)濾波方法和光學(xué)分散方法)已經(jīng)被用于在光譜和其他流式細(xì)胞儀中對光進(jìn)行分裂和分散。光學(xué)濾波方法是使用諸如二色鏡和帶通濾波器之類的光學(xué)組件將光分裂為不同波長范圍。如上所述，在典型流式細(xì)胞儀中，一個激光器需要一組這類光學(xué)組件。在激光器的數(shù)量增加時，這類光學(xué)組件的數(shù)量也增加，系統(tǒng)變得非常復(fù)雜，并且成本顯著增加。

6、光學(xué)分散方法使用一種能夠?qū)⒐夥稚檫B續(xù)光譜的光學(xué)元件，例如，分散棱鏡或衍射光柵。在這種類型的設(shè)計(jì)中，光的分散模式是固定的(即，從短波長到長波長)，并且通常在整個光譜內(nèi)是非線性的(即，在空間上分布不均勻)。因此，每個探測通道(即，分散光的特定波長范圍)將在波長的狹窄程度上受到限制。此外，由于從光學(xué)光分散元件發(fā)出的光在空間上的傳播通常非常狹窄，這使得物理上放置光學(xué)探測器陣列以探測每個窄波長范圍內(nèi)的光非常困難。在一種方法中，使用多通道光電倍增管(photomultiplier，pmt)來進(jìn)行光探測，但是多通道pmt非常昂貴。隨著激光器和熒光通道的數(shù)量增加，這類系統(tǒng)的設(shè)計(jì)變得更為復(fù)雜。例如，可能需要光分散元件陣列來實(shí)現(xiàn)探測通道的窄波長范圍，其中每個分散元件都需要被布置具有高機(jī)械容限(即，高制造成本)。除了系統(tǒng)復(fù)雜性之外，光學(xué)分散元件陣列還會減少收集到的光的傳輸，這導(dǎo)致顯著的光損失和熒光信號探測靈敏度降低。

7、因此，仍然需要用于流式細(xì)胞術(shù)的新系統(tǒng)和方法，該新系統(tǒng)和方法增加在單個實(shí)驗(yàn)中可用的熒光染料的數(shù)量。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本公開解決了本領(lǐng)域的上述不足，并且提供了相關(guān)益處。在一個實(shí)施例中，這是通過一種用于測量光的光學(xué)系統(tǒng)來實(shí)現(xiàn)的，該系統(tǒng)包括：流動池，所述流動池的長度和寬度允許生物細(xì)胞通過；多個不同激發(fā)光源，所述多個不同激發(fā)光源將光引導(dǎo)到沿著所述流動池的長度的不同位置；共享光收集光學(xué)元件和共享放大光學(xué)元件，所述共享光收集光學(xué)元件和共享放大光學(xué)元件被配置為收集從所述流動池的不同位置發(fā)出的光，并根據(jù)不同波長范圍將收集到的光放大并聚焦到指定距離的焦平面上，并且根據(jù)發(fā)出光的所述流動池的每個不同位置，將收集到的光放大并聚焦到沿著所述焦平面的不同位置；分光模塊，所述分光模塊具有以下述方式布置的分光光學(xué)元件，在該方式中，使得所述分光光學(xué)元件被從所述流動池的每個不同位置發(fā)出的放大光共享，并且所述分光光學(xué)元件配置為將從所述流動池的每個不同位置發(fā)出的放大光分裂到通道陣列，每個通道對應(yīng)于單獨(dú)的波長范圍；探測模塊陣列，其中，每個探測模塊專用于所述通道陣列中的單個通道，并且其中，每個探測模塊包括：球面透鏡陣列，所述球面透鏡陣列沿著收集到的光的傳播方向針對每個不同波長范圍位于每個不同聚焦距離處，該陣列中的每個球面透鏡被配置為接收從所述流動池的不同位置中的一個位置發(fā)出的放大光，并且將接收到的放大光引導(dǎo)到相應(yīng)光電探測器上的預(yù)定區(qū)域；源極光電探測器陣列，所述光電探測器陣列被配置為測量從每個球面透鏡引導(dǎo)出的放大光，使得一個光電探測器測量來自所述流動池的不同位置中的一個位置的處于一個波長范圍內(nèi)的收集到的光。

2、在一些實(shí)施例中，多個激發(fā)光源包括多個激光光源。在進(jìn)一步的實(shí)施例中，所述激光光源通過光束整形光學(xué)元件被整形為設(shè)計(jì)的幾何形狀，并且聚焦到所述流動池內(nèi)的不同位置。

3、在一些實(shí)施例中，多個不同激發(fā)光源包括5個以上的激發(fā)光源。在進(jìn)一步的實(shí)施例中，存在10個以上的激發(fā)光源。在進(jìn)一步的實(shí)施例中，可選地存在15個以上的激發(fā)光源。

4、在一些實(shí)施例中，光從所述激發(fā)光源被引導(dǎo)到的所述流動池上的相鄰位置之間的距離為50μm至250μm。在進(jìn)一步的實(shí)施例中，該距離為50μm至150μm。

5、在一些實(shí)施例中，共享光收集光學(xué)元件將光引導(dǎo)到所述共享放大光學(xué)元件，所述共享放大光學(xué)元件放大從所述流動池的不同位置發(fā)出的光之間的豎直分隔距離。在進(jìn)一步的實(shí)施例中，共享放大光學(xué)元件包括一組物鏡，該組物鏡的放大率為20倍至250倍，可選地為30倍至100倍，可選地為35倍至75倍，可選地為40倍至60倍。相鄰光之間的示例性豎直分隔距離在球面透鏡陣列處小于30mm。在一些實(shí)施例中，所述豎直分隔距離在球面透鏡陣列處為1mm至10mm。

6、作為非限制性示例，多個激發(fā)光源將光引導(dǎo)到沿著所述流動池的相隔100μm的相鄰位置，所述共享放大光學(xué)元件具有55倍的放大率，并且在所述球面透鏡陣列處接收到的相鄰光被分隔開5.5mm。

7、在一些實(shí)施例中，分光模塊通過一系列二色鏡和帶通濾波器來傳播光，以將放大光分裂為多個不同波長范圍。在一些實(shí)施例中，多個波長范圍包括從320nm至1000nm的波長范圍。

8、在一些實(shí)施例中，激發(fā)光源包括349nm、405nm、488nm、561nm和637nm的激光器。作為非限制性示例，不同波長范圍包括372nm至389nm、417nm至431nm、431nm至449nm、449nm至461nm、461nm至477nm、500nm至517nm、517nm至534nm、534nm至552nm、573nm至592nm、592nm至608nm、608nm至628nm、650nm至672nm、672nm至691nm、691nm至709nm、709nm至726nm、726nm至744nm、744nm至770nm、770nm至798nm和798nm至832nm。

9、在一些實(shí)施例中，從不同位置發(fā)出的光響應(yīng)于穿過流動通道的不同流體特性和/或激發(fā)光源的定位的變化而搖擺。在進(jìn)一步的實(shí)施例中，每個陣列的球面透鏡將搖擺光引導(dǎo)到所述光電探測器的同一區(qū)域，在該區(qū)域中探測到的光是穩(wěn)定的。

10、在一些實(shí)施例中，光電探測器系統(tǒng)包括硅光電倍增管(sipm)探測器。

11、在一些實(shí)施例中，每個球面透鏡被專門設(shè)計(jì)為使得光電探測器上的光斑的直徑與探測器的有效探測區(qū)域相對應(yīng)。

12、在一些實(shí)施例中，收集光學(xué)元件和球面鏡被規(guī)定為使得相應(yīng)光電探測器上的探測到的光斑不受聚焦在球面透鏡上的收集到的光的位置變化的影響。

13、在一些實(shí)施例中，球面透鏡被設(shè)計(jì)為使得相應(yīng)光電探測器上的探測到的光信號對流動通道內(nèi)的生物細(xì)胞的水平位置波動不敏感。

14、在一些實(shí)施例中，一組對準(zhǔn)光學(xué)元件被配置為將放大光對準(zhǔn)到所述分光模塊和所述球面透鏡陣列。

15、在一些實(shí)施例中，任一光學(xué)系統(tǒng)被集成到流式細(xì)胞儀中，并且因此流式細(xì)胞儀可以被提供有光學(xué)系統(tǒng)。

16、在本發(fā)明的一個相關(guān)方面，提供了一種表征生物細(xì)胞的方法，該方法包括：使生物細(xì)胞通過流動池，所述生物細(xì)胞被多個熒光標(biāo)記物標(biāo)記，所述多個熒光標(biāo)記物在被激發(fā)時以不同波長發(fā)出熒光，附著到細(xì)胞組分(moiety)的、或者不存在于細(xì)胞組分中的標(biāo)簽通過標(biāo)記物的存在、缺失或豐度來共同表征所述生物細(xì)胞；在所述生物細(xì)胞通過沿著所述流動池的長度的不同位置時，將光引導(dǎo)到所述不同位置；在所述生物細(xì)胞通過時，收集從所述流動池的每個不同位置發(fā)出的光；根據(jù)不同波長范圍將收集到的光放大并聚焦到不同聚焦距離，并且根據(jù)發(fā)出收集到的光的所述流動池的每個不同位置，將收集到的光放大并聚焦到每個聚焦距離內(nèi)的不同位置；將放大光分裂為多個不同波長范圍，其中，不同熒光波長被劃分在所述多個不同波長范圍之間；由球面透鏡的同一陣列接收從沿著所述流動池的長度的不同位置發(fā)出的同一波長范圍的光，其中，每個陣列內(nèi)的不同球面透鏡接收從所述流動池的不同位置發(fā)出的光；將來自每個球面透鏡的光引導(dǎo)到不同光電探測器；以及測量每個不同光電探測器處的光，從而識別所述標(biāo)記物的存在、缺失或豐度并且識別細(xì)胞組分，以表征所述生物細(xì)胞。