本發(fā)明屬于生物催化領域，具體涉及一種提高葡萄糖酸-5-脫氫酶催化制備5-酮基-d-葡萄糖酸的輔酶總轉換數(shù)方法。

背景技術：

1、5-酮基-d-葡萄糖酸(5-keto-d-gluconic?acid，5kga)，分子式為c6h10o7，分子量為194.1g/mol。5kga是2-酮基-d-葡萄糖酸和2-酮基-l-葡萄糖酸的異構體，是葡萄糖酸(ga)脫氫后形成的酮酸類化合物，是制備生物基平臺化合物2，5-呋喃二甲酸(fdca)的重要前體。相對于化學法和發(fā)酵法，5-葡萄糖酸脫氫酶法制備5kga可在溫和條件下進行，無需極端條件，降低了能耗和成本，同時便于簡化產(chǎn)物分離步驟，提高生產(chǎn)效率，具有環(huán)境友好、高選擇性和專一性等特點。但，5-葡萄糖酸脫氫酶在實際使用中同樣存在一些限制。這些限制主要體現(xiàn)在兩個方面：首先，在催化反應時，5-葡萄糖酸脫氫酶傾向于發(fā)生5kga轉化為ga的逆反應。為了抑制這種逆反應，可采用了添加堿土金屬離子(如鈣離子)的方法，通過促進5kga的沉淀，減少逆反應的負面影響(cn?115595339?a)；其次，該酶在催化過程中對輔酶的需求量較大，這往往需要開發(fā)輔酶再生系統(tǒng)，來實現(xiàn)輔酶的回收和重復使用，可以有效減輕輔酶大量消耗的問題。目前，已報道的制備5kga輔酶再生體系是通過羰基還原酶偶聯(lián)(cn109280677?a)，在雙相體系中催化ga和4-氯-乙酰乙酸乙酯(cobe)分別轉化為5kga和(s)-4-氯-3-羥基丁酸乙酯((s)-chbe)，但是兩相體系對于酶傷害嚴重，且羰基還原酶的輔酶再生速率慢，致使體系輔酶總轉換數(shù)低，僅為2075(green?chem.,2023,25,7126)。

2、輔酶利用效率的評判通常采用總轉換數(shù)(ttn：在完全反應過程中每摩爾輔因子形成的產(chǎn)物的摩爾數(shù))來衡量，一般來說，ttn大于1000，酶促氧化還原反應消耗的輔因子相對較低，而ttn大于或等于1×104才具有實際工業(yè)使用價值。因此，提高輔酶的總轉換數(shù)ttn是酶促氧化還原反應應用的重中之重。

3、提高ttn的方法主要就是通過加速輔酶的循環(huán)再生速率，從而降低輔酶的使用量，而加速輔酶的循環(huán)再生速率主要有兩種方式-篩選更高效的輔酶循環(huán)方式以及優(yōu)化輔酶循環(huán)條件。輔酶再生的方法可分為均相催化再生、非均相催化再生兩類，進一步可細分為四類，即酶再生、化學再生、電化學再生以及光催化再生。maid?h等人研究了一種水溶性鐵(iii)卟啉作為人工、仿生的nad(p)h氧化酶，用于通過激活和還原分子氧來原位再生氧化輔酶nad(p)+，其ttn約為100(angew.chem.int.edit.,2011,50(10):2397-2400.)；kim?y?h等人使用氧化錫電極在無需介質的情況下，能夠有效地進行nadh的氧化和nad+的還原反應，其ttn約為100(enzyme?microb.tech.,2009,44(3):129-134.)；brown?ka等人成功開發(fā)了一種光催化再生煙酰胺輔酶nadph的方法，通過量子點-酶生物雜化復合物實現(xiàn)了高效、經(jīng)濟的輔酶再生，為工業(yè)應用中酶的使用提供了新的可能性，其ttn小于40(acs?catal.,2016,6(4):2201-2204.)；wang?x等人實現(xiàn)了使用異質催化劑(pt/al2o3)和氫氣耦合的酶促反應進行nadh的原位再生。該方法具有完全的選擇性、穩(wěn)定性、廢物最小化(僅產(chǎn)生h+作為副產(chǎn)品)、催化劑易于分離和過程可持續(xù)性等優(yōu)點，其ttn約為2(acs?catal.,2016,6(3):1880-1886.)；angelastro?a等人開發(fā)了一種基于谷胱甘肽的nadp+回收系統(tǒng)，該系統(tǒng)利用大腸桿菌的谷胱甘肽還原酶(ecgrx)和釀酒酵母的谷胱甘肽還原酶(scgr)在有氧和無氧條件下實現(xiàn)nadp+的高效回收，其ttn約為5×105(acs?catal.,7(2),1025-1029.)。不同的輔酶循環(huán)再生方法各自有其優(yōu)劣，而基于成本、應用范圍等多方面工業(yè)實際因素考慮，目前真正具有價值主要是酶再生，而均相催化再生體系往往在再生速率方面更有前景。

4、均相催化再生體系中重要的是輔酶再生催化劑。橋聯(lián)黃素作為一種綠色催化劑，能夠在水相利用氧氣將還原型輔酶nad(p)h氧化為氧化型nad(p)+，實現(xiàn)輔酶再生，已經(jīng)在酶促氧化還原反應中得以應用。zhang等人提出了一種利用合成橋聯(lián)黃素與馬肝醇脫氫酶(hladh)結合的新系統(tǒng)，用于從二醇合成內(nèi)酯，該系統(tǒng)在溫和條件下高效合成內(nèi)酯，包括手性內(nèi)酯(bioresources?and?bioprocessing,2021,8:1-9.)；朱晨杰等人發(fā)明利用橋聯(lián)黃素作為細胞內(nèi)nad(p)+再生催化劑，與細胞內(nèi)依賴nad(p)+的氧化還原酶催化的氧化反應偶聯(lián)，形成細胞內(nèi)的nad(p)+再生循環(huán)體系(cn?108823258?b)。但，當前普遍關注的是橋聯(lián)黃素在多種酶促氧化還原反應中的應用，卻忽略了反應ph值對橋聯(lián)黃素活性會產(chǎn)生重大影響，導致已報道的酶促偶聯(lián)反應輔酶總轉換數(shù)(ttn)不高(小于或等于100)。因此，盡管橋聯(lián)黃素具有輔酶再生活性，但往往因為其輔酶總轉換數(shù)(ttn)低而無法具備應用價值。

5、葡萄糖酸-5-脫氫酶催化制備5-酮基-d-葡萄糖酸是典型的酶促氧化反應，已知構建的輔酶nadp+再生體系往往ttn過低，無法滿足工業(yè)應用需求。在這里，構建出一個高效制備5-酮基-d-葡萄糖酸，同時顯著提升輔酶再生速率，大幅降低nadp+用量，進而提高輔酶總轉換數(shù)(ttn)的酶-化學偶聯(lián)再生體系至關重要，該體系的建立將賦予酶法制備5-酮基-d-葡萄糖酸工業(yè)應用價值。

技術實現(xiàn)思路

1、為了解決上述葡萄糖酸-5-脫氫酶輔酶循環(huán)體系的輔酶再生速率慢、輔酶總轉換數(shù)(ttn)較低等問題，本發(fā)明提供一種提高葡萄糖酸-5-脫氫酶催化制備5-酮基-d-葡萄糖酸的輔酶總轉換數(shù)方法。

2、本發(fā)明通過添加橋聯(lián)黃素和調控反應ph值，構建高效的、單一水相、酶-化學偶聯(lián)nad(p)+循環(huán)再生體系，提高輔酶再生速率，降低輔酶nadp+用量，提高輔酶總轉換數(shù)(ttn)，實現(xiàn)5-酮基-d-葡萄糖酸的高效酶法制備。

3、本發(fā)明的具體方案為：

4、一種提高葡萄糖酸-5-脫氫酶催化制備5-酮基-d-葡萄糖酸的輔酶總轉換數(shù)方法，通過添加輔酶再生劑x和調控反應ph值，構建高效的酶-化學偶聯(lián)nad(p)+循環(huán)再生體系，將葡萄糖酸酶促氧化制備5-酮基葡萄糖酸。

5、葡萄糖酸-5-脫氫酶在nad(p)+存在下可以催化d-葡萄糖酸(ga)或其鹽為5kga，并生成nad(p)h，但同時，葡萄糖酸-5-脫氫酶自身的可逆反應特性也會在nad(p)h存在下將5kga轉化為ga或其鹽造成酶促氧化效率低下。在體系中加入輔酶再生劑x之后，會利用輔助底物a迅速氧化nad(p)h為nad(p)+，生成副產(chǎn)物b，由于消除了體系中的nad(p)h，從而阻斷逆反應，實現(xiàn)輔酶原位再生及ga完全轉化為5kga，反應原理如下式所示：

6、

7、本發(fā)明中所述的d-葡萄糖酸或其鹽的脫氫、輔因子的原位再生反應及副產(chǎn)物b的生成在反應體系中同步進行。

8、本發(fā)明中所述的反應ph值范圍為5-8，優(yōu)選6-7。

9、本發(fā)明中所述的輔酶再生劑x可以是橋聯(lián)黃素或木糖還原酶或羰酰還原酶或是其他能夠做到nad(p)+再生的酶或輔酶再生劑。

10、本發(fā)明中橋聯(lián)黃素優(yōu)選為7-三氟甲基-1，10-乙撐基異咯嗪氯化鹽。

11、本發(fā)明中所述的葡萄糖酸-5-脫氫酶由含有葡萄糖酸脫氫酶基因的重組菌所表達，所述的葡萄糖酸-5-脫氫酶基因來源于gluconobacter?oxydans(氧化葡萄糖酸桿菌)，或gluconobacter?suboxydans(弱氧化葡糖桿菌)，或acetobacter?pasteurianus(巴氏醋桿菌)，或acetobacter?ascendens(攀膜醋桿菌)，或streptococcus?suis(豬鏈球菌)，或klebsiellasp(克雷伯氏菌)，或penicilliumchrysogenum(產(chǎn)黃青霉)等其他含有葡萄糖酸脫氫酶的菌種，所述的葡萄糖酸脫氫酶由含有該基因的重組菌(e.colibl21(de3))所表達，表達載體選用但不限于pet-28a(+)。葡萄糖酸-5-脫氫酶用量為5-50u//ml。

12、本發(fā)明中所述的催化體系主要為水相，其中水相可為水、0.05mol/l的tris-鹽酸緩沖液、甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液、0.05mol/l的磷酸氫二鈉-磷酸二氫鉀緩沖液、0.05mol/l的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液或0.1mmol/l的巴比妥鈉-鹽酸緩沖液等中的任意一種。

13、本發(fā)明中所述的輔酶為nad+或nadp+。

14、本發(fā)明中所述的輔助底物a，可以為o2或木糖或4-氯-3-乙酰乙酸乙酯其他有機或無機物質。

15、本發(fā)明中所述的副產(chǎn)物b，可以為h2o2或木糖醇或4-氯-3-羥基丁酸乙酯其他有機或無機物質。副產(chǎn)物可以通過添加過氧化氫酶或其他物質與手段進行消除或分離。

16、本發(fā)明中所述的d-葡萄糖酸，可以為d-葡萄糖酸或為d-葡萄糖酸鹽，d-葡萄糖酸鹽可以為d-葡萄糖酸金屬鹽、d-葡萄糖酸堿性氨基酸鹽和d-葡萄糖酸銨鹽中的任意一種或幾種的組合，葡萄糖酸及其鹽的濃度范圍為1.0-210

17、g/l。

18、本發(fā)明中所述的輔酶總轉換數(shù)為500-905000。

19、一種提高葡萄糖酸-5-脫氫酶催化制備5-酮基-d-葡萄糖酸的輔酶總轉換數(shù)的方法，在葡萄糖酸-5-脫氫酶催化制備5-酮基-d-葡萄糖酸及其鹽的反應中，添加橋聯(lián)黃素和過氧化氫酶作為輔酶再生劑，調控反應ph值控制在5-8，提高輔酶的再生速率和輔酶總轉換數(shù)。

20、所述反應ph值優(yōu)選為6-7。

21、所述的橋聯(lián)黃素為7-三氟甲基-1，10-乙撐基異咯嗪氯化鹽，添加量為0.5-10mmol/l。

22、所述過氧化氫酶的用量為10-100u/ml。

23、本發(fā)明中催化反應體系組成為：1.0-210g/l葡萄糖酸鹽、10-100u/ml過氧化氫酶、5-50u/ml的葡萄糖酸-5-脫氫酶、0.5-10mmol/l的橋聯(lián)黃素和5×10-5-4mmol/l的nad(p)+。

24、所述的輔酶為氧化型輔酶nad+或nadp+；其中，氧化型輔酶nad+或nadp+的使用范圍為5×10-5-4mmol/l。

25、本發(fā)明反應條件為：反應溫度25-40℃、攪拌轉速100-300rpm、反應時間1-48h。

26、進一步優(yōu)選地，催化反應體系組成為：10-40g/l葡萄糖酸鹽、50-100u/ml過氧化氫酶、10-20u/ml的葡萄糖酸-5-脫氫酶、4-8mmol/l的橋聯(lián)黃素和5×10-5–0.5mmol/l的nad(p)+。

27、反應條件為：反應溫度25-35℃、攪拌轉速200-250rpm、反應時間2-12h。

28、進一步優(yōu)選地，nadp+添加量為5×10-5–0.01mmol/l，偶聯(lián)反應的ph值范圍優(yōu)選為6-7。

29、輔酶nadp(h)的總轉換數(shù)低是酶促氧化還原反應實際應用中存在的重要限制。本發(fā)明通過添加橋聯(lián)黃素和調控ph來提高葡萄糖酸-5-脫氫酶催化氧化制備5-酮基-d-葡萄糖酸體系中輔酶nadp+的總轉換數(shù)方法。橋聯(lián)黃素的添加和反應ph的調控不僅實現(xiàn)了輔酶nadp+的快速再生，而且阻斷了葡萄糖酸-5-脫氫酶的逆向還原，顯著改善了輔酶nadp+的總轉換數(shù)。本發(fā)明構建的橋聯(lián)黃素-酶偶聯(lián)體系的輔酶nadp+添加量低、再生速率快、總轉換數(shù)可高達9×105，用于酶促氧化葡萄糖酸制備5-酮基-d-葡萄糖酸極具工業(yè)價值。

30、與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明具有如下優(yōu)勢：

31、(1)、本發(fā)明所述的技術方案采用酶-化學偶聯(lián)催化制備5kga，ttn高，成本低，效率高，能耗低。

32、(2)、本發(fā)明構建的nad(p)+循環(huán)體系，不但能實現(xiàn)nad(p)+快速原位再生，且無需添加堿土金屬離子沉淀產(chǎn)物，葡萄糖酸轉化率便能達99％以上，副產(chǎn)物影響低，產(chǎn)物分離簡單。

33、(3)、本發(fā)明所述的技術方案過程簡單，脫氫酶短時間內(nèi)不易損失活性，偶聯(lián)催化體系中輔酶可多次循環(huán)使用，反應體系更為貼合實際工業(yè)實用。