本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥，涉及golga7作為分子標(biāo)志物在治療nras突變陽(yáng)性腫瘤中的應(yīng)用，具體涉及golga7抑制劑在制備nras突變陽(yáng)性腫瘤治療藥物中的應(yīng)用，進(jìn)一步涉及敲除或抑制golga7基因的golga7基因單導(dǎo)向rna(sgrna)和短發(fā)卡rna(shrna)在制備抗nras突變陽(yáng)性腫瘤生物治療藥物，尤其是在血液腫瘤中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、ras蛋白的激活突變是驅(qū)動(dòng)人類腫瘤發(fā)生的主要突變蛋白之一，存在于約25％的人類惡性腫瘤中。人類的三種ras基因共編碼四種蛋白質(zhì)：hras，nras，以及kras剪接變異體kras4a和kras4b。四種ras蛋白中的每一種都是小gtpase超家族的成員，ras的突變導(dǎo)致ras保持與gtp結(jié)合的激活狀態(tài)，ras激活絲裂原活化蛋白激酶(mapk)和磷脂酰肌醇3-激酶(pi3k)通路等幾種下游效應(yīng)通路，導(dǎo)致細(xì)胞的異常增殖，從而進(jìn)一步導(dǎo)致疾病的發(fā)生。盡管ras蛋白的作用很大，但針對(duì)這些突變r(jià)as蛋白的療法卻明顯缺乏。甚至在10年前，ras抑制劑仍然難以捉摸，以至于ras被稱為“不可成藥”靶點(diǎn)。究其原因，這與ras與gtp的極高親和力，其蛋白結(jié)構(gòu)中缺乏適合傳統(tǒng)小分子結(jié)合的口袋，以及下游復(fù)雜通路的互相代償密切相關(guān)。因此尋找其他阻抑ras腫瘤生長(zhǎng)信號(hào)的靶點(diǎn)或通路對(duì)于ras相關(guān)腫瘤的治療至關(guān)重要。

2、nras基因突變存在于大約10％血液系統(tǒng)腫瘤患者中，其中最常見的突變形式是在其第12位密碼子發(fā)生甘氨酸(g)至天冬氨酸殘基(d)的點(diǎn)突變(超過(guò)50％)，即nras?g12d。棕櫚?；揎検莕ras突變蛋白質(zhì)上游成熟途徑所必需的，直接影響其細(xì)胞質(zhì)膜定位以及信號(hào)傳遞的生物學(xué)功能。既往研究表明，棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶zdhhc9和高爾基體蛋白golga7(golgina7，又稱gcp16)在酵母和真核細(xì)胞中共同形成復(fù)合物，促進(jìn)nras棕櫚?；Ｎ覀冄芯勘砻?，抑制zdhhc9可延緩nras誘導(dǎo)的白血病發(fā)生發(fā)展。因此我們對(duì)golga7敲除或敲低在nras突變陽(yáng)性白血病和實(shí)體瘤中進(jìn)行了系統(tǒng)性研究。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的在于提供基于基因表達(dá)調(diào)控的golga7抑制劑在nras突變陽(yáng)性腫瘤治療中的用途。本發(fā)明第二目的在于提供一種nras突變陽(yáng)性腫瘤的治療藥物。

2、本發(fā)明系統(tǒng)性地研究了golga7在nras驅(qū)動(dòng)白血病中的作用及其機(jī)制，尋找可能成為nras靶點(diǎn)的關(guān)鍵分子。以課題組前期已經(jīng)建立的ras特異性細(xì)胞活性篩選系統(tǒng)為基礎(chǔ)，證實(shí)了敲除golga7能夠選擇性抑制突變nras依賴細(xì)胞的增殖、凋亡和分化以及nras的相關(guān)下游信號(hào)通路。進(jìn)一步的機(jī)制研究發(fā)現(xiàn)golga7僅特異性抑制nras的細(xì)胞質(zhì)膜定位，而對(duì)hras、kras4a及kras4b的質(zhì)膜定位均無(wú)顯著影響。通過(guò)免疫熒光實(shí)驗(yàn)我們發(fā)現(xiàn)，golga7主要將nras阻滯于高爾基體的順式面及中間層，并且這一定位改變與nras是否突變、突變位點(diǎn)或突變后氨基酸均無(wú)關(guān)，說(shuō)明golga7對(duì)nras的定位調(diào)控適用于nras激活相關(guān)腫瘤。

3、既往研究表明golga7是參與nras棕櫚?；闹匾肿?，而nras的棕櫚?；质瞧滟|(zhì)膜定位的必要條件，因此我們首先檢測(cè)了敲除golga7后細(xì)胞中nras棕櫚酰化水平的改變。有意思的是，以棕櫚酰化位點(diǎn)突變的細(xì)胞為對(duì)照，敲除golga7對(duì)nras的棕櫚酰化水平并無(wú)明顯作用，這說(shuō)明golga7特異性影響nras質(zhì)膜定位是通過(guò)非棕櫚?；耐緩絹?lái)完成的。因此，我們推測(cè)golga7可能是通過(guò)影響nras從高爾基體到質(zhì)膜的運(yùn)輸過(guò)程從而干擾nras正常膜定位的。利用熒光漂白后恢復(fù)技術(shù)與光激活實(shí)驗(yàn)我們證實(shí)，golga7影響了nras從高爾基體到質(zhì)膜的順向運(yùn)輸過(guò)程，從而影響了nras的質(zhì)膜定位及其腫瘤轉(zhuǎn)化能力。綜合以上結(jié)果，我們可以得出，golga7通過(guò)影響nras從高爾基體到質(zhì)膜的順向運(yùn)輸影響了nras的正常膜定位，抑制了nras的下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，并且這種作用與棕櫚酰化無(wú)關(guān)。這一發(fā)現(xiàn)填補(bǔ)了目前golga7功能研究上的空白，強(qiáng)調(diào)了golga7對(duì)nras的高選擇性抑制作用，提示了golga7或其中轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)分子可能是nras相關(guān)腫瘤的有效治療靶點(diǎn)。

4、基于上述研究，本發(fā)明的具體技術(shù)方案如下：

5、本發(fā)明的第一方面，提供了golga7抑制劑在制備nras突變陽(yáng)性腫瘤治療藥物中的應(yīng)用。

6、本發(fā)明的藥物針對(duì)的對(duì)象選自下組：以白血病、骨髓瘤、淋巴瘤為主的血液腫瘤，也包括黑色素瘤、結(jié)直腸癌等實(shí)體腫瘤，這些都屬于nras突變惡性腫瘤。

7、優(yōu)選的，golga7選自如下任一種物質(zhì)：golga7基因、golga7的mrna或cdna、golga7蛋白或前述任一種的活性或標(biāo)志性片段。

8、進(jìn)一步，所述golga7為包括如下序列的分子：

9、(a)具有如seq?id?no.1所示序列的golga7分子；

10、(b)在嚴(yán)格條件下與(a)限定的序列雜交的分子；

11、(c)與(a)或(b)中序列具有70％以上(例如75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％、99.5％以上，或其間的任何數(shù)值或數(shù)值范圍)的序列同源性且所編碼多肽或蛋白質(zhì)具有影響nras的質(zhì)膜定位及其腫瘤轉(zhuǎn)化能力的golga7分子，例如經(jīng)密碼子優(yōu)化獲得的golga7分子；

12、(d)上述任一所述golga7分子編碼的多肽，或所述多肽中經(jīng)過(guò)取代、缺失或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸的衍生蛋白。

13、如本文所用，術(shù)語(yǔ)“嚴(yán)格條件”是指：(1)在較低離子強(qiáng)度和較高溫度下的雜交和洗脫，如0.2×ssc，0.1％sds，60℃；或(2)雜交時(shí)加有變性劑，如50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清/0.1％ficoll，42℃等；或(3)僅在兩條序列之間的同一性至少在50％，優(yōu)選55％以上、60％以上、65％以上、70％以上、75％以上、80％以上、85％以上或90％以上，更優(yōu)選是95％以上時(shí)才發(fā)生雜交。例如，所述序列可為(a)中所限定序列的互補(bǔ)序列。

14、優(yōu)選的，golga7抑制劑選自如下任一種物質(zhì)：降低golga7表達(dá)水平、降低golga7活性或促進(jìn)golga7代謝的物質(zhì)。如該golga7抑制劑包括golga7的sgrna及crisper-cas9mrna、小干擾rna分子、短發(fā)夾rna、反義核苷酸中的任意一種，或攜帶上述任一種物質(zhì)的納米顆粒、病毒載體、peg修飾蛋白、蛋白微球、脂質(zhì)體或細(xì)胞外囊泡。

15、本發(fā)明具體實(shí)施方式中選用的golga7抑制劑為golga7基因敲除所需的基于crispr/cas9基因編輯技術(shù)設(shè)計(jì)的3條sggolga7，或者為3條golga7?shrna或sirna，

16、其中，sggolga7的核苷酸序列如下所示：

17、a)5’-caccgactcgcagtcctcgctcaat-3’(seq?id?no.2)；

18、b)5’-caccgctgacagaccctattgagcg-3’(seq?id?no.3)；

19、c)5’-caccgacccggttctccagctccgc-3’(seq?id?no.4)，

20、golga7?shrna/sirna的核苷酸序列如下所示：

21、a)5’-gcagcagtttgaagaaacatt-3’(seq?id?no.5)；

22、b)5’-ccggaaaggtgttcattcatt-3’(seq?id?no.6)；

23、c)5’-ggttgtttggcttgtttaatt-3’(seq?id?no.7)。

24、應(yīng)理解，本文的golga7分子優(yōu)選獲自人，獲自其它動(dòng)物的與人golga7高度同源(如具有70％以上、75％以上、80％以上，更優(yōu)選85％以上如85％、90％、95％、98％甚至99％或以上的序列相同性)的其它golga7分子也在本發(fā)明優(yōu)選考慮的等同范圍之內(nèi)。比對(duì)序列相同性的方法和工具也是本領(lǐng)域周知的，如blast。

25、來(lái)源方面，本發(fā)明抑制劑選自：天然純化物質(zhì)、經(jīng)修飾的天然純化物質(zhì)、半合成物質(zhì)、化學(xué)合成物質(zhì)；進(jìn)一步的，所述抑制劑源自哺乳動(dòng)物，如人、非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物(例如猩猩、猿)、嚙齒動(dòng)物(例如大鼠、小鼠、豚鼠)、寵物(例如貓、狗)、家畜(例如馬、牛、羊、豬、兔)。

26、本發(fā)明的第二方面，提供了一種golga7抑制劑重組載體，包括表達(dá)載體以及插入設(shè)置在該表達(dá)載體上的golga7的sgrna及crisper-cas9?mrna、golga7?sirna、golga7shrna或strip反義核苷酸。

27、其中，golga7的sgrna以及shrna/sirna的序列如上所示。

28、本發(fā)明第三方面，提供了上述golga7抑制劑重組載體在制備nras突變陽(yáng)性腫瘤治療藥物中的應(yīng)用。

29、本發(fā)明第四方面，提供了一種nras突變陽(yáng)性腫瘤治療藥物組合物，包括活性組分以及醫(yī)學(xué)上可接受的賦形劑、載體或稀釋劑。其中，該活性組分為上述golga7抑制劑或golga7抑制劑重組載體。

30、優(yōu)選的，該藥物組合物與其他抗腫瘤活性成分聯(lián)用。腫瘤治療包括但不限于：手術(shù)、放療、化療、免疫療法，優(yōu)選化療。

31、術(shù)語(yǔ)“藥學(xué)上/免疫學(xué)上可接受的”成分是適用于人和/或動(dòng)物而無(wú)過(guò)度不良副反應(yīng)(如毒性、刺激和變態(tài)反應(yīng))的，即有合理的效益/風(fēng)險(xiǎn)比的物質(zhì)。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“有效量”是指可對(duì)人和/或動(dòng)物產(chǎn)生功能或活性的且可被人和/或動(dòng)物所接受的量。

32、術(shù)語(yǔ)“藥學(xué)上可接受的載體”指用于治療劑給藥的載體，包括各種賦形劑和稀釋劑。該術(shù)語(yǔ)指這樣一些藥劑載體：它們本身并不是必要的活性成分，且施用后沒(méi)有過(guò)分的毒性。合適的載體是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所熟知的。在《雷明頓藥物科學(xué)》(remington’spharmaceutical?sciences，mack?pub.co.，n.j.1991)中可找到關(guān)于藥學(xué)上可接受的賦形劑的充分討論。

33、在組合物中藥學(xué)上可接受的載體可含有液體，如水、鹽水、甘油和乙醇。另外，這些載體中還可能存在輔助性的物質(zhì)，如填充劑、崩解劑、潤(rùn)滑劑、助流劑、泡騰劑、潤(rùn)濕劑或乳化劑、矯味劑、ph緩沖物質(zhì)等。通常，可將這些物質(zhì)配制于無(wú)毒的、惰性的和藥學(xué)上可接受的水性載體介質(zhì)中，其中ph通常約為5-8，較佳地，ph約為6-8。

34、本文的組合物中的活性物質(zhì)占組合物總重量的0.001～99.9wt％；優(yōu)選為組合物總重量的1～95wt％，較優(yōu)選為5～90wt％，更優(yōu)選10～80wt％，余量為藥學(xué)上可接受的載體以及其它添加劑等物質(zhì)。

35、本發(fā)明的組合物，可以為固態(tài)(如顆粒劑、片劑、凍干粉、栓劑、膠囊、舌下含片)或液態(tài)(如口服液)或其它合適的形狀。給藥途徑可采用：(1)直接裸dna/rna注射法；(2)將golga7分子相關(guān)sgrna、crispr-cas9?mrna與轉(zhuǎn)鐵蛋白/多聚l-賴氨酸復(fù)合物連接，以增強(qiáng)其生物效應(yīng)；(3)golga7?sgrna和crispr-cas9?mrna與帶正電荷的脂類形成復(fù)合物，以克服磷酸骨架負(fù)電荷所致的穿越細(xì)胞膜的困難；(4)用脂質(zhì)體包裹golga7?sgrna和crispr-cas9mrna后介導(dǎo)進(jìn)入細(xì)胞，既有利于大分子的順利進(jìn)入又免受細(xì)胞外各種酶的水解作用；(5)golga7?sgrna和crispr-cas9?mrna與膽固醇結(jié)合使其胞漿保持時(shí)間增加10倍；(6)用免疫脂質(zhì)體轉(zhuǎn)運(yùn)golga7?sgrna和crispr-cas9mrna可使其特異性轉(zhuǎn)運(yùn)至靶組織和靶細(xì)胞；(7)將golga7?sgrna和crispr-cas9mrna體外轉(zhuǎn)染給轉(zhuǎn)載細(xì)胞(如成纖維細(xì)胞)也可較好地將相關(guān)藥物載入靶細(xì)胞內(nèi)；(8)電打孔(electroporation)，即借助于電流將golga7?sgrna和crispr-cas9?mrna等導(dǎo)入靶細(xì)胞。

36、如本發(fā)明所用，術(shù)語(yǔ)“單位劑型”是指為了服用方便，將本發(fā)明的組合物制備成單次服用所需的劑型，包括但不限于各種固體劑(如片劑)、液體劑、膠囊劑、緩釋劑。

37、在本發(fā)明的一些實(shí)施方式中，所述組合物為單位劑型或多劑型?！皢挝粍┬汀笔侵笧榱耸┯梅奖悖瑢a(chǎn)品制備成單次施用所需劑量的劑型，包括但不限于各種固體劑(如片劑)、液體劑、膠囊劑、緩釋劑。在本文的一些實(shí)施方式中，以適當(dāng)?shù)念l率給予本文的組合物，例如每天、隔天、每周、每隔一周或兩周、每月、每隔一個(gè)月或兩個(gè)月施用本文的組合物，例如施用1～6劑。

38、應(yīng)理解，所用活性物質(zhì)的有效劑量可隨待施用或治療的對(duì)象的嚴(yán)重程度而變化。具體情況根據(jù)對(duì)象的個(gè)體情況(例如對(duì)象體重、年齡、身體狀況、所需達(dá)到的效果)來(lái)決定，這在熟練醫(yī)師可以判斷的范圍內(nèi)。

39、本發(fā)明的給藥方式多樣，包括口服、注射(例如直接裸dna或蛋白質(zhì)注射法、脂質(zhì)體包裹dna、rna或蛋白質(zhì)注射法)、金包被基因槍轟擊法、繁殖缺陷細(xì)菌攜帶質(zhì)粒dna法、復(fù)制缺陷腺病毒攜帶目的dna法或目的基因所編碼蛋白質(zhì)、電致孔、經(jīng)靜脈、肺部、黏膜、鼻腔、腹腔內(nèi)、顱內(nèi)、瘤內(nèi)、舌下、頰部、透皮給藥。

40、本發(fā)明第五方面，提供了抗腫瘤的方法，包括給予有需要的對(duì)象治療有效量的golga7?sgrna或shrna。優(yōu)選，在給予本技術(shù)的golga7抑制劑之前、之時(shí)或之后給予其他抗腫瘤藥物。

41、本發(fā)明的有益保障及效果如下：

42、本發(fā)明以golga7基因?yàn)榘悬c(diǎn)，特別利用crispr/cas9基因編輯技術(shù)或rnai干擾技術(shù)進(jìn)行靶向golga7基因生物學(xué)功能的敲除或沉默。本發(fā)明提供的golga7基因單導(dǎo)向rna(sgrna)和短發(fā)卡rna(shrna)可以抑制golga7蛋白質(zhì)表達(dá)水平或活性，從而阻抑nras突變蛋白從高爾基體到細(xì)胞質(zhì)膜的轉(zhuǎn)運(yùn)，進(jìn)而抑制nras突變陽(yáng)性腫瘤細(xì)胞的增殖，這一結(jié)果在人類和小鼠腫瘤模型都得到了很好的驗(yàn)證。以此基因?yàn)榘悬c(diǎn)開發(fā)靶向干預(yù)的藥物，有望應(yīng)用于包括白血病在內(nèi)的血液腫瘤、黑色素瘤、腸癌等在內(nèi)的nras突變陽(yáng)性腫瘤的治療，也為該類腫瘤的治療提供了一種新的治療思路。