本發(fā)明屬于不結(jié)球白菜分子輔助育種，具體涉及一種輔助選擇不結(jié)球白菜綠葉顏色及與葉綠素、類胡蘿卜素含量相關(guān)的brac09g052220基因的indel分子標(biāo)記及其引物和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、不結(jié)球白菜，十字花科蔬菜，具有豐富的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，是我國(guó)常見的葉用蔬菜之一。不結(jié)球白菜具有豐富的葉色資源，綠色是常見的葉色，其可分為黃綠色、淺綠色、常規(guī)綠色、深綠色等。葉片的綠色主要受色素含量的調(diào)控，如葉綠素、類胡蘿卜素。與此同時(shí)，葉綠素和類胡蘿卜素是常見的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，具有提高人體免疫力、抗氧化和保護(hù)心血管等作用。隨著人們生活水平的不斷提高，對(duì)于蔬菜的色澤、營(yíng)養(yǎng)等要求也越來越高，選育具有高觀賞價(jià)值和高營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)的蔬菜品種是當(dāng)下市場(chǎng)的需求。近年來，隨著分子生物學(xué)和基因工程技術(shù)的飛速發(fā)展，越來越多的研究者通過分子輔助育種的手段來高效選育高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、高抗的蔬菜品種，但在不結(jié)球白菜綠葉性狀品種選育上可用的分子標(biāo)記卻還很欠缺。

2、brac09g052220，即bcsg1，是參與葉綠體發(fā)育的重要基因，其具有調(diào)控葉綠體中類囊體薄膜發(fā)育和調(diào)控葉綠體發(fā)育相關(guān)基因表達(dá)的功能，葉綠體是葉綠素和類胡蘿卜素生物合成的主要場(chǎng)所，其數(shù)量和發(fā)育狀態(tài)與色素含量息息相關(guān)。在擬南芥的sg1突變體中，新長(zhǎng)出來的葉片的顏色為白色，隨著植株的不斷生長(zhǎng)，葉片逐漸由白色轉(zhuǎn)為白綠色，三周后葉片為綠色。因此，sg1基因與在早期發(fā)育階段的葉片綠色具有一定的相關(guān)性。

3、為高效的鑒定不結(jié)球白菜的綠葉顏色和葉綠素、類胡蘿卜素含量，快速選育滿足市場(chǎng)需要的綠葉品種，開發(fā)一種與綠葉顏色及葉綠素、類胡蘿卜素含量緊密相關(guān)的分子標(biāo)記迫在眉睫。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的在于提供一種不結(jié)球白菜brac09g052220基因的indel分子標(biāo)記及其應(yīng)用；通過具有深綠色葉片的烏塌菜和黃綠色葉片的二青作為親本構(gòu)建重組自交系群體，通過親本和重組自交系群體進(jìn)行重測(cè)序，進(jìn)一步挖掘變異位點(diǎn)，通過分析發(fā)現(xiàn)，在brac09g052220的外顯子區(qū)域發(fā)現(xiàn)了變異位點(diǎn)，針對(duì)該變異開發(fā)indel分子標(biāo)記并設(shè)置相應(yīng)的引物，利用36份不結(jié)球白菜品種進(jìn)行鑒定，其中以brac09g052220基因?yàn)椴唤Y(jié)球白菜綠葉主效基因的24種種質(zhì)材料以及該24種不結(jié)球白菜核心種質(zhì)培育得到不結(jié)球白菜品種可以通過該標(biāo)記鑒定葉綠素和類胡蘿卜素的含量，因此本發(fā)明獲得的分子標(biāo)記可作為該24種不結(jié)球白菜核心種質(zhì)材料的分子標(biāo)記輔助育種，可以對(duì)該24種核心種質(zhì)材料基礎(chǔ)上選育出的品種進(jìn)行綠葉顏色和葉綠素、類胡蘿卜素含量的快速鑒定，減少田間篩選工作，對(duì)于高效種質(zhì)篩選與育種工作具有十分積極的意義。

2、本發(fā)明技術(shù)方案如下：

3、本發(fā)明的第一個(gè)目的是提供與不結(jié)球白菜綠葉相關(guān)色素含量性狀緊密連鎖的indel分子標(biāo)記在不結(jié)球白菜綠葉相關(guān)色素含量性狀輔助育種中的應(yīng)用，所述indel分子標(biāo)記核苷酸序列如seq?id?no.3或者seq?id?no.4所示；所述應(yīng)用為：

4、(1)若indel分子標(biāo)記核苷酸序列為如seq?id?no.3所示的片段，判定待測(cè)不結(jié)球白菜為則為高色素含量品種；

5、(2)若indel分子標(biāo)記核苷酸序列為如seq?id?no.4所示的片段，判定待測(cè)不結(jié)球白菜為則為低色素含量品種。

6、seq?id?no.3:

7、gctatattttttaaagcccacaagtctaaaatgaatcattacagacaggatccatgatcttcattctccttcttcctcagatctctctttactgaacaaagggtttgaaggttcatcactcaccacagtcatgtactctctgggaagattacagcttaatcaccttcccttcactcacacctcttcatcctt

8、seq?id?no.4:

9、gctatattttttaaagcccacaagtctaaaatgaatcattacagacaggatctctctttactgaacaaagggtttgaaggttcatcactcaccacaatcacaatcatgtactccctgggaagattacagcttcatcaccagccagcccaccttcccttcactcacacctcttcatcctt

10、進(jìn)一步的，所述應(yīng)用還包括(3)若同時(shí)包括seq?id?no.3、seq?id?no.4所示的indel分子標(biāo)記，判定待測(cè)不結(jié)球白菜則為中間型色素含量品種。

11、本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供用于擴(kuò)增前述的indel分子標(biāo)記的引物對(duì)在不結(jié)球白菜綠葉相關(guān)色素含量性狀輔助育種中的應(yīng)用。

12、進(jìn)一步的，所述引物對(duì)如seq?id?no.1和seq?id?no.2所示：

13、seq?id?no.1:gctatattttttaaagcccac；

14、seq?id?no.2:aaggatgaagaggtgtgagtg。

15、本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供用于檢測(cè)前述indel分子標(biāo)記的試劑盒在不結(jié)球白菜綠葉相關(guān)色素含量性狀輔助育種中的應(yīng)用；

16、優(yōu)選的，所述試劑盒包括seq?id?no.1、seq?id?no.2所示引物對(duì)。

17、本發(fā)明的第四個(gè)目的是提供一種不結(jié)球白菜綠葉相關(guān)色素含量性狀輔助育種的方法，所述方法包括以下步驟：

18、(1)提取待測(cè)不結(jié)球白菜的基因組總dna；

19、(2)采用seq?id?no.1和seq?id?no.2所示的indel分子標(biāo)記引物對(duì)待測(cè)的不結(jié)球白菜的基因組總dna進(jìn)行pcr擴(kuò)增；

20、(3)對(duì)pcr擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳和/或測(cè)序，根據(jù)擴(kuò)增片段的長(zhǎng)度差異和/或pcr產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果，判斷不結(jié)球白菜的綠葉相關(guān)色素含量性狀。

21、進(jìn)一步的，如果擴(kuò)增產(chǎn)物只含有192bp條帶和/或只包含序列如seq?id?no.3所示的片段，則待測(cè)不結(jié)球白菜為高色素含量品種；如果只含有179bp條帶和/或只包含序列如seq?id?no.4所示的片段，則待測(cè)不結(jié)球白菜為低色素含量品種；如同時(shí)包含192bp和179bp的條帶和或同時(shí)包括seq?id?no.3、seq?id?no.3所示的indel分子標(biāo)記，則待測(cè)不結(jié)球白菜則為雜合個(gè)體，為中間型色素含量品種。

22、進(jìn)一步的，步驟(2)所述pcr擴(kuò)增的反應(yīng)體系為：pcr擴(kuò)增的總體系為10μl，包括正反引物各0.5μl,taq酶5μl，dna1μl(50ng)，ddh2o?3μl；步驟(2)所述pcr擴(kuò)增的反應(yīng)程序?yàn)?5℃預(yù)變性3min；95℃變性15s，53℃退火15s，72℃延伸20s，30個(gè)循環(huán)；72℃延伸5min，10℃保存。

23、進(jìn)一步的，步驟(3)所述電泳的具體操作為：將5μl上樣于2％的瓊脂糖凝膠，120v恒定電壓電泳40min，關(guān)閉電源，取下凝膠，紫外顯色。

24、進(jìn)一步的，本發(fā)明所述綠葉相關(guān)色素為總?cè)~綠素、葉綠素a、葉綠素b和類胡蘿卜素。

25、進(jìn)一步的，所述不結(jié)球白菜選自基于以下24種不結(jié)球白菜核心種質(zhì)中的至少一種，或者以所述24種不結(jié)球白菜核心種質(zhì)作為親本培育得到不結(jié)球白菜品種中的至少一種：

26、

27、

28、有益效果：

29、本發(fā)明所開發(fā)的分子標(biāo)記，具有檢測(cè)不結(jié)球白菜綠葉顏色及葉綠素、類胡蘿卜素含量高低的能力。利用這一標(biāo)記，我們能夠在種子階段對(duì)大量不結(jié)球白菜品種進(jìn)行葉綠素、類胡蘿卜素含量的準(zhǔn)確鑒定和葉色的可靠預(yù)測(cè)。相較于傳統(tǒng)的育種方法，這一技術(shù)大大縮短了育種所需的時(shí)間，并且提高了鑒定的準(zhǔn)確性。