本公開屬于抗體，具體涉及一種胸腺基質(zhì)淋巴細(xì)胞生成素結(jié)合分子及其用途。

背景技術(shù)：

1、胸腺基質(zhì)淋巴細(xì)胞生成素(thymic?stromal?lymphopoietin,tslp)最初在小鼠胸腺基質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)上清中發(fā)現(xiàn)，是b淋巴細(xì)胞生長(zhǎng)因子，主要由上皮細(xì)胞表達(dá)。tslp屬于il-2家族細(xì)胞因子，與il-7最為類似。il-2家族細(xì)胞因子包括il-2、il-4、il-7、il-9、il-15、il-21，它們都是球狀蛋白，含有4個(gè)短鏈α螺旋，都在促進(jìn)和維持t淋巴細(xì)胞群中發(fā)揮重要作用(expert?rev?clin?immunol.2014,10(11):1463–1474.nature?communications,2017,8)。最新的研究結(jié)果表明tslp是人體免疫屏障的“警報(bào)蛋白”，在皮膚角質(zhì)細(xì)胞、肺部和腸道上皮細(xì)胞等表面屏障中調(diào)控免疫功能。tslp響應(yīng)病原菌刺激，激活未成熟樹突細(xì)胞、肥大細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞，使它們呈現(xiàn)2型極化表型。tslp信號(hào)異常會(huì)導(dǎo)致人體多種嚴(yán)重的健康問題，目前已經(jīng)證明tslp與哮喘、特應(yīng)性皮炎、特應(yīng)性鼻炎、牛皮蘚、慢性阻塞性肺病(copd)、嗜酸細(xì)胞性食管炎等疾病有關(guān)(nat?immunol.2010,11(4):289–293.expert?rev?clin?immunol.2014,10(11):1463–1474.drugs(2020),80,449–458.advimmunol.2009；101:1–25)。

2、il-2家族細(xì)胞因子結(jié)合各自特異性的受體亞基，以及共享γc這個(gè)共同受體亞基。但是tslp結(jié)合tslpr(crlf2)、il-7ralpha兩個(gè)受體，不與γc受體結(jié)合(expert?rev?clinimmunol.2014,10(11):1463–1474.adv?immunol.2009,101:1–25)。tslp與tslpr和il-7ralpha的結(jié)合具有協(xié)同性。tslp與tslpr結(jié)合，親和力約32nm。而tslp與il-7ralpha不直接結(jié)合(>100nm)。當(dāng)tslp與tslpr結(jié)合形成tslp-tslpr復(fù)合物后才與il-7ralpha結(jié)合，親和力約29nm(nature?communications,2017,8)。

3、tslp基因區(qū)域存在可變啟動(dòng)子，可表達(dá)出long?form?tslp(lftslp)和short?formtslp(sftslp)兩種蛋白(包含信號(hào)肽)。sftslp相比lftslp，n端被截短，僅保留“一個(gè)半”α螺旋結(jié)構(gòu)。研究表明lftslp和sftslp的c末端均存在具有抗菌活性的mkk34抗菌肽，并且sftslp具有更加強(qiáng)大的抗菌活性。sftslp是tslp在人體正常組織中表達(dá)的主要形式，它只在正?？谇徽衬ぁ⑵つw表皮、唾液腺、腸道上皮細(xì)胞組成型表達(dá)，發(fā)揮抗菌活性；在炎癥條件下，sftslp的表達(dá)量下降(在特應(yīng)性皮炎和節(jié)段性回腸炎病理組織中檢測(cè)到)。而lftslp在正常組織中不表達(dá)，僅在特應(yīng)性皮炎、哮喘、潰瘍性結(jié)腸炎、吸煙的口腔粘膜中表達(dá)(pharmaceuticals2016,9,41)。當(dāng)過敏原刺激上皮細(xì)胞后，細(xì)胞中tslp表達(dá)上調(diào)，從而產(chǎn)生th2生成傾向的微環(huán)境，分泌th2型細(xì)胞因子，生成炎癥反應(yīng)性th2細(xì)胞，進(jìn)而觸發(fā)過敏性炎癥反應(yīng)。研究表明，當(dāng)tslp分子與tslpr和il-7r-α組成的異二聚體結(jié)合后，激活jak1和jak2，從而可激活信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)子以及轉(zhuǎn)錄活化子5和3(stat5，3)，并啟動(dòng)下游基因的表達(dá)。tslp廣泛出現(xiàn)在多種變態(tài)反應(yīng)性疾病中，如過敏性鼻炎、過敏性哮喘、濕疹等。此外，在特應(yīng)性皮炎、哮喘、嗜酸性食管炎患者中檢測(cè)到多個(gè)tslp的snp突變，這些突變導(dǎo)致lftslp的高表達(dá)。并且這些突變具有家族遺傳性(expert?rev?clin?immunol.2014,10(11):1463–1474.)。因此開發(fā)針對(duì)lftslp的抗體，阻斷l(xiāng)ftslp異常表達(dá)導(dǎo)致的特應(yīng)性皮炎、哮喘、嗜酸性食管炎、潰瘍性結(jié)腸炎等疾病具有重要的意義。同時(shí)篩選獲得不阻斷c末端具有抗菌活性的mkk34抗菌肽有望保留tslp對(duì)抗外界細(xì)菌感染的能力。

4、目前已經(jīng)上市的抗體tezepelumab結(jié)合在tslp的c末端，可能影響tslp的抗菌肽活性從而導(dǎo)致副作用。另外，研究表明同時(shí)阻斷tslp與tslpr和il-7ralpha的tslp-trap分子在抑制tslp誘導(dǎo)的stat5方面比tezepelumab強(qiáng)20-30倍(nature?communications,2017,8)。因此，開發(fā)不同表位、生物學(xué)活性更強(qiáng)的tslp抗體有望增強(qiáng)藥效，獲得更好的臨床治療效果。

5、傳統(tǒng)抗體分子(mab)在結(jié)構(gòu)上是由兩條相同的重鏈和兩條相同的輕鏈組成，此種結(jié)構(gòu)在哺乳動(dòng)物中是非常保守的。1993年布魯塞爾自由大學(xué)的hamers-casterman等發(fā)現(xiàn)并報(bào)道了駱駝血液中除了傳統(tǒng)的傳統(tǒng)抗體外還存在另一種類型的抗體，與傳統(tǒng)的哺乳動(dòng)物抗體分子結(jié)構(gòu)不同，這種抗體既缺失傳統(tǒng)抗體的輕鏈，也缺少重鏈恒定區(qū)的ch1區(qū)域，被稱為重鏈抗體(heavy?chain?antibody，hcab)。而單域抗體(single-domain?antibody,sdab)則是一種從駱駝科動(dòng)物血清中提取的僅具有重鏈的抗體的可變區(qū)。vhh抗體又被稱為納米抗體(nanobody，nb)，它保留了重鏈抗體完整的抗原結(jié)合能力。

6、與傳統(tǒng)抗體相比，納米抗體具有以下幾方面的優(yōu)勢(shì)：(1)抗原親和力高、能識(shí)別隱藏表位。納米抗體由4個(gè)保守序列和3個(gè)互補(bǔ)決定區(qū)組成(complementarity-determiningregion，cdr)，納米抗體的cdr3含有16～18個(gè)氨基酸殘基，比人和鼠的vh(分別有12和9個(gè)氨基酸殘基)更長(zhǎng)，并且可以形成凸環(huán)結(jié)構(gòu)，使得納米抗體更容易與抗原結(jié)合，且由于體積小，能夠結(jié)合到一些比較難結(jié)合的表位。(2)分子量小，具有較強(qiáng)的組織穿透力。納米抗體的分子量只有15kda，是普通抗體的十分之一，因此適用于多種給藥途徑，適應(yīng)人群更廣泛。并且，納米抗體具有良好的組織穿透能力，可以快速、均勻地?cái)U(kuò)散至全身，因此為實(shí)體瘤以及需要通過血腦屏障給藥的疾病，提供了新的治療方法。(3)免疫原性低。納米抗體基因序列與人vh基因家族3序列(vh3)具有高度同源性，又缺乏容易刺激免疫反應(yīng)的fc段，所以在人體內(nèi)的免疫原性相對(duì)較低。(4)具有高水溶性、高耐性、易復(fù)性及高表達(dá)性。納米抗體vhh由于其fr2中的疏水殘基被親水殘基所取代，使得納米抗體的水溶性比普通單抗要高，且聚合性減少，因此在做多價(jià)抗體上更有優(yōu)勢(shì)。納米抗體具有獨(dú)特的理化性質(zhì)，可以在極端條件下，如高壓或酸性下依然維持活性，并有可逆的去折疊能力。另外，納米抗體結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，由單一基因編碼，可以在細(xì)菌或者酵母菌中大量生產(chǎn)，生產(chǎn)成本低廉。因此在生產(chǎn)、運(yùn)輸、保存等方面更具備產(chǎn)業(yè)化的優(yōu)勢(shì)。

7、納米抗體的應(yīng)用非常廣泛，在自免、腫瘤、血液疾病、病毒感染、骨科疾病、神經(jīng)退行性疾病、炎癥性疾病等領(lǐng)域均有研發(fā)布局。賽諾菲、默克、傳奇生物、勃林格殷格翰、諾華等藥企紛紛布局納米抗體研發(fā)領(lǐng)域，并且借助納米抗體的優(yōu)勢(shì)開發(fā)皮下注射、吸入式給藥的抗體藥物。哮喘、特應(yīng)性皮炎、慢性鼻竇炎、鼻息肉、蕁麻疹、慢性阻塞性肺病、嗜酸細(xì)胞食管炎等自免疾病均需要長(zhǎng)期用藥。借助納米抗體分子小、穩(wěn)定性高的特點(diǎn)，可以將納米抗體開發(fā)成吸入型給藥方式，患者順應(yīng)性更好。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、目前已經(jīng)上市的抗體tezepelumab結(jié)合在tslp的c末端，可能影響tslp的抗菌肽活性從而導(dǎo)致副作用。另外，研究表明同時(shí)阻斷tslp與tslpr和il-7ralpha的tslp-trap分子在抑制tslp誘導(dǎo)的stat5方面比tezepelumab強(qiáng)20-30倍(nature?communications,2017,8.)。因此，開發(fā)不同表位、生物學(xué)活性更強(qiáng)的tslp抗體有望增強(qiáng)藥效，獲得更好的臨床治療效果。

2、發(fā)明人以人tslp免疫羊駝，抽取免疫后羊駝外周血分離人外周血單核細(xì)胞(pbmc)，從pbmc?cdna擴(kuò)增羊駝抗體重鏈可變區(qū)片段，利用常規(guī)分子生物學(xué)技術(shù)插入噬菌體展示載體，構(gòu)建噬菌體展示文庫(kù)，采以基于鏈霉親和素加生物素標(biāo)記靶標(biāo)抗原的液相淘選和基于elisa方法的固相淘選或組合淘選。淘選后，隨機(jī)挑取單克隆，培養(yǎng)篩選陽(yáng)性克隆。測(cè)序陽(yáng)性克隆，比對(duì)序列，選取候選抗體進(jìn)行表達(dá)純化。之后對(duì)候選抗體進(jìn)行檢測(cè)。

3、一方面，本發(fā)明提供了一種tslp結(jié)合分子，其特征在于，包括至少一個(gè)tslp結(jié)合結(jié)構(gòu)域，所述tslp結(jié)合結(jié)構(gòu)域包括cdr1、cdr2和cdr3，其中，

4、(i)cdr1，其包含與seq?id?no：3具有至少80％、至少85％、至少95％、或100％序列同一性的序列或seq?id?no：3組成；

5、(ii)cdr2，其包含與seq?id?no：4、7之一具有至少80％、至少85％、至少95％、或100％序列同一性的序列或由seq?id?no：4、7之一組成；和

6、(iii)cdr3，其包含與seq?id?no：5具有至少80％、至少85％、至少95％、或100％序列同一性的序列或由seq?id?no：5組成。

7、在上述結(jié)合分子中，所述tslp結(jié)合結(jié)構(gòu)域包含與seq?id?no：6、8之一具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的序列，或由seq?id?no：6、8之一組成。

8、在一些實(shí)施方案中，所述tslp結(jié)合分子，其中所述tslp結(jié)合結(jié)構(gòu)域能夠特異性結(jié)合人或猴tslp。

9、在一些實(shí)施方案中，所述tslp結(jié)合分子，其中所述tslp結(jié)合結(jié)構(gòu)域是納米抗體或其功能衍生物，優(yōu)選的，該納米抗體或其功能衍生物以tslp為餌蛋白篩選納米抗體庫(kù)而獲得。

10、在一些實(shí)施方案中，所述tslp結(jié)合分子，其包括兩個(gè)或多個(gè)tslp結(jié)合結(jié)構(gòu)域，所述兩個(gè)或多個(gè)tslp結(jié)合結(jié)構(gòu)域具有相同或不同的氨基酸序列。

11、在一些實(shí)施方案中，所述tslp結(jié)合分子，其還包括至少一種具有生物活性的功能域或功能片段，所述具有生物活性的功能域或功能片段包括載體蛋白、活性肽、標(biāo)簽肽、伴侶蛋白等組件，其與tslp結(jié)合結(jié)構(gòu)域通過共價(jià)鍵、非共價(jià)鍵或連接子連接；

12、其中優(yōu)選的，所述載體蛋白包括bsa、ova、hsa、klh、fc等；所述活性肽包括線性肽或環(huán)形肽，具有酶活性、細(xì)胞毒活性、抗原結(jié)合活性等；所述標(biāo)簽肽包括純化標(biāo)簽肽、示蹤標(biāo)簽肽等；所述伴侶蛋白包括hsp60、hsp70、hsp90等。

13、在一些實(shí)施方案中，所述tslp結(jié)合分子，所述具有生物活性的功能域或功能片段包括多肽類、合成小分子、天然活性分子，并且所述tslp結(jié)合分子以單體、同源多聚體、異源多聚體的形式存在。

14、在一些實(shí)施方案中，所述tslp結(jié)合分子，其為納米抗體、重鏈抗體、vhh-fc融合蛋白、單價(jià)抗體、雙價(jià)抗體、多價(jià)抗體、單特異性抗體、雙特異性抗體、多特異性抗體、嵌合抗體、免疫偶聯(lián)物。

15、在一些實(shí)施方案中，所述tslp結(jié)合分子，其具有一個(gè)或多個(gè)性質(zhì)，

16、抑制tslp對(duì)h_tslp?reporter?cell?line細(xì)胞stats?and?jak2信號(hào)通路的激活作用的活性是參比抗體(例如tezepelumab)最低1.1倍，例如1.2，1.3，1.4，1.5，1.6，1.7，1.8，1.9，2，2.1，2.2，2.3，2.4，2.5，2.6，2.7，2.8，2.9，3倍；和/或，

17、抑制tslp對(duì)baf3-tslpr/il7rα細(xì)胞的增殖促進(jìn)作用的活性是參比抗體(例如tezepelumab)的最低1.1倍，例如1.2，1.3，1.4，1.5，1.6，1.7，1.8，1.9，2，2.1，2.2，2.3，2.4，2.5，2.6，2.7，2.8，2.9，3倍。

18、一方面，本公開提供了一種制備如前述tslp結(jié)合分子的方法，包括：

19、(1)利用tslp蛋白免疫能夠產(chǎn)生重鏈抗體的動(dòng)物；

20、(2)分離pbmc擴(kuò)增重鏈可變區(qū)編碼核酸，構(gòu)建噬菌體重鏈抗體庫(kù)；

21、(3)可選的，利用鏈霉親和素加生物素標(biāo)記靶標(biāo)抗原的液相淘選和基于elisa方法的固相淘選或組合淘選，去除未結(jié)合的噬菌體；

22、(4)洗脫噬菌體亞庫(kù)并感染宿主，洗脫亞庫(kù)進(jìn)行培養(yǎng)并加輔助噬菌體感染；

23、(5)可選的，重復(fù)步驟(3)-(4)二至四次；

24、(6)培養(yǎng)后加入輔助噬菌體感染，包裝單克隆重組噬菌體，進(jìn)行噬菌體鑒定；

25、(7)對(duì)噬菌體鑒定陽(yáng)性的噬菌體克隆進(jìn)行測(cè)序獲得tslp結(jié)合結(jié)構(gòu)域的編碼核酸。

26、進(jìn)一步的，所述方法進(jìn)一步包括：

27、(1)對(duì)tslp結(jié)合結(jié)構(gòu)域進(jìn)行人源化改造；

28、(2)對(duì)人源化改造的tslp結(jié)合結(jié)構(gòu)域進(jìn)行序列優(yōu)化。

29、一方面，本公開提供了一種組合物，其包含前述的tslp結(jié)合分子；以及可選的藥學(xué)上可接受的輔料。

30、一方面，本公開提供了一種多核苷酸，其編碼前述的tslp結(jié)合分子。

31、一方面，本公開提供了一種核酸構(gòu)建體，其包含前述的多核苷酸。

32、一方面，本公開提供了宿主細(xì)胞，其包含前述的多核苷酸或前述的核酸構(gòu)建體。

33、進(jìn)一步，本公開提供了一種制備tslp結(jié)合分子的方法，其包括：

34、(1)在適合表達(dá)重組外源蛋白的條件下培養(yǎng)權(quán)利要求15所述的宿主細(xì)胞，

35、(2)可選的，從細(xì)胞培養(yǎng)物中分離純化tslp結(jié)合分子。

36、一方面，本公開提供了上述的tslp結(jié)合分子中的tslp結(jié)合結(jié)構(gòu)域。

37、一方面，本公開提供了上述的tslp結(jié)合分子或上述tslp結(jié)合結(jié)構(gòu)域在制備藥物和/或延長(zhǎng)藥物半衰期中的應(yīng)用。

38、一方面，本公開提供了上述的tslp結(jié)合分子或上述tslp結(jié)合結(jié)構(gòu)域的應(yīng)用，其特征在于，將具有預(yù)防或治療作用的活性分子通過共價(jià)鍵、非公價(jià)鍵、或接頭分子與所述tslp結(jié)合分子或所述tslp結(jié)合結(jié)構(gòu)域結(jié)合。

39、一方面，上述的tslp結(jié)合分子或上述tslp結(jié)合結(jié)構(gòu)域，其在tslp表達(dá)相關(guān)疾病中的應(yīng)用，tslp表達(dá)相關(guān)疾病是自身免疫性疾病，所述自身免疫性疾病選自下組：系統(tǒng)性紅斑狼瘡、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、銀屑病關(guān)節(jié)炎、中軸型脊椎關(guān)節(jié)炎、重癥肌無(wú)力、多發(fā)性肌炎、銀屑病、天皰瘡、白癲風(fēng)、多發(fā)性硬化癥、嗜睡癥、視神經(jīng)脊髓炎、一型糖尿病、甲亢、甲減、克羅恩氏病、潰瘍性結(jié)腸炎、乳糜瀉、自身免疫性胃炎、原發(fā)性膽道膽管炎、自身免疫性肝炎和狼瘡性腎炎。

40、本公開取得了以下有益的技術(shù)效果：

41、本公開的抗體與tezepelumab結(jié)合不同表位，不阻斷c末端具有抗菌活性的抗菌肽，有望保留tslp對(duì)抗外界細(xì)菌感染的能力。

42、本公開的抗體可以有效抑制tslp對(duì)h_tslp?reporter?cell?line細(xì)胞stats?andjak2信號(hào)通路的激活作用，并且抑制活性優(yōu)于參比抗體例如tezepelumab。

43、本公開的抗體可以有效抑制tslp對(duì)baf3-tslpr/il7rα細(xì)胞的增殖促進(jìn)作用，并且抑制活性優(yōu)于參比抗體例如tezepelumab(例如至少1.5倍)。