本發(fā)明屬于益生菌，具體為一種耐鹽堿抑制弧菌的水產(chǎn)益生菌及其制備工藝。
背景技術(shù)：
1、水產(chǎn)益生菌是一類應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖領(lǐng)域的有益微生物，主要包括乳酸菌、芽孢桿菌、酵母菌等，具有調(diào)節(jié)水質(zhì)、促進(jìn)水產(chǎn)動物生長、提高免疫力等多種功能。這些益生菌能夠通過分泌有益代謝產(chǎn)物，如酶、維生素、抗生素等，改善水體環(huán)境，降低氨氮、亞硝酸鹽等有害物質(zhì)含量，維持水體生態(tài)平衡。同時(shí)，益生菌還能附著在水產(chǎn)動物腸道黏膜上，增強(qiáng)腸道屏障功能，抑制有害菌生長，提高飼料利用率，促進(jìn)水產(chǎn)動物健康成長。在水產(chǎn)養(yǎng)殖中合理使用益生菌，有助于實(shí)現(xiàn)綠色、高效、可持續(xù)的養(yǎng)殖模式，提升水產(chǎn)品質(zhì)量，保障食品安全。
2、但是傳統(tǒng)水產(chǎn)益生菌制劑普遍存在鹽堿環(huán)境適應(yīng)性差、靶向抑菌效能不足及活性成分易失活等缺陷。常規(guī)菌株未經(jīng)定向馴化，難以在高鹽堿水體中穩(wěn)定定殖，且依賴單一代謝產(chǎn)物抑菌易引發(fā)弧菌耐藥性；普通包埋技術(shù)對胃酸及滲透壓的防護(hù)能力有限，導(dǎo)致活菌存活率低、作用時(shí)間短，同時(shí)缺乏對養(yǎng)殖環(huán)境毒素清除和菌群生態(tài)平衡的系統(tǒng)調(diào)控，無法實(shí)現(xiàn)長效抑菌與微生態(tài)修復(fù)的協(xié)同增效。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
1、本發(fā)明的目的在于：為了解決上述提出的問題，提供一種耐鹽堿抑制弧菌的水產(chǎn)益生菌及其制備工藝。
2、本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下：一種耐鹽堿抑制弧菌的水產(chǎn)益生菌，所述水產(chǎn)益生菌包括：
3、核心組合益生菌：嗜鹽芽孢桿菌120份、海洋紅酵母80份、耐堿乳桿菌100份及噬弧菌噬菌體裂解酶工程菌60份；
4、功能代謝增效劑:褐藻寡糖150份、納米二氧化硅負(fù)載γ-聚谷氨酸80份、鹽生杜氏藻提取物70份和fe(iii)-edta螯合物40份；
5、生態(tài)調(diào)控輔料:改性沸石粉180份、海帶發(fā)酵上清液凍干粉90份與四膜蟲包囊粉30份。
6、在一優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述制備工藝包括以下步驟：
7、s1：對嗜鹽芽孢桿菌、耐堿乳桿菌和海洋紅酵母進(jìn)行逐步遞增的鹽度及ph適應(yīng)性培養(yǎng)，篩選獲得耐鹽堿優(yōu)勢菌株。
8、s2：將噬弧菌噬菌體裂解酶工程菌接種于特定培養(yǎng)基，誘導(dǎo)其表達(dá)vp4裂解酶，滅活后收集菌體備用。
9、s3：通過酶解海帶提取物制備褐藻寡糖，采用溶膠-凝膠法合成納米二氧化硅負(fù)載γ-聚谷氨酸，并利用fecl3與edta反應(yīng)生成螯合物。
10、s4：對沸石粉進(jìn)行酸洗改性并負(fù)載抑菌成分，將海帶發(fā)酵液冷凍干燥制粉，對四膜蟲包囊進(jìn)行滅菌干燥處理。
11、s5：將馴化后的核心益生菌、工程菌與功能增效劑在低溫惰性氣體環(huán)境下充分混合。
12、s6：向混合體系中加入改性沸石粉、海帶凍干粉和四膜蟲包囊粉，利用流化床包衣技術(shù)實(shí)現(xiàn)均勻包被。
13、s7：采用海藻酸鈉-殼聚糖包埋菌體作為內(nèi)層，外層覆蓋聚γ-谷氨酸與蒙脫石復(fù)合膜，控制微囊粒徑。
14、s8：通過冷凍干燥和低溫噴霧干燥獲得成品，檢測活菌數(shù)、裂解酶活性及鹽堿環(huán)境耐受性。
15、在一優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述步驟s1中，將嗜鹽芽孢桿菌和耐堿乳桿菌分別接種于初始鹽度為0％、ph為8.0的液體培養(yǎng)基中，于37℃條件下以150rpm振蕩培養(yǎng)24小時(shí)；隨后將鹽度逐步提升至8％、12％、15％，ph同步升至8.5、9.0、9.5，每階段培養(yǎng)48小時(shí)，篩選出耐15％鹽度和ph?9.5的穩(wěn)定菌株。海洋紅酵母采用鹽度為20‰的海水酵母培養(yǎng)基，在25℃靜置培養(yǎng)72小時(shí)，最終獲得高密度生物量。
16、在一優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述步驟s2中，將噬弧菌噬菌體裂解酶工程菌接種于含有0.1％甘氨酸的lb液體培養(yǎng)基中，調(diào)節(jié)初始ph至7.2，于30℃、200rpm條件下發(fā)酵培養(yǎng)18小時(shí)；添加0.5mm?iptg誘導(dǎo)劑，繼續(xù)發(fā)酵6小時(shí)以激活vp4裂解酶表達(dá)。發(fā)酵結(jié)束后，以8000rpm離心10分鐘收集菌體，采用80℃水浴滅活30分鐘，保留裂解酶活性。
17、在一優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述步驟s3中，褐藻寡糖通過褐藻膠裂解酶水解海帶提取物制備，反應(yīng)條件為50℃、ph?6.8持續(xù)6小時(shí)，經(jīng)超濾膜分離獲得分子量500-1000da的寡糖組分。納米二氧化硅負(fù)載γ-聚谷氨酸采用溶膠-凝膠法合成，將10％濃度的γ-聚谷氨酸溶液與介孔二氧化硅以1:5質(zhì)量比混合，40℃攪拌12小時(shí)實(shí)現(xiàn)負(fù)載。fe(iii)-edta螯合物由fecl3與edta二鈉按1:1.2摩爾比在60℃水浴中反應(yīng)2小時(shí)，調(diào)節(jié)ph至6.5后冷卻結(jié)晶。
18、在一優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述步驟s4中，改性沸石粉采用0.5m鹽酸溶液浸泡2小時(shí)，水洗至中性后烘干，與2.5mg/g濃度的枯草菌素溶液混合吸附12小時(shí)。海帶發(fā)酵液由植物乳桿菌接種海帶漿液，于35℃厭氧發(fā)酵72小時(shí)，離心取上清液后經(jīng)-50℃冷凍干燥成粉。四膜蟲包囊通過4℃低溫脅迫和碳源饑餓處理48小時(shí)誘導(dǎo)形成，60℃熱風(fēng)干燥后紫外線輻照滅菌20分鐘。
19、在一優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述步驟s5中，將梯度馴化后的嗜鹽芽孢桿菌、耐堿乳桿菌、海洋紅酵母菌體，與滅活的工程菌按配方比例混合，加入褐藻寡糖、納米二氧化硅負(fù)載γ-聚谷氨酸、鹽生杜氏藻提取物及fe(iii)-edta螯合物，在4℃氮?dú)獗Ｗo(hù)環(huán)境中以50rpm低速攪拌30分鐘，確保物料均勻分散且活菌無氧損傷。
20、在一優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述步驟s6中，將改性沸石粉、海帶凍干粉和四膜蟲包囊粉分三次加入混合體系，采用流化床包衣設(shè)備，以2％羥丙基甲基纖維素溶液為粘合劑，控制進(jìn)風(fēng)溫度38℃、霧化壓力0.3mpa，包衣增重率控制在8％-10％，包被均勻度誤差小于5％。
21、在一優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述步驟s7中，內(nèi)層微囊化采用高壓靜電成型技術(shù)，將混合菌群與2％海藻酸鈉-1％殼聚糖混合液通過8kv電壓形成液滴，落入2％氯化鈣溶液中固化10分鐘；外層以1％聚γ-谷氨酸與3％蒙脫石懸浮液為包材，在12kv電壓下二次包被，固化于0.1m碳酸氫鈉溶液中，最終微囊粒徑控制在150-200μm范圍。
22、在一優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述步驟s8中，微囊產(chǎn)物先經(jīng)-45℃真空冷凍干燥24小時(shí)去除水分，再于60℃進(jìn)風(fēng)溫度的噴霧干燥塔中二次干燥至含水量≤5％。質(zhì)檢包括平板計(jì)數(shù)法檢測活菌數(shù)(需≥1×1011cfu/g)、比色法測定vp4裂解酶活性(≥800u/g)，以及模擬鹽堿環(huán)境(15％?nacl，ph?9.5)下存活率測試(≥85％)。
23、綜上所述，由于采用了上述技術(shù)方案，本發(fā)明的有益效果是：
24、1、本發(fā)明中，核心菌群的梯度馴化培養(yǎng)與工程菌定向表達(dá)技術(shù)，實(shí)現(xiàn)了益生菌對高鹽堿環(huán)境的主動適應(yīng)能力。嗜鹽芽孢桿菌與耐堿乳桿菌經(jīng)階梯式鹽度、ph適應(yīng)性進(jìn)化后，可在養(yǎng)殖水體中穩(wěn)定定殖并持續(xù)分泌抑菌代謝產(chǎn)物；而工程菌表達(dá)的噬菌體裂解酶能精準(zhǔn)破壞弧菌細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)，形成物理-生化雙重抑菌屏障。同時(shí)，功能增效劑與生態(tài)輔料的協(xié)同設(shè)計(jì)，既通過褐藻寡糖、納米載體等成分優(yōu)化菌群代謝活性，又借助改性沸石、四膜蟲包囊等材料構(gòu)建動態(tài)微生態(tài)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，有效阻斷弧菌毒力基因表達(dá)并清除環(huán)境毒素，形成從菌株到生態(tài)系統(tǒng)的立體防護(hù)體系。
25、2、本發(fā)明中，雙層微囊化封裝與低溫干燥工藝的集成應(yīng)用，攻克了活性成分易失活的技術(shù)瓶頸。海藻酸鈉-殼聚糖內(nèi)層包埋技術(shù)保障活菌在加工儲存及消化道中的存活率，外層聚γ-谷氨酸復(fù)合膜則實(shí)現(xiàn)功能成分的緩釋控制，使益生菌在鹽堿水體中持續(xù)釋放抑菌因子長達(dá)72小時(shí)以上。該工藝不僅大幅提升產(chǎn)品對環(huán)境脅迫的耐受性，還通過流化床包衣、靜電微囊等精準(zhǔn)控制技術(shù)，確保菌群分布均勻性與功能穩(wěn)定性，為規(guī)?；a(chǎn)提供可靠保障。