本發(fā)明屬于生物化學(xué)，具體涉及一種調(diào)控微球表面接枝聚合物密度的方法。

背景技術(shù)：

1、通過(guò)對(duì)二氧化硅微球表面進(jìn)行聚合物修飾，能夠顯著改善二氧化硅微球表面的物理化學(xué)性質(zhì)，使其在藥物釋放、藥物合成純化和醫(yī)療器械制造等生物醫(yī)學(xué)相關(guān)領(lǐng)域具有廣泛應(yīng)用。對(duì)二氧化硅微球表面的修飾策略主要有兩種：一是聚合物鏈后接枝的策略(grafting?to)，即已合成的聚合物鏈通過(guò)化學(xué)反應(yīng)(例如點(diǎn)擊反應(yīng))或者其他特殊相互作用，與二氧化硅微球的表面進(jìn)行鏈接；二是在二氧化硅微球表面進(jìn)行聚合的策略(graftingfrom)，即對(duì)二氧化硅微球表面進(jìn)行特殊處理后，使表面具有可引發(fā)聚合的活性位點(diǎn)，然后原位引發(fā)聚合反應(yīng)制備鏈接在表面的聚合物鏈。而在實(shí)際研發(fā)和放大生產(chǎn)過(guò)程中，自由基聚合因?yàn)槠淞己玫姆磻?yīng)耐受性，能夠聚合更多種類(lèi)的單體和單體轉(zhuǎn)化率高的優(yōu)勢(shì)，被用作grafting?from修飾策略的常用技術(shù)手段。

2、而在醫(yī)藥純化和蛋白質(zhì)合成領(lǐng)域，用于蛋白質(zhì)分子純化的二氧化硅微球，其性能優(yōu)劣完全取決于其表面接枝的聚合物鏈的性能。針對(duì)這些二氧化硅微球表面聚合物鏈的調(diào)控主要集中在聚合物鏈長(zhǎng)(即分子量的大小)和聚合物鏈的接枝密度。針對(duì)聚合物鏈長(zhǎng)的調(diào)控，主要通過(guò)改變聚合物單體與引發(fā)劑的比例(有時(shí)還會(huì)包括與鏈轉(zhuǎn)移劑的比例)來(lái)實(shí)現(xiàn)。而針對(duì)二氧化硅微球表面聚合物鏈密度調(diào)控的相關(guān)研究，目前仍然局限于小規(guī)模的實(shí)驗(yàn)室研究，極大地制約了這類(lèi)二氧化硅微球在生物醫(yī)藥純化領(lǐng)域的應(yīng)用。因此，開(kāi)發(fā)一種易于操作和放大生產(chǎn)，針對(duì)二氧化硅微球表面的聚合物鏈接枝密度的調(diào)控方法，對(duì)于工業(yè)化放大生產(chǎn)過(guò)程中生物醫(yī)藥純化的開(kāi)發(fā)具有重要意義。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明中，發(fā)明人使用氟化劑作為控制聚合反應(yīng)引發(fā)位點(diǎn)密度，或控制接枝于微球表面的聚合物鏈密度的試劑。利用氟化劑提供了氟離子(f—)切除硅烷偶聯(lián)劑與微球的鏈接，導(dǎo)致引發(fā)位點(diǎn)減少或接枝的聚合物鏈直接減少，進(jìn)而通過(guò)氟化劑調(diào)節(jié)接枝聚合物鏈的密度：反應(yīng)過(guò)程中f—傾向于進(jìn)攻si-o鍵中的si原子。相比于文獻(xiàn)報(bào)道中的氫氟酸(hf)，本發(fā)明的氟化劑具有使用方便和毒性較低的優(yōu)勢(shì)，因此具備在工業(yè)生產(chǎn)放大的潛質(zhì)。

2、本發(fā)明第一方面提供一種調(diào)控微球表面聚合物密度的方法，其特征在于，主要包括如下步驟：將微球本體經(jīng)硅烷偶聯(lián)劑處理，再依次與氟化劑反應(yīng)、最后在引發(fā)劑存在下與單體反應(yīng)之后得到改性微球。

3、進(jìn)一步優(yōu)選地，所述氟化劑選自烷基氟化物、芳基氟化物、芳基烷基氟化物、氟化鹽或氟氰酸鹽中的一種或多種。

4、進(jìn)一步優(yōu)選地，所述烷基氟化物的烷基數(shù)量為1～30，優(yōu)選4～20，進(jìn)一步優(yōu)選4～16。

5、進(jìn)一步優(yōu)選地，所述烷基氟化物為烷基氟化鹽，舉例如烷基氟化銨、烷基氟化鈉、烷基氟化鉀、烷基氟化銫等。

6、進(jìn)一步優(yōu)選地，所述烷基氟化物選自四甲基氟化銨(tmaf)、四乙基氟化銨(teaf)、四丙基氟化銨(tpaf)、四丁基氟化銨(tbaf)、四丁基氟化鈉。

7、進(jìn)一步優(yōu)選地，所述芳基烷基氟化物的烷基數(shù)量為1～30，優(yōu)選3～20，進(jìn)一步優(yōu)選3～15。

8、進(jìn)一步優(yōu)選地，所述芳基烷基氟化物為芳基烷基氟化鹽，舉例如芳基烷基氟化銨、芳基烷基氟化鈉、芳基烷基氟化鉀、芳基烷基氟化銫等。

9、進(jìn)一步優(yōu)選地，所述芳基為苯基。

10、進(jìn)一步優(yōu)選地，所述芳基烷基氟化物為苯基三甲基氟化銨、苯基三乙基氟化銨、苯基三丙基氟化銨或苯基三丁基氟化銨。

11、進(jìn)一步優(yōu)選地，所述氟化鹽選自氟化銨、氟化鈉、氟化鉀或氟化銫。

12、進(jìn)一步優(yōu)選地，所述氟氰酸鹽選自氟氰酸鈉或氟氰酸鉀。

13、進(jìn)一步優(yōu)選地，所述微球本體經(jīng)硅烷偶聯(lián)劑處理之前，使用超聲清洗，并用堿性溶液處理。

14、進(jìn)一步優(yōu)選地，所述堿性溶液選自氫氧化物溶液、碳酸鹽溶液、碳酸氫鹽溶液等中的一種或多種。

15、進(jìn)一步優(yōu)選地，所述堿性溶液選自氫氧化鈉溶液或氫氧化鉀溶液或其組合。

16、進(jìn)一步優(yōu)選地，所述硅烷偶聯(lián)劑的結(jié)構(gòu)中含有不飽和鍵。

17、進(jìn)一步優(yōu)選地，所述硅烷偶聯(lián)劑選自γ―甲基丙烯酰氧基丙基三甲氧基硅烷、乙烯基三乙氧基硅烷、乙烯基三甲氧基硅烷、乙烯基三(β-甲氧乙氧基)硅烷、二甲基乙烯基乙氧基硅烷、甲基乙烯基二乙氧基硅烷或乙烯基三甲氧基硅烷低聚物中的一種或多種。

18、進(jìn)一步優(yōu)選地，所述單體為丙烯酸類(lèi)單體。

19、進(jìn)一步優(yōu)選地，所述單體選自取代或未取代的丙烯酸、丙烯酸鹽、丙烯酸酸酯中的一種或多種。

20、進(jìn)一步優(yōu)選地，所述取代基選自烷基、環(huán)烷基、芳基、烷氧基、環(huán)烷氧基、芳氧基等。

21、進(jìn)一步優(yōu)選地，所述單體選自烷基丙烯酸、烷基丙烯酸鹽或烷基丙烯酸酯中的一種或多種。

22、進(jìn)一步優(yōu)選地，所述丙烯酸類(lèi)單體選自丙烯酸、甲基丙烯酸、甲基丙烯酸鹽、甲基丙烯酸酯、甲基丙烯酸甲酯、丙烯酸丁酯、丙烯酸異辛酯之一或者其組合。

23、進(jìn)一步優(yōu)選地，所述微球本體表面含有硅或氧化硅或羥基；優(yōu)選地，所述的微球本體的材料選自玻璃、陶瓷或磁性材料，當(dāng)所述微球本體為磁性微球時(shí)，其表面包裹有二氧化硅或羥基。

24、進(jìn)一步優(yōu)選地，所述微球本體為二氧化硅微球。

25、進(jìn)一步優(yōu)選地，所述微球本體的尺寸選自下述任一種粒徑尺度或任兩種粒徑尺度之間的范圍：0.1μm、0.15μm、0.2μm、0.25μm、0.3μm、0.35μm、0.4μm、0.45μm、0.5μm、0.55μm、0.6μm、0.65μm、0.7μm、0.75μm、0.8μm、0.85μm、0.9μm、0.95μm、1μm、1.5μm、2μm、2.5μm、3μm、3.5μm、4μm、4.5μm、5μm、5.5μm、6μm、6.5μm、7μm、7.5μm、8μm、8.5μm、9μm、9.5μm、10μm、15μm、20μm、25μm、30μm、35μm、40μm、45μm、50μm、55μm、60μm、65μm、70μm、75μm、80μm、85μm、90μm、95μm、100μm、150μm、200μm、250μm、300μm、350μm、400μm、450μm、500μm、550μm、600μm、650μm、700μm、750μm、800μm、850μm、900μm、950μm、1000μm；所述直徑尺寸為平均值；

26、優(yōu)選方式之一，所述微球本體的直徑選自0.1～10μm；

27、優(yōu)選方式之一，所述微球本體的直徑選自0.2～6μm；

28、優(yōu)選方式之一，所述微球本體的直徑選自0.4～5μm；

29、優(yōu)選方式之一，所述微球本體的直徑選自0.5～3μm；

30、優(yōu)選方式之一，所述微球本體的直徑選自0.2～1μm；

31、優(yōu)選方式之一，所述微球本體的直徑選自0.5～1μm；

32、優(yōu)選方式之一，所述微球本體的直徑選自1μm～1mm；

33、優(yōu)選方式之一，所述微球本體的平均直徑為200nm、250nm、300nm、350nm、400nm、450nm、500nm、550nm、600nm、650nm、700nm、750nm、800nm、850nm、900nm、950nm、1000nm，偏差為±20％，更優(yōu)選±10％。

34、進(jìn)一步優(yōu)選地，所述方法進(jìn)一步包括如下步驟：

35、(1)將微球采用超聲洗滌，得到微球a；

36、(2)將微球a與堿性溶液反應(yīng)，并洗滌得到微球b；

37、(3)將微球b與硅烷偶聯(lián)劑反應(yīng)，得到微球c；

38、(4)將微球c與氟化劑反應(yīng)，得到微球d；

39、(5)將微球d與單體在引發(fā)劑條件下反應(yīng)，得到微球e；

40、(6)將微球e經(jīng)堿性溶液處理，得到微球f，即目標(biāo)改性微球。

41、進(jìn)一步優(yōu)選地，所述硅烷偶聯(lián)劑與氟化劑的投料比(l：mol)為1:0.1～20；進(jìn)一步優(yōu)選1:0.1～15；更優(yōu)選1:1、1:1.5、1:2、1:15或10:1中的任意值或者任意兩個(gè)值之間的區(qū)間范圍。

42、進(jìn)一步優(yōu)選地，所述單體與引發(fā)劑的投料比(l：g)為(10～70):(10～50)；更優(yōu)選0.5～5：1；進(jìn)一步優(yōu)選0.5～2:1，更進(jìn)一步優(yōu)選0.5：1、0.6：1、1:1、1.5:1或2:1中的任意值或者任意兩個(gè)值之間的區(qū)間范圍。

43、進(jìn)一步優(yōu)選地，所述步驟(1)進(jìn)一步包括，將微球先放入去離子水中攪拌10～60分鐘，然后超聲清洗10～60分鐘。

44、進(jìn)一步優(yōu)選地，將步驟(1)重復(fù)2～3次。

45、進(jìn)一步優(yōu)選地，所述步驟(2)進(jìn)一步包括，將微球a體系中分批次加入氫氧化鈉5～50g，在反應(yīng)溫度為15～80℃的條件下攪拌0.1～8h。

46、進(jìn)一步優(yōu)選地，所述步驟(2)進(jìn)一步包括，將反應(yīng)后的微球用水或醇類(lèi)溶劑洗滌，至溶液的ph為6～9.5，得到微球b。

47、進(jìn)一步優(yōu)選地，所述步驟(3)中反應(yīng)溫度為0～150℃，更優(yōu)選10～100℃，更進(jìn)一步優(yōu)選50～100℃；所述反應(yīng)時(shí)間為1～48h，優(yōu)選5～24h。

48、進(jìn)一步優(yōu)選地，所述步驟(4)進(jìn)一步包括，將微球c與氟化劑溶液反應(yīng)，所述溶液優(yōu)選為thf，反應(yīng)溫度優(yōu)選為0～150℃，更優(yōu)選10～100℃，更進(jìn)一步優(yōu)選50～70℃；所述反應(yīng)時(shí)間為1～48h，優(yōu)選12～36h，更優(yōu)選24～26h。

49、進(jìn)一步優(yōu)選地，所述步驟(4)進(jìn)一步包括，反應(yīng)完畢之后，將微球d進(jìn)行洗滌，所述洗滌采用選自水或醇類(lèi)溶劑，進(jìn)一步優(yōu)選為去離子水或無(wú)水乙醇。

50、進(jìn)一步優(yōu)選地，所述步驟(4)進(jìn)一步包括，將微球d洗滌完畢后進(jìn)行密閉保存。

51、進(jìn)一步優(yōu)選地，所述步驟(5)進(jìn)一步包括：將微球d與單體和引發(fā)劑混合之后，將反應(yīng)體系密封，鼓泡，然后加熱反應(yīng)。

52、進(jìn)一步優(yōu)選地，所述步驟(5)的鼓泡時(shí)間為0.5～5h，更優(yōu)選1～2h。

53、進(jìn)一步優(yōu)選地，所述步驟(5)的加熱溫度為50～150℃，更優(yōu)選60～100℃。

54、進(jìn)一步優(yōu)選地，所述引發(fā)劑選自偶氮類(lèi)引發(fā)劑、過(guò)氧化物引發(fā)劑或氧化還原引發(fā)劑。

55、進(jìn)一步優(yōu)選地，所述引發(fā)劑選自4,4'-偶氮雙(4-氰基戊酸)、偶氮二異丁腈、偶氮二異庚腈、偶氮二異丁酸二甲酯、偶氮二異丁脒鹽酸鹽、偶氮二異丁咪唑啉鹽酸鹽、偶氮異丁氰基甲酰胺中的一種或多種。

56、進(jìn)一步優(yōu)選地，所述單體與引發(fā)劑的投料比(ml：mg)為1:01～10；進(jìn)一步優(yōu)選1:0.5～5，更優(yōu)選1:1～2。

57、進(jìn)一步優(yōu)選地，所述步驟(6)的堿性溶液選自氫氧化物溶液、碳酸鹽溶液、碳酸氫鹽溶液等中的一種或多種。

58、進(jìn)一步優(yōu)選地，進(jìn)一步優(yōu)選地，所述步驟(6)進(jìn)一步包括，微球e經(jīng)堿性溶液處理后，靜置后洗滌，密閉保存。

59、進(jìn)一步優(yōu)選地，所述靜置為在水或或醇類(lèi)溶劑，進(jìn)一步優(yōu)選為去離子水或無(wú)水乙醇。

60、進(jìn)一步優(yōu)選地，所述洗滌采用選自水或醇類(lèi)溶劑，進(jìn)一步優(yōu)選為去離子水或無(wú)水乙醇。

61、進(jìn)一步優(yōu)選地，所述密閉保存的溫度為0～10℃，優(yōu)選為4℃。

62、本發(fā)明第二方面提供一種改性微球，所述改性微球由本發(fā)明第一方面所述的方法制備而成。

63、進(jìn)一步優(yōu)選地，所述改性微球上接枝聚合物鏈的密度被減小。

64、本發(fā)明第三方面提供由本發(fā)明第一方面的方法制備得到的改性微球或者本發(fā)明第二方面提供的改性微球在無(wú)細(xì)胞蛋白合成、蛋白分離純化、目標(biāo)抗體藥物富集、靶向給藥、核酸分離提取、細(xì)胞分選、酶固定以及試劑盒中的應(yīng)用。

65、本發(fā)明的主要優(yōu)點(diǎn)和積極效果包括：

66、(1)首次將氟化劑用于微球表面接枝聚合物密度的調(diào)節(jié)，具有開(kāi)創(chuàng)性的意義；

67、(2)采用氟化劑，特別是烷基氟化物對(duì)微球表面進(jìn)行處理，有利于控制微球表面的反應(yīng)位點(diǎn)，減小了微球表面接枝聚合物的密度，更有利于對(duì)目標(biāo)產(chǎn)物(如蛋白、核酸等)的抓取，增大了微球的吸附能力。

68、具體實(shí)施方式

69、下面結(jié)合具體實(shí)施方式和實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，優(yōu)先按照、參考上文所述的具體實(shí)施方式指引的條件，然后可按照常規(guī)條件，例如“sambrook等人，分子克?。簩?shí)驗(yàn)室手冊(cè)(new?york:cold?spring?harbor?laboratory?press,1989)”、《無(wú)細(xì)胞蛋白合成實(shí)驗(yàn)手冊(cè)》“edited?by?alexander?s.spirin?and?jamesr.swartz.cell-free?protein?synthesis:methods?and?protocols[m].2008”等文獻(xiàn)中所述的實(shí)驗(yàn)條件，或按照制造廠商所建議的條件。

70、除非另外說(shuō)明，否則本發(fā)明中提及的百分比和份數(shù)是重量百分比和重量份數(shù)。

71、如無(wú)特別說(shuō)明，則本發(fā)明實(shí)施例中所用的材料和試劑均為市售產(chǎn)品。

72、本技術(shù)中的溫度單位如無(wú)特殊說(shuō)明，均為攝氏度(℃)。

73、名詞和術(shù)語(yǔ)

74、以下是針對(duì)本發(fā)明所采用的部分相關(guān)“名詞”、“術(shù)語(yǔ)”的含義進(jìn)行的解釋或說(shuō)明，以便于更好地理解本發(fā)明。相應(yīng)的解釋或說(shuō)明適用于本發(fā)明的全文，既適用于下文，也適用于上文。本發(fā)明中涉及引用文獻(xiàn)時(shí)，相關(guān)術(shù)語(yǔ)、名詞、短語(yǔ)在引用文獻(xiàn)中的定義也一并被引用，但是，與本發(fā)明中的定義相沖突時(shí)，以本發(fā)明中的定義為準(zhǔn)。在引用文獻(xiàn)中的定義與本發(fā)明中的定義發(fā)生沖突時(shí)，并不影響所引用的成分、物質(zhì)、組合物、材料、體系、配方、種類(lèi)、方法、設(shè)備等以引用文獻(xiàn)中確定的內(nèi)容為準(zhǔn)。

75、聚合物，本發(fā)明中廣義地包括寡聚物和高聚物，至少具有三個(gè)結(jié)構(gòu)單元或者分子量至少為500da(所述分子量可以采用適合的表征方式，比如數(shù)均分子量、重均分子量、粘均分子量等)。

76、丙烯酸類(lèi)單體分子：可用于合成丙烯酸類(lèi)聚合物的單體分子，具有c(coo-)＝c的基本結(jié)構(gòu)，舉例如，ch(cooh)＝ch2、ch(coona)＝ch2、ch3c(cooh)＝ch2、ch3c(coona)＝ch2、ch(cooch3)＝ch2、ch(cooch2ch2oh)＝ch2、ch3c(cooch3)＝ch2、ch3c(cooch2ch2oh)＝ch2等。

77、固定、固定于、固定有、固定在等“固定”方式，指共價(jià)的結(jié)合方式。

78、帶有、連接有、連接于、連接在、結(jié)合、捕捉、捕獲到等“連接”/“結(jié)合”方式，沒(méi)有特別限定，包括但不限于共價(jià)方式、非共價(jià)方式等方式。

79、純化底物，也稱(chēng)為目標(biāo)物，待從混合體系中分離出來(lái)的物質(zhì)。本發(fā)明中的純化底物沒(méi)有特別限制，例如為蛋白類(lèi)物質(zhì)(此時(shí)也稱(chēng)為目標(biāo)蛋白)。

80、“改性”產(chǎn)物，包括但不限于本發(fā)明的衍生物、經(jīng)修飾的產(chǎn)物、基因改造產(chǎn)物、融合產(chǎn)物等，可以保持原有的功能或性能，也可以?xún)?yōu)化、改變其功能或性能。

81、洗脫液(以目標(biāo)蛋白為例)：洗脫目標(biāo)蛋白；經(jīng)洗脫后，目標(biāo)蛋白存在于洗脫液中。

82、洗滌液(以目標(biāo)蛋白為例)：洗脫雜蛋白等雜質(zhì)；經(jīng)洗脫后，雜蛋白被洗滌液帶走。

83、結(jié)合力：結(jié)合能力，如生物微球與某一蛋白的結(jié)合能力。

84、親和作用力：使用不同濃度梯度的底物溶液，當(dāng)生物微球只結(jié)合50％底物時(shí)的底物濃度。

85、ivtt：in?vitro?transcription?and?translation，體外轉(zhuǎn)錄與翻譯系統(tǒng)，即為無(wú)細(xì)胞蛋白合成體系。無(wú)細(xì)胞蛋白合成體系是以外源目的mrna或dna為蛋白質(zhì)合成模板，通過(guò)人工控制補(bǔ)加蛋白質(zhì)合成所需的底物和轉(zhuǎn)錄、翻譯相關(guān)蛋白因子等物質(zhì)，能實(shí)現(xiàn)目的蛋白質(zhì)的合成。本發(fā)明的無(wú)細(xì)胞蛋白合成體系無(wú)特別限制，可以是基于酵母細(xì)胞提取物、大腸桿菌細(xì)胞提取物、哺乳動(dòng)物細(xì)胞提取物、植物細(xì)胞提取物、昆蟲(chóng)細(xì)胞提取物的無(wú)細(xì)胞蛋白合成體系的任一種或任意組合。

86、本發(fā)明中，“翻譯相關(guān)酶”，translation-related?enzymes(trens)，指從核酸模板到蛋白質(zhì)產(chǎn)物合成過(guò)程中所需的酶物質(zhì)，不局限于翻譯過(guò)程需要的酶。

87、核酸模板：也稱(chēng)為遺傳模板，指作為蛋白合成模板的核酸序列，包括dna模板、mrna模板及其組合。

88、流穿液：生物微球與含目標(biāo)蛋白的體系進(jìn)行孵育后所收集的清液，其中含有未被生物微球捕獲的殘余的目標(biāo)蛋白。

89、rfu，相對(duì)熒光單位值(relative?fluorescence?unit)。

90、egfp：增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(enhanced?green?fluorescence?protein)。本發(fā)明中，所述egfp廣義地包括野生型及其變體，包括但不限于野生型及其突變體。

91、megfp：egfp的a206k突變體。

92、“可選地”，表示可以有，也可以無(wú)，以能夠?qū)崿F(xiàn)本發(fā)明的技術(shù)方案的為選擇標(biāo)準(zhǔn)。

93、本發(fā)明中，“可選方式”，表示只要適用于本發(fā)明的技術(shù)方案，就可以用來(lái)實(shí)施本發(fā)明。

94、本發(fā)明中，“優(yōu)選”、“較佳”、“更優(yōu)選”、“更佳”、“最優(yōu)選”等優(yōu)選實(shí)施方式，不構(gòu)成對(duì)發(fā)明的涵蓋范圍及保護(hù)范圍的任何意義上的限制，并非用于限定本發(fā)明的范圍和實(shí)施方式，僅用于提供一些實(shí)施方式作為舉例。

95、本發(fā)明的描述中，對(duì)于“優(yōu)選之一”、“優(yōu)選方式之一”、“優(yōu)選實(shí)施方式之一”、“優(yōu)選例之一”、“優(yōu)選例”、“在一優(yōu)選的實(shí)施方式中”、“一些優(yōu)選例中”、“一些優(yōu)選方式中”、“優(yōu)選為”、“優(yōu)選”、“優(yōu)選地”、“更優(yōu)選”、“更優(yōu)地”、“進(jìn)一步優(yōu)選”、“最優(yōu)選”等優(yōu)選方式，以及“實(shí)施方式之一”、“方式之一”、“示例”、“具體示例”、“舉例如”、“作為舉例”、“例如”、“比如”、“如”等示意的列舉方式，同樣不構(gòu)成對(duì)發(fā)明的涵蓋范圍及保護(hù)范圍的任何意義上的限制，且各方式所描述的具體特征包含于本發(fā)明的至少一個(gè)具體實(shí)施方式中。本發(fā)明中，各方式

96、所描述的具體特征可以在任何的一個(gè)或者多個(gè)具體實(shí)施方式中以合適的方式結(jié)合。本發(fā)明中，各優(yōu)選方式對(duì)應(yīng)的技術(shù)特征或技術(shù)方案也可以通過(guò)任意合適的方式結(jié)合。

97、本發(fā)明中，“其任意組合”，在數(shù)量上表示“大于1”，在涵蓋范圍上表示以下情形構(gòu)成的組：“任選其中一個(gè)，或者任選其中至少兩個(gè)構(gòu)成的組”。

98、本發(fā)明中，“一個(gè)或多個(gè)”、“一種或多種”等“一或多”的描述，與“至少一個(gè)”、“至少一種”、“其組合”、“或其組合”、“及其組合”、“或其任意組合”、“及其任意組合”等具有相同含義，可以互換使用，表示數(shù)量上等于“1”或“大于1”。

99、本發(fā)明中，采用“或/和”、“和/或”表示“任選其一或者任選其組合”，也表示至少其一。

100、本發(fā)明所述的“通?！?、“常規(guī)”、“一般”、“經(jīng)?！薄ⅰ巴钡确绞矫枋龅默F(xiàn)有技術(shù)手段，也都被引用作為本
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
的參考，如無(wú)特別說(shuō)明，可視為本發(fā)明的部分技術(shù)特征的優(yōu)選方式之一，且需要注意的是，不構(gòu)成對(duì)發(fā)明的涵蓋范圍及保護(hù)范圍的任何意義上的限制。

101、在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)及這些文獻(xiàn)直接引用或者間接引用的文獻(xiàn)，都在本技術(shù)中被引用作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨(dú)引用作為參考那樣。

102、應(yīng)理解，在本發(fā)明范圍內(nèi)，本發(fā)明的上述各技術(shù)特征和在下文(包括但不限于實(shí)施例)中具體描述的各技術(shù)特征之間都可以互相組合，從而構(gòu)成新的或優(yōu)選的技術(shù)方案，只要能夠用于實(shí)施本發(fā)明的即可。限于篇幅，不再一一累述。

103、1.純化底物(優(yōu)選為蛋白類(lèi)物質(zhì))

104、本發(fā)明的純化底物指本發(fā)明的磁性微球用來(lái)捕捉分離的物質(zhì)，沒(méi)有特別限制，只要所述純化底物能夠與本發(fā)明的生物微球的純化介質(zhì)(如本發(fā)明經(jīng)修飾的生物微球末端的金屬螯合物部分)特異性地相結(jié)合即可。

105、所述純化底物為蛋白類(lèi)物質(zhì)時(shí)，純化底物也稱(chēng)為目標(biāo)蛋白。

106、2.目標(biāo)蛋白中的純化標(biāo)簽

107、所述目標(biāo)蛋白中可以不攜帶純化標(biāo)簽，此時(shí)，目標(biāo)蛋白本身應(yīng)當(dāng)能夠被生物微球中的純化介質(zhì)所捕獲。

108、一些優(yōu)選方式中，所述目標(biāo)蛋白帶有純化標(biāo)簽，所述純化標(biāo)簽?zāi)軌蚺c所述純化介質(zhì)特異性地相結(jié)合。一個(gè)目標(biāo)蛋白分子中，所述純化標(biāo)簽的數(shù)量為一個(gè)、兩個(gè)或更多個(gè)；當(dāng)含有兩個(gè)或兩個(gè)以上純化標(biāo)簽時(shí)，所述純化標(biāo)簽的種類(lèi)為一種、兩種或者更多種。需要說(shuō)明的是，只要標(biāo)簽的氨基酸序列不同，就視為不同種類(lèi)的標(biāo)簽。

109、所述目標(biāo)蛋白中的純化標(biāo)簽可以選自包括但不限于以下標(biāo)簽的組：組氨酸標(biāo)簽、親和素、親和素類(lèi)似物、streg標(biāo)簽、flag標(biāo)簽或其變體、c標(biāo)簽及其變體、spot標(biāo)簽及其變體、gst標(biāo)簽及其變體、mbp標(biāo)簽及其變體、sumo標(biāo)簽及其變體、cbp標(biāo)簽及其變體、ha標(biāo)簽及其變體、avi標(biāo)簽及其變體、親和蛋白、抗體類(lèi)標(biāo)簽、抗原類(lèi)標(biāo)簽、及其組合。所述純化標(biāo)簽可以通過(guò)n-端或c-端融合。

110、所述組氨酸標(biāo)簽一般含有至少5個(gè)組氨酸殘基，比如5×his標(biāo)簽、6×his標(biāo)簽、8×his標(biāo)簽等。

111、所述c標(biāo)簽中包含epea序列。

112、所述gst標(biāo)簽指谷胱甘肽s-轉(zhuǎn)移酶標(biāo)簽。

113、所述mbp標(biāo)簽指麥芽糖結(jié)合蛋白標(biāo)簽。

114、所述sumo標(biāo)簽，是一種已知的小分子泛素樣修飾蛋白，是泛素(ubiquitin)類(lèi)多肽鏈超家族的重要成員之一。在一級(jí)結(jié)構(gòu)上，sumo與泛素只有18％的同源性，然而兩者的三級(jí)結(jié)構(gòu)及其生物學(xué)功能卻十分相似。

115、所述avi標(biāo)簽，是一種已知的由15個(gè)氨基酸殘基組成的小標(biāo)簽，該小標(biāo)簽可以被脫硫生物素連接酶bira特異性識(shí)別。

116、抗體類(lèi)標(biāo)簽，包括但不限于抗體的完整結(jié)構(gòu)(完整抗體)、結(jié)構(gòu)域、亞基、片段、重鏈、輕鏈、單鏈片段(如納米抗體，缺失輕鏈的重鏈，重鏈可變區(qū)、互補(bǔ)決定區(qū)等)，等。

117、抗原類(lèi)標(biāo)簽，包括但不限于抗原的完整結(jié)構(gòu)(完整抗原)、結(jié)構(gòu)域、亞基、片段、重鏈、輕鏈、單鏈片段(如抗原決定基等)，等。

118、一些優(yōu)選方式中，所述目標(biāo)蛋白的n端或c端連接一個(gè)純化標(biāo)簽，或者在兩端均連接有純化標(biāo)簽。

119、本部分所述的各種純化標(biāo)簽，均可以作為本發(fā)明的生物微球中的純化介質(zhì)的候選。

120、3.目標(biāo)蛋白的類(lèi)型

121、所述目標(biāo)蛋白可以為天然蛋白或其改造產(chǎn)物，也可以為人工合成序列。所述天然蛋白的來(lái)源沒(méi)有特別限制，包括但不限于：真核細(xì)胞、原核細(xì)胞、病原體；其中真核細(xì)胞來(lái)源包括但不限于：哺乳動(dòng)物細(xì)胞、植物細(xì)胞、酵母細(xì)胞、昆蟲(chóng)細(xì)胞、線蟲(chóng)細(xì)胞、及其組合；所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞來(lái)源可以包括但不限于鼠源(包括大鼠、小鼠、豚鼠、金地鼠、倉(cāng)鼠等)、兔源、猴源、人源、豬源、羊源、牛源、狗源、馬源等。所述病原體包括病毒、衣原體、支原體等。所述病毒包括hpv、hbv、tmv、冠狀病毒、輪狀病毒等。

122、所述目標(biāo)蛋白的類(lèi)型包括但不限于多肽(本發(fā)明中“目標(biāo)蛋白”廣義地包括多肽)、熒光類(lèi)蛋白、酶及相應(yīng)的酶原、抗體、抗原、免疫球蛋白、激素、膠原、聚氨基酸、疫苗等，前述任一種蛋白的部分結(jié)構(gòu)域，前述任一種蛋白的亞基或片段，以及前述任一種蛋白的變體。所述“前述任一種蛋白的亞基或片段”包括“前述任一種蛋白的部分結(jié)構(gòu)域”的亞基或片段。所述“前述任一種蛋白的變體”包括“前述任一種蛋白的部分結(jié)構(gòu)域、前述任一種蛋白的亞基或片段”的變體。所述“前述任一種蛋白的變體”包括但不限于前述任一種蛋白的突變體。本發(fā)明中，其它位置的連續(xù)兩個(gè)或兩個(gè)以上“前述”的情形，含義做類(lèi)似解釋。

123、所述目標(biāo)蛋白的結(jié)構(gòu)，既可以為完整結(jié)構(gòu)，也可以選自相應(yīng)的部分結(jié)構(gòu)域、亞基、片段、二聚體、多聚體、融合蛋白、糖蛋白等。不完整的抗體結(jié)構(gòu)的舉例如，納米抗體(缺失輕鏈的重鏈抗體，vhh，保留了重鏈抗體完整的抗原結(jié)合能力)、重鏈可變區(qū)、互補(bǔ)決定區(qū)(cdr)等。

124、例如，本發(fā)明所述體外蛋白合成體系可合成的目標(biāo)蛋白，可以選自包括但不限于以下任一種蛋白、任意組合方式的融合蛋白、任意組合方式的組合物：熒光素酶(如螢火蟲(chóng)熒光素酶)、綠色熒光蛋白(gfp)、增強(qiáng)綠色熒光蛋白(egfp)、黃色熒光蛋白(yfp)、氨酰trna合成酶、甘油醛-3-磷酸脫氫酶、過(guò)氧化氫酶(catalase，舉例如鼠過(guò)氧化氫酶)、肌動(dòng)蛋白、抗體、抗體的可變區(qū)域(如抗體的單鏈可變區(qū)域，scfv)、抗體的單鏈及其片段(如抗體的重鏈、納米抗體、抗體的輕鏈)、α-淀粉酶、腸道菌素a、丙型肝炎病毒e2糖蛋白、胰島素及其前體、胰高血糖素樣肽(glp-1)、干擾素(包括但不限于干擾素α，如干擾素αa、干擾素β、干擾素γ等)、白介素(如白細(xì)胞介素-1β、白介素2、白介素12等)、溶菌酶素、血清白蛋白(包括但不限于人血清白蛋白、牛血清白蛋白)、甲狀腺素運(yùn)載蛋白、酪氨酸酶、木聚糖酶、β-半乳糖苷酶(β-galactosidase,lacz，舉例如大腸桿菌β-半乳糖苷酶)，等，前述任一種蛋白的部分結(jié)構(gòu)域，前述任一種蛋白的亞基或片段，或前述任一種的變體(如前述定義，所述變體包括突變體，舉例如螢光素酶突變體、egfp的突變體，所述變體還可以是同源體)。所述氨酰trna合成酶，舉例如人賴(lài)氨酸-trna合成酶(lysine-trna?synthetase)、人亮氨酸-trna合成酶(leucine-trna?synthetase)等。所述甘油醛-3-磷酸脫氫酶，舉例如擬南芥甘油醛3-磷酸脫氫酶，glyceraldehyde-3-phosphate?dehydrogenase。還可參考專(zhuān)利文獻(xiàn)cn109423496a。所述任意組合方式的組合物，可以包括前述任一種蛋白，也可以包括前述任意組合方式的融合蛋白。

125、一些優(yōu)選方式中，采用gfp、egfp、mscarlet等之一，或其類(lèi)似物質(zhì)、或其突變體等具有熒光性質(zhì)的目標(biāo)蛋白對(duì)所述體外蛋白合成體系的蛋白合成能力進(jìn)行評(píng)估。

126、所述目標(biāo)蛋白的應(yīng)用領(lǐng)域包括但不限于生物醫(yī)藥、分子生物、醫(yī)學(xué)、體外檢測(cè)、醫(yī)療診斷、再生醫(yī)學(xué)、生物工程、組織工程、干細(xì)胞工程、基因工程、聚合物工程、表面工程、納米工程、化妝品、食品、食品添加劑、營(yíng)養(yǎng)劑、農(nóng)業(yè)、飼料、生活用品、洗滌、環(huán)境、化學(xué)染色、熒光標(biāo)記等領(lǐng)域。

127、4.含有目標(biāo)蛋白的混合體系

128、本發(fā)明的生物微球可用于將目標(biāo)蛋白從其混合體系中分離出來(lái)。所述目標(biāo)蛋白不限于一種物質(zhì)，允許是多種物質(zhì)的組合，只要純化的目的是為了獲得這種組合物，或者這種組合物的形式可以滿足純化需求。

129、含有目標(biāo)蛋白的混合體系沒(méi)有特別限制，只要本發(fā)明的生物微球的純化介質(zhì)能夠與目標(biāo)蛋白特異性結(jié)合即可；通常地，還需要所述純化介質(zhì)與混合體系中目標(biāo)蛋白以外的其他物質(zhì)不存在特異性結(jié)合或非特異性結(jié)合作用。

130、本發(fā)明的實(shí)施例中，所述含有目標(biāo)蛋白的混合體系可以為天然來(lái)源，也可以為人工構(gòu)建或得到的混合體系。

131、比如，可以從市售血清中分離純化特定蛋白。

132、比如，可以從體外蛋白合成體系(in?vitro?protein?synthesis?system)的反應(yīng)后的體系中分離目標(biāo)蛋白。

133、體外蛋白合成反應(yīng)，是指在體外無(wú)細(xì)胞合成體系中合成蛋白的反應(yīng)，至少包括翻譯過(guò)程。包括但不限于ivt反應(yīng)(體外翻譯反應(yīng))、ivtt反應(yīng)(體外轉(zhuǎn)錄翻譯反應(yīng))、ivdtt反應(yīng)(體外復(fù)制轉(zhuǎn)錄翻譯反應(yīng))。本發(fā)明中，優(yōu)選ivtt反應(yīng)。ivtt反應(yīng)，對(duì)應(yīng)ivtt體系，是在體外將dna轉(zhuǎn)錄翻譯為蛋白質(zhì)(protein)的過(guò)程，因此，我們還將這類(lèi)的體外蛋白合成體系稱(chēng)為d2p體系、d-to-p體系、d_to_p體系、dna-to-protein體系；相應(yīng)的體外蛋白合成方法，還稱(chēng)為d2p方法、d-to-p方法、d_to_p方法、dna-to-protein方法。

134、“無(wú)細(xì)胞體系”，是指進(jìn)行體外蛋白合成時(shí)，并非通過(guò)完整細(xì)胞分泌表達(dá)的方式。需要說(shuō)明的是，本發(fā)明的體外無(wú)細(xì)胞蛋白合成體系中，也允許添加細(xì)胞組分以促進(jìn)反應(yīng)，但所添加的細(xì)胞不以分泌表達(dá)外源目標(biāo)蛋白為主要目的。此外，在本發(fā)明指導(dǎo)下構(gòu)建的無(wú)完整細(xì)胞的d2p體系中，有意地添加少量完整細(xì)胞(例如，其提供的蛋白含量與細(xì)胞提取物提供的蛋白含量相比，不超過(guò)30wt％)，這樣的“規(guī)避”方式，也囊括在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。

135、所述體外蛋白合成體系的具體實(shí)施方式之一，還包括但不限于，例如wo2016005982a1所記載的基于大腸桿菌的無(wú)細(xì)胞蛋白合成體系。本發(fā)明的其它引用文獻(xiàn)、其直接及間接引用文獻(xiàn)中所記載的包括但不限于基于麥胚細(xì)胞、兔網(wǎng)織紅細(xì)胞、釀酒酵母、畢赤酵母、馬克斯克魯維酵母的體外無(wú)細(xì)胞蛋白合成體系，也均作為本發(fā)明的體外蛋白合成體系的實(shí)施方式納入本發(fā)明。舉例如，文獻(xiàn)“l(fā)?u,y.advances?in?cell-freebiosynthetic?technology.current?developments?in?biotechnology?andbioengineering,2019,chapter?2,23-45”中包括但不限于“2.1systems?and?advantages”部分第27-28頁(yè)所引用文獻(xiàn)中記載的體外無(wú)細(xì)胞蛋白合成體系(in?vitro?cell-freeprotein?synthesis?system)，均可作為實(shí)施本發(fā)明的體外蛋白合成體系。舉例如(除非和本發(fā)明相沖突，否則，下述文獻(xiàn)及其引用文獻(xiàn)以全部?jī)?nèi)容、全部目的被引用)，文獻(xiàn)cn106978349a、cn108535489a、cn108690139a、cn108949801a、cn108642076a、cn109022478a、cn109423496a、cn109423497a、cn10942350?9a、cn109837293a、cn109971783a、cn109988801a、cn109971775a、cn1100?93284a、cn110408635a、cn110408636a、cn110551745?a、cn110551700a、cn110551785a、cn110819647a、cn110845622、cn110938649a、cn110964736a、cn111378706a、cn111378707a、cn111378708a、cn111718419a、cn111748569a、cn2019107298813、cn2019112066163、cn2018112862093、cn2019114181518、cn2020100693833、cn2020101796894、cn202010269333x、cn2020102693382、cn2020113574616及其引用文獻(xiàn)中記載的體外無(wú)細(xì)胞蛋白合成體系、dna模板的構(gòu)建和擴(kuò)增方法，均可作為實(shí)施本發(fā)明的體外蛋白合成體系、本發(fā)明的dna模板的構(gòu)建和擴(kuò)增方法。

136、所述體外蛋白合成體系的細(xì)胞提取物的來(lái)源細(xì)胞沒(méi)有特別限制，只要能夠體外表達(dá)所述目標(biāo)蛋白即可?，F(xiàn)有技術(shù)已公開(kāi)的適用原核細(xì)胞提取物、真核細(xì)胞提取物(可以?xún)?yōu)選酵母細(xì)胞提取物，還可以更優(yōu)先乳酸克魯維酵母)來(lái)源的體外蛋白合成體系的外源蛋白，或者適用于細(xì)胞內(nèi)合成的原核細(xì)胞體系、真核細(xì)胞體系(可以?xún)?yōu)選為酵母細(xì)胞體系，還可以更優(yōu)選為乳酸克魯維酵母體系)的內(nèi)源蛋白，也均可以采用本發(fā)明的體外蛋白合成體系進(jìn)行合成，或者嘗試用本發(fā)明提供的體外蛋白合成體系進(jìn)行合成。

137、所述體外蛋白合成體系的優(yōu)選方式之一為ivtt體系。進(jìn)行ivtt反應(yīng)后的液體(記為ivtt反應(yīng)液)，除了含有所表達(dá)的目標(biāo)的蛋白外，還含有ivtt體系中殘余反應(yīng)原料，特別含有來(lái)自細(xì)胞提取物的各種因子(比如核糖體、trna、翻譯相關(guān)酶、起始因子、延伸因子、終止因子等)。所述ivtt反應(yīng)液，一方面能夠提供用于與生物微球結(jié)合的目標(biāo)蛋白，另一方面還可以提供用于檢驗(yàn)?zāi)繕?biāo)蛋白分離效果的混合體系。

138、“本發(fā)明的表達(dá)系統(tǒng)”、“本發(fā)明的體外表達(dá)系統(tǒng)”、“體外無(wú)細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)”、“體外無(wú)細(xì)胞表達(dá)體系”可互換使用，均指本發(fā)明的體外蛋白表達(dá)體系，也可采用其它描述方式，如：蛋白質(zhì)體外合成系統(tǒng)、體外蛋白合成體系、無(wú)細(xì)胞系統(tǒng)、無(wú)細(xì)胞體系、無(wú)細(xì)胞蛋白合成體系、無(wú)細(xì)胞體外蛋白合成體系、體外無(wú)細(xì)胞蛋白合成體系、體外無(wú)細(xì)胞合成體系、cfs體系(cell-free?system)、cfps體系(cell-free?protein?synthesis?system)等描述方式。根據(jù)反應(yīng)機(jī)理，可包括體外翻譯體系(可簡(jiǎn)記為ivt體系，一種mr2p體系)、體外轉(zhuǎn)錄翻譯體系(可簡(jiǎn)記為ivtt體系，一種d2p體系)、體外復(fù)制轉(zhuǎn)錄翻譯體系(可簡(jiǎn)記為ivdtt體系，一種d2p體系)等。本發(fā)明中，優(yōu)選ivtt體系。我們還將體外蛋白合成系統(tǒng)稱(chēng)為“蛋白質(zhì)合成工廠”(“protein?factory”或“proteinfactory”或“proteinfactory”)。本發(fā)明提供的體外蛋白合成系統(tǒng)，對(duì)其組分是采用開(kāi)放式的描述方式的。本發(fā)明的無(wú)細(xì)胞蛋白合成體系是以外源dna、mrna或者其組合作為蛋白質(zhì)合成的核酸模板，通過(guò)人工控制補(bǔ)加蛋白質(zhì)合成所需的底物和轉(zhuǎn)錄、翻譯相關(guān)蛋白因子等物質(zhì)，實(shí)現(xiàn)目標(biāo)蛋白的體外合成。

139、本發(fā)明中，“蛋白”與“蛋白質(zhì)”具有相同含義，均譯為protein，可以互換使用。

140、本發(fā)明中，“系統(tǒng)”和“體系”，均譯為system，可以互換使用。

141、本發(fā)明中，“蛋白合成量”、“蛋白表達(dá)量”與“蛋白表達(dá)產(chǎn)量”具有相同含義，可互換使用。

142、本發(fā)明中，細(xì)胞提取物、細(xì)胞提取液、細(xì)胞裂解物、細(xì)胞破碎物、細(xì)胞溶解產(chǎn)物的含義相同，可以互換使用，英文可采用cell?extract、cell?lysate等描述方式。

143、本發(fā)明中，能量體系、能量系統(tǒng)、能量供應(yīng)體系具有同等含義，可互換使用。能量再生體系、能量再生系統(tǒng)具有同等含義，可互換使用。能量再生系統(tǒng)是能量系統(tǒng)的優(yōu)選實(shí)施方式或者組成部分。

144、本發(fā)明的體外合成體系還包括選自下組的一種或多種組分：用于合成蛋白質(zhì)的底物、用于合成rna的底物、rna聚合酶、鎂離子、鉀離子、緩沖劑、能量再生系統(tǒng)、聚乙二醇(peg)或其類(lèi)似物、二硫蘇糖醇(dtt)和任選的溶劑，所述溶劑為水或水性溶劑。進(jìn)一步的，所述細(xì)胞提取物不含酵母內(nèi)源性的長(zhǎng)鏈核酸分子。

145、進(jìn)一步的，所述的合成rna的底物包括：核苷單磷酸、核苷三磷酸之一或其組合。

146、進(jìn)一步的，所述的合成蛋白質(zhì)的底物包括：20種天然氨基酸以及非天然氨基酸。

147、進(jìn)一步的，所述鎂離子來(lái)源于鎂離子源，所述鎂離子源選自下組：醋酸鎂、谷氨酸鎂之一或其組合。

148、進(jìn)一步的，所述鉀離子來(lái)源于鉀離子源，所述鉀離子源選自下組：醋酸鉀、谷氨酸鉀之一或其組合。

149、進(jìn)一步的，所述能量再生系統(tǒng)選自下組：磷酸肌酸/磷酸肌酸酶系統(tǒng)、糖酵解途徑中間產(chǎn)物能量系統(tǒng)之一、蔗糖或其組合。

150、進(jìn)一步的，所述緩沖劑選自下組：4-羥乙基哌嗪乙磺酸、三羥甲基氨基甲烷之一或其組合。

151、進(jìn)一步的，所述蛋白合成體系含有聚乙二醇(peg)或其類(lèi)似物。聚乙二醇或其類(lèi)似物的濃度沒(méi)有特別限制，通常，聚乙二醇或其類(lèi)似物的濃度(w/v)為0.1-8％，較佳地，0.5-4％，更佳地，1-2％，以所述蛋白合成體系的總重量計(jì)。代表性的peg選自下組：peg3000、peg3350、peg6000、peg8000之一或其組合。

152、進(jìn)一步的，所述聚乙二醇包括分子量(da)為200-10000的聚乙二醇，如peg200、400、1500、2000、4000、6000、8000、10000等，較佳地，分子量為3000-10000的聚乙二醇。

153、可選的方案為，本發(fā)明提供的蛋白合成體系包括：酵母細(xì)胞提取物，4-羥乙基哌嗪乙磺酸，醋酸鉀，醋酸鎂，腺嘌呤核苷三磷酸(atp)，鳥(niǎo)嘌呤核苷三磷酸(gtp)，胞嘧啶核苷三磷酸(ctp)，胸腺嘧啶核苷三磷酸(ttp)，氨基酸混合物，磷酸肌酸，二硫蘇糖醇(dtt)，磷酸肌酸激酶，rna聚合酶，聚乙二醇，蔗糖。

154、在本發(fā)明中，所述的細(xì)胞提取物不含完整的細(xì)胞，典型的細(xì)胞提取物包括用于蛋白翻譯的核糖體、轉(zhuǎn)運(yùn)rna、氨酰trna合成酶、蛋白質(zhì)合成需要的起始因子和延伸因子以及終止釋放因子。此外，細(xì)胞提取物中還含有一些源自細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中的其他蛋白，尤其是可溶性蛋白。

155、在本發(fā)明中，所述的細(xì)胞提取物所含蛋白含量為20-100mg/ml,較佳為50-100mg/ml。所述的測(cè)定蛋白含量方法為考馬斯亮藍(lán)測(cè)定方法。

156、在本發(fā)明中，所述的細(xì)胞提取物或細(xì)胞裂解液的制備方法不受限制，一種優(yōu)選的制備方法包括以下步驟：

157、(i)提供細(xì)胞；

158、(ii)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行洗滌處理，獲得經(jīng)洗滌的細(xì)胞；

159、(iii)對(duì)經(jīng)洗滌的細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞破碎處理，從而獲得細(xì)胞粗提物；

160、(iv)對(duì)所述細(xì)胞粗提物進(jìn)行固液分離，獲得液體部分，即為細(xì)胞提取物。

161、在本發(fā)明中，所述的固液分離方式不受特別限制，一種優(yōu)選的方式為離心。

162、在本發(fā)明中，所述離心條件不受特別限制，一種優(yōu)選的離心條件為5000-100000×g，較佳地，8000-30000×g。

163、在本發(fā)明中，所述離心時(shí)間不受特別限制，一種優(yōu)選的離心時(shí)間為0.5min-2h，較佳地，20min-50min。

164、在本發(fā)明中，所述離心的溫度不受特別限制，優(yōu)選的，所述離心在1-10℃下進(jìn)行，較佳地，在2-6℃下進(jìn)行。

165、在本發(fā)明中，所述的洗滌處理方式不受特別限制，一種優(yōu)選的洗滌處理方式為采用洗滌液在ph為7-8(較佳地，7.4)下進(jìn)行處理，所述洗滌液沒(méi)有特別限制，典型的所述洗滌液選自下組：4-羥乙基哌嗪乙磺酸鉀、醋酸鉀、醋酸鎂、或其組合。

166、在本發(fā)明中，所述細(xì)胞破碎處理的方式不受特別限制，一種優(yōu)選的細(xì)胞破碎處理包括高壓破碎、凍融(如液氮低溫)破碎。

167、所述蛋白合成體系中的核苷三磷酸混合物為腺嘌呤核苷三磷酸、鳥(niǎo)嘌呤核苷三磷酸、胞嘧啶核苷三磷酸和尿嘧啶核苷三磷酸。在本發(fā)明中，各種單核苷酸的濃度沒(méi)有特別限制，通常每種單核苷酸的濃度為0.5-5mm，較佳地為1.0-2.0mm。

168、所述蛋白合成體系中的氨基酸混合物可包括天然或非天然氨基酸，可包括d型或l型氨基酸。代表性的氨基酸包括(但并不限于)20種天然氨基酸：甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、色氨酸、絲氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、蛋氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、蘇氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、賴(lài)氨酸、精氨酸和組氨酸。每種氨基酸的濃度通常為0.01-0.5mm，較佳地0.02-0.2mm，如0.05、0.06、0.07、0.08mm。

169、在優(yōu)選例中，所述體外無(wú)細(xì)胞蛋白合成體系還含有蔗糖，所述蔗糖的濃度為0.03-40wt％，較佳地，0.08-10wt％，更佳地，0.1-5wt％，以所述蛋白合成體系的總重量計(jì)。

170、一種特別優(yōu)選的體外無(wú)細(xì)胞蛋白合成體系，除了酵母細(xì)胞提取物之外，還含有以下組分：22mm?ph為7.4的4-羥乙基哌嗪乙磺酸，30-150mm醋酸鉀，1.0-5.0mm醋酸鎂，1.5-4mm核苷三磷酸混合物，0.08-0.24mm的氨基酸混合物，25mm磷酸肌酸，1.7mm二硫蘇糖醇，0.27mg/ml磷酸肌酸激酶，1％-4％聚乙二醇，0.5％-2％蔗糖，0.027-0.054mg/ml?t7rna聚合酶。

171、本發(fā)明中細(xì)胞提取物和細(xì)胞裂解液所表達(dá)的含義相同，均為細(xì)胞破碎以后所獲得的物質(zhì)。