本發(fā)明屬于癌癥分子診斷，具體地，涉及alx4基因特定區(qū)域甲基化水平在診斷和預(yù)測(cè)結(jié)直腸癌中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、結(jié)直腸癌是全球最常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率和病死率呈現(xiàn)逐年上升的趨勢(shì)。在中國，2023年國家癌癥中心數(shù)據(jù)顯示，結(jié)直腸癌超越胃癌，成為發(fā)病率第二高的癌癥，而且近80％的患者發(fā)現(xiàn)就是中晚期，近半數(shù)患者生存期不到5年。因此，降低結(jié)直腸癌的發(fā)病率和死亡率，成為中國乃至全球亟待解決的重大公共衛(wèi)生問題。

2、根據(jù)癌變過程的多階段理論，結(jié)直腸癌的發(fā)生從形態(tài)上表現(xiàn)為正常黏膜增生、腺瘤形成、腺瘤癌變到浸潤轉(zhuǎn)移的階段性演變。從腺瘤演變?yōu)榻Y(jié)直腸癌需要10-15年，結(jié)直腸癌早期發(fā)現(xiàn)的治愈率可達(dá)90％以上，晚期癌不足10％。通過篩查進(jìn)行干預(yù)是降低結(jié)直腸癌發(fā)病率和死亡率的有效措施。

3、結(jié)腸鏡是結(jié)直腸癌篩查的金標(biāo)準(zhǔn)，但因其侵入性強(qiáng)、腸道準(zhǔn)備繁瑣，中國人結(jié)腸鏡篩查的依從性偏低。另外，結(jié)腸鏡檢查需求量大，隨著人口老齡化，老年人及40歲以上人群在增加，結(jié)腸鏡檢查的人數(shù)呈現(xiàn)井噴式增長，大規(guī)模應(yīng)用腸鏡作為篩查也會(huì)造成極大的資源浪費(fèi)。傳統(tǒng)篩查方案采用問卷調(diào)查結(jié)合兩次糞便隱血試驗(yàn)(fit)的兩步篩查模式。凡任意一項(xiàng)陽性者，判定為初篩陽性，提示為高危人群，需接受腸鏡檢查。這個(gè)篩查存在假陽性過高、腸癌檢出率低等問題，且該篩查模式導(dǎo)致醫(yī)院沒有足夠的人力投入，因而項(xiàng)目進(jìn)展緩慢。

4、基于血液dna檢測(cè)的腸癌輔助診斷技術(shù)，當(dāng)前上市產(chǎn)品普遍靈敏度不高，均不到85％，不能滿足臨床需求。臨床實(shí)踐表明，血液septin9甲基化檢測(cè)主要局限在于其對(duì)結(jié)直腸癌以及癌前病變(腺瘤)的識(shí)別靈敏度都相對(duì)比較低，對(duì)于進(jìn)展期腺瘤靈敏度僅為7.9％至38.7％。

5、基于糞便dna檢測(cè)的腸癌篩查技術(shù)，主要針對(duì)結(jié)直腸脫落細(xì)胞的基因突變和/或甲基化等特征，克服了檢測(cè)微量出血的主要缺陷，有單靶點(diǎn)和多靶點(diǎn)方案，也可與fit聯(lián)合檢測(cè)，具有無需特殊設(shè)備、無需限制飲食、無創(chuàng)等優(yōu)點(diǎn)。雖然在腸癌靈敏度、特異性上有顯著提升，但是對(duì)于0-ii早期癌癥仍在90％以下，而癌前病變，高級(jí)別上皮內(nèi)瘤變等進(jìn)展期腺瘤的檢出率水平更低，均不到65％甚至更低。糞便dna的檢測(cè)雖然可以實(shí)現(xiàn)居家取樣，但是糞便取材比較私密，較不方便，不同于大眾的就醫(yī)習(xí)慣。大眾接受糞便dna檢測(cè)還需非常長的健康宣傳教育，因而篩查推進(jìn)中仍然存在一定檢測(cè)依從性的問題。

6、因此開發(fā)基于臨床上用戶依從性最高的血液樣本，挖掘新的靈敏度較高的結(jié)直腸癌標(biāo)記，并能成為亟待解決的問題。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明的發(fā)明者們付出了大量的努力來開發(fā)基于非重亞硫酸鹽技術(shù)在血液中有效的結(jié)直腸癌甲基化標(biāo)志物，其標(biāo)志物使得癌癥和癌變風(fēng)險(xiǎn)的早期診斷成為可能。出乎意料地發(fā)現(xiàn)，alx4基因特定區(qū)域在結(jié)直腸癌癌細(xì)胞中被甲基化，利用該基因作為生物標(biāo)志物，通過非重亞硫酸鹽處理的甲基化檢測(cè)體系檢測(cè)該基因甲基化水平，具有較高的靈敏度，可以診斷結(jié)直腸癌，由此完成了本發(fā)明。

2、本發(fā)明第一方面提供alx4基因特定區(qū)域甲基化水平的檢測(cè)試劑在制備用于診斷結(jié)直腸癌或預(yù)測(cè)結(jié)直腸癌風(fēng)險(xiǎn)的試劑盒中的應(yīng)用。

3、alx同源框4(alx4)基因編碼一種配對(duì)樣同源結(jié)構(gòu)域轉(zhuǎn)錄因子，該轉(zhuǎn)錄因子在發(fā)育中的骨骼、四肢、毛發(fā)、牙齒和乳腺組織的間充質(zhì)中表達(dá)。該基因的突變導(dǎo)致頂葉孔2(pfm2)；一種以頂骨骨化不足為特征的常染色體顯性遺傳病。該基因的突變也會(huì)導(dǎo)致一種額鼻發(fā)育不良伴脫發(fā)和性腺功能減退癥；表明該基因在顱面發(fā)育、間充質(zhì)上皮細(xì)胞通訊和毛囊發(fā)育中的作用。刪除含有該基因del(11)(p11p12)的11號(hào)染色體片段會(huì)導(dǎo)致potocki-shaffer綜合征(pss)：一種以男性顱面畸形、認(rèn)知障礙、多發(fā)性外生骨疣和生殖器異常為特征的綜合征。在小鼠中，已證明該基因使用相隔16個(gè)密碼子的雙翻譯起始位點(diǎn)。

4、幾乎所有的腫瘤都是由遺傳改變和表觀遺傳學(xué)變異共同引起并促進(jìn)的。通過比較腫瘤細(xì)胞和正常細(xì)胞，大量的表觀遺傳學(xué)異常被發(fā)現(xiàn)報(bào)道，其中dna甲基化是最常見的表觀遺傳學(xué)效應(yīng)。

5、dna上胞嘧啶的甲基化是一種共價(jià)dna“后天性”修飾。dna的甲基化是由dna胞嘧啶甲基轉(zhuǎn)移酶(dna?methyltransferases，dnmts)來承擔(dān)。dnmts可以將甲基從一個(gè)s-腺苷甲硫氨酸上轉(zhuǎn)移到胞嘧啶的c-5位置上。dna甲基化幾乎特異性的發(fā)生在cpg二聯(lián)體位置，cpg二聯(lián)體在人類基因組中不均勻分布，集中富集的區(qū)域一般稱為cpg島。在人的基因組重復(fù)序列和許多基因5'端的調(diào)控區(qū)域都存在這樣的cpg。腫瘤中出現(xiàn)的dna甲基化異常包括低甲基化(或稱為去甲基化)和高甲基化兩種，高甲基化的發(fā)生包括但不限于抑癌基因，低甲基化的發(fā)生包括但不限于原癌基因。

6、腫瘤的發(fā)生發(fā)展所有方面都有可能與dna的甲基化改變相關(guān)，涉及細(xì)胞周期調(diào)控、dna損傷修復(fù)、致癌化合物的生化代謝、細(xì)胞凋亡和血管生成。不同類型的腫瘤可能有特定的一群抑癌基因高甲基化、原癌基因低甲基化，即有一個(gè)特異的癌種甲基化圖譜，并根據(jù)甲基化圖譜可能實(shí)現(xiàn)癌種的類型確認(rèn)。

7、在本發(fā)明中，發(fā)明人經(jīng)過長期的探索和大量臨床樣本的驗(yàn)證，意外地發(fā)現(xiàn)，alx4基因特定區(qū)域的甲基化水平在結(jié)直腸癌和非結(jié)直腸癌中差異十分顯著。

8、在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，所述alx4基因特定區(qū)域的甲基化區(qū)域利用探針組合在結(jié)直腸癌群體樣本和正常樣本中獲得，所述探針組合中各探針的覆蓋信息如下：

9、。

10、在本發(fā)明的一些具體實(shí)施方案中，所述特定區(qū)域包括chr11:44311452-44311645的至少一部分，chr11:44311452-44311645包含的甲基化位點(diǎn)有11個(gè)，分別為chr11:44311462-44311463、chr11:44311480-44311481、chr11:44311517-44311518、chr11:44311520-44311521、chr11:44311522-44311523、chr11:44311557-44311558、chr11:44311570-44311571、chr11:44311574-44311575、chr11:44311581-44311582、chr11:44311608-44311609和chr11:44311642-44311643。

11、在本發(fā)明的一些優(yōu)選實(shí)施方案中，所述特定區(qū)域包括上述甲基化位點(diǎn)的一個(gè)或多個(gè)即可，可以是連續(xù)的，也可以是間隔的。在本發(fā)明的一些更優(yōu)選實(shí)施方案中，所述特定區(qū)域包括chr11:44311570-44311571、chr11:44311574-44311575、chr11:44311581-44311582、chr11:44311608-44311609和chr11:44311642-44311643共5個(gè)甲基化位點(diǎn)。在本發(fā)明的一些最優(yōu)選實(shí)施方案中，所述特定區(qū)域包括chr11:44311570-44311643，進(jìn)一步，所述甲基化區(qū)域可在此基礎(chǔ)上延長若干個(gè)堿基，在本發(fā)明的一些具體實(shí)施方案中，所述特定區(qū)域包括chr11:44311570-44311644。

12、在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，所述檢測(cè)試劑包括甲基化區(qū)域富集或甲基化處理試劑，還包括qpcr檢測(cè)試劑。

13、甲基化富集技術(shù)是一種用于研究dna上的甲基化修飾的分析方法。dna甲基化是一種重要的表觀遺傳學(xué)修飾，涉及到甲基基團(tuán)的添加到dna分子中的胞嘧啶環(huán)上。這種修飾在調(diào)控基因表達(dá)、細(xì)胞分化、基因組穩(wěn)定性等生物學(xué)過程中起著關(guān)鍵作用。因此，了解dna甲基化的狀態(tài)對(duì)于理解生物學(xué)過程和疾病的發(fā)生發(fā)展非常重要。

14、常見的甲基化富集技術(shù)包括甲基化特異性pcr(msp)、甲基化敏感限制酶切割(methylation-sensitive?restriction?enzyme?digestion)、medip-seq(methylated?dnaimmunoprecipitation?sequencing)和mbd-seq(methyl-cpg?binding?domainsequencing)等，其中：

15、msp使用甲基化特異性的引物，通過pcr選擇性地?cái)U(kuò)增甲基化的dna片段。具有簡單、快速，適用于特定cpg位點(diǎn)的分，但不能提供全基因組的甲基化信息，只適用于事先確定的目標(biāo)區(qū)域。

16、甲基化敏感限制酶切割利用限制酶對(duì)dna序列的敏感性差異來區(qū)分甲基化和非甲基化的dna區(qū)域。這種方法基于dna甲基化會(huì)影響胞嘧啶環(huán)上的堿基對(duì)限制酶的敏感性的原理。這種技術(shù)不需要使用昂貴的測(cè)序技術(shù)，可以通過凝膠電泳等方法進(jìn)行分析。但無法提供單個(gè)cpg位點(diǎn)的高分辨率信息，通常提供的是整體區(qū)域的甲基化狀況。同時(shí)受限于選擇的限制酶的特異性，可能會(huì)漏檢或過檢一些甲基化位點(diǎn)。另外，也不能直接區(qū)分5-甲基胞嘧啶和其他形式的dna修飾。

17、medip-seq使用甲基化dna抗體選擇性地富集甲基化的dna片段，然后通過高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)富集物進(jìn)行分析。可以富集整個(gè)甲基化的基因組區(qū)域，適用于全基因組的甲基化分析。但不能提供單個(gè)cpg位點(diǎn)的高分辨率信息。

18、mbd-seq使用甲基化dna結(jié)合蛋白質(zhì)(如mbd2或mbd3)來富集甲基化的dna片段，隨后通過測(cè)序進(jìn)行分析。能夠提供較高的富集效率，適用于全基因組的甲基化分析。但與medip-seq類似，不能提供單個(gè)cpg位點(diǎn)的高分辨率信息。

19、在本發(fā)明中，所述甲基化處理也稱為甲基化轉(zhuǎn)化。常見的甲基化處理測(cè)序技術(shù)包括亞硫酸鹽測(cè)序(bissulfite?sequencing，bs-seq)，bs-seq使用亞硫酸鹽對(duì)dna進(jìn)行處理，將非甲基化的胞嘧啶轉(zhuǎn)化為尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不受影響，然后通過測(cè)序進(jìn)行分析。能夠提供單個(gè)cpg位點(diǎn)的高分辨率信息，可以對(duì)全基因組進(jìn)行甲基化分析。但實(shí)驗(yàn)步驟較繁瑣。

20、在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，利用甲基化dna免疫共沉淀(methylated?dnaimmunoprecipitation，medip)技術(shù)進(jìn)行甲基化片段的富集。甲基化dna抗體選自5-甲基胞苷抗體、5-甲基胞嘧啶(5-mc)抗體、5-羥甲基胞嘧啶(5-hmc)抗體、5-甲酰胞嘧啶(5-fc)抗體、5-羧基胞嘧啶(5-cac)抗體中的一種。

21、在本發(fā)明的一些優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述甲基化區(qū)域富集試劑包括5-甲基胞嘧啶抗體。

22、進(jìn)一步地，所述qpcr檢測(cè)試劑包括靶向所述特定區(qū)域的引物對(duì)和探針。

23、進(jìn)一步地，所特定區(qū)域包括為chr11:44311452-44311645的至少一部分，優(yōu)選地，所述甲基化區(qū)域?yàn)閏hr11:44311570-44311644，所述引物對(duì)如seq?id?no.1和seq?id?no.2所示，所述探針如seq?id?no.3所示。

24、在本發(fā)明的另一些實(shí)施方案中，所述甲基化處理試劑包括重亞硫酸鹽。

25、進(jìn)一步地，所述qpcr檢測(cè)試劑包括靶向所述甲基化處理后序列的引物對(duì)和探針。

26、更進(jìn)一步地，所述甲基化區(qū)域包括為chr11:44311452-44311645的至少一部分，優(yōu)選地，所述甲基化區(qū)域?yàn)閏hr11:44311570-44311644，所述引物對(duì)如seq?id?no.4和seq?idno.5所示，所述探針如seq?id?no.6所示。

27、通過對(duì)某一類的癌癥進(jìn)行相關(guān)甲基化dna分析有可能實(shí)現(xiàn)對(duì)癌癥的早期發(fā)現(xiàn)。目前主流的甲基化分析手段為重亞硫酸鹽處理，過程包括變性、脫氨基和脫磺酸基，dna先被變性成單鏈，然后經(jīng)高溫、高鹽、酸性、堿性環(huán)境，遭遇冰火兩重天，獲得的轉(zhuǎn)化dna的形態(tài)為：單鏈為主，雙鏈混合，片段缺刻、缺口損傷、尿嘧啶狀態(tài)核苷酸。該過程一般會(huì)導(dǎo)致90％的dna模板丟失，大量的甲基化信息無法被后續(xù)流程檢測(cè)到。同時(shí)，堿基轉(zhuǎn)化處理時(shí)，存在序列轉(zhuǎn)化不完全或轉(zhuǎn)化過度的情況，從而產(chǎn)生人為偏倚，后續(xù)經(jīng)pcr擴(kuò)增會(huì)進(jìn)一步放大，造成信號(hào)不準(zhǔn)確。因此目前基于重亞硫酸鹽處理獲得的甲基化標(biāo)記普遍存在靈敏度低的問題，尤其是在血液樣本中，原本就數(shù)量有限的游離dna片段經(jīng)重亞硫酸鹽處理之后，檢測(cè)甲基化水平的難度大大增加。

28、雖然可以通過基于重亞硫酸鹽處理，增加甲基化基因數(shù)量的方式來提高對(duì)結(jié)直腸癌的靈敏度，如其中北京艾克倫醫(yī)療科技有限公司的腸癌3基因甲基化聯(lián)合檢測(cè)，于2022年獲國家藥監(jiān)局nmpa批準(zhǔn)。使用血液樣本cfdna經(jīng)重亞硫酸鹽處理臨床試驗(yàn)靈敏度為84.75％(328/387)，但靈敏度仍無法滿足臨床實(shí)際需求。因此嘗試基于非重亞硫酸鹽處理的方法發(fā)現(xiàn)人類血液樣本中結(jié)直腸癌相關(guān)基因甲基化標(biāo)記，并有效檢測(cè)其甲基化水平變化，也成為開展癌癥早期篩查的最迫切需求。

29、本發(fā)明第二方面提供alx4基因特定區(qū)域甲基化水平的檢測(cè)試劑在制備基于以下方法診斷結(jié)直腸癌或預(yù)測(cè)結(jié)直腸癌風(fēng)險(xiǎn)的試劑盒中的應(yīng)用：

30、s1，獲得受試者生物樣本中的cfdna樣本；

31、s2，將cfdna樣本進(jìn)行甲基化區(qū)域富集或進(jìn)行甲基化處理；

32、s3，以步驟s2富集或處理后的產(chǎn)物為模板，利用靶向未處理或處理后的所述特定區(qū)域的引物對(duì)和探針，進(jìn)行qpcr擴(kuò)增；

33、若有典型的擴(kuò)增曲線，并且ct值不大于預(yù)設(shè)閾值，則診斷受試都患有結(jié)直腸癌或者具有患結(jié)直腸癌的風(fēng)險(xiǎn)，

34、所述特定區(qū)域包括chr11:44311452-44311645的至少一部分，優(yōu)選地，所述甲基化區(qū)域包括chr11:44311570-44311644的至少一部分。

35、擴(kuò)增曲線是在聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(pcr)過程中檢測(cè)產(chǎn)物累積的圖形。它是通過監(jiān)測(cè)反應(yīng)溶液中熒光信號(hào)的增加來生成的。以下是一個(gè)典型的pcr擴(kuò)增曲線的特征：

36、初始階段：

37、threshold?cycle(ct)值：在pcr反應(yīng)的早期階段，熒光信號(hào)可能較低，但隨著pcr產(chǎn)物的累積，熒光信號(hào)逐漸增強(qiáng)。ct值是指在pcr反應(yīng)中需要的循環(huán)數(shù)，使得熒光信號(hào)上升到事先設(shè)定的閾值以上。ct值越低，表示目標(biāo)dna在樣本中的起始量越高。

38、指數(shù)增長階段：

39、指數(shù)階段：在pcr反應(yīng)的中期，pcr產(chǎn)物呈指數(shù)級(jí)別的增長。此時(shí)，ct值的增加速度會(huì)加快，反映了pcr反應(yīng)中目標(biāo)dna的指數(shù)級(jí)增長。

40、平臺(tái)階段：

41、平臺(tái)階段：在pcr反應(yīng)的后期，pcr產(chǎn)物的累積達(dá)到飽和，不再呈指數(shù)級(jí)別的增長。這個(gè)階段的pcr擴(kuò)增曲線形成一個(gè)平臺(tái)，ct值的增加變得緩慢。

42、在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，所述預(yù)設(shè)閾值是基于群體非結(jié)直腸癌樣本和/或群體結(jié)直腸癌樣本相同方法得到的ct值的代表值確定的。所述代表值選自平均值、眾數(shù)、中位數(shù)、四分之一分位數(shù)或四分之三分位數(shù)。

43、本發(fā)明第三方面提供一種基于dna免疫沉淀檢測(cè)alx4基因特定區(qū)域甲基化水平診斷結(jié)直腸癌或預(yù)測(cè)結(jié)直腸癌風(fēng)險(xiǎn)的試劑盒，所述甲基化區(qū)域?yàn)閏hr11:44311570-44311644，所述試劑盒包括5-甲基胞嘧啶抗體、靶向所述甲基化區(qū)域的引物對(duì)和探針，所述引物對(duì)如seq?id?no.1和seq?id?no.2所示，所述探針如seq?id?no.3所示。

44、在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，所述診斷為早期診斷，具體地，所述早期為crc?0～i期或ii期。

45、本發(fā)明的有益效果

46、相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明具有以下技術(shù)效果：

47、本發(fā)明提供alx4基因特定區(qū)域甲基化水平作為結(jié)直腸癌早期診斷或預(yù)測(cè)的標(biāo)志物，豐富了本領(lǐng)域技術(shù)人員的選擇。

48、本發(fā)明采用甲基化dna免疫共沉淀技術(shù)對(duì)alx4基因特定區(qū)域的甲基化水平進(jìn)行檢測(cè)，靈敏度高，特異性強(qiáng)，具有非常重要的臨床應(yīng)用價(jià)值。

49、本發(fā)明基于alx4基因甲基化水平，能夠?qū)嶒?yàn)結(jié)直腸癌的早期檢測(cè)，為結(jié)直腸早期篩選提供更多的標(biāo)志物選擇。