本發(fā)明涉及分析化學，具體涉及一種同時測定7種脂溶性維生素類化合物的方法。
背景技術(shù)：
1、維生素a(va)是人體必需的營養(yǎng)素，對正常的視力、牙齒和骨骼的形成發(fā)揮重要作用。攝入量不足會導致干眼癥、失明、發(fā)育遲緩等。攝入過量也會對嬰兒和成人造成傷害。維生素a以多種異構(gòu)體和酯的形式存在。嬰兒和成人營養(yǎng)品可添加視黃醇棕櫚酸酯或視黃醇酯，主要以全反式異構(gòu)體形式存在。由于維生素a側(cè)鏈含四個雙鍵，因此存在全反式、13-順式、11-順式、9-順式及9,13-順式等多種異構(gòu)體。其中全反式va的生物活性最高，13-順式異構(gòu)體相對活性為75％；其他異構(gòu)體的va活性更低。另在光熱條件下，全反式va也會異構(gòu)化成其他形式異構(gòu)體。
2、維生素e也是人體尤其是嬰幼兒成長發(fā)育所必須的營養(yǎng)素，主要作為抗氧化劑，保護很多生化物免遭活性氧或自由基的損害，尤其在保護細胞膜中發(fā)揮重要作用。因母環(huán)的甲基取代(α,β,γ,δ-生育酚，α,β,γ,δ-ve)及側(cè)鏈飽和(α,β,γ,δ-生育三烯酚，α,β,γ,δ-te)的不同，ve共有8種活性形式，在食品科學中，通常只考慮α-生育酚，因為它是活性最強、含量最高的活性形式。
3、現(xiàn)行國標gb5009.82-2016的第一法關(guān)于維生素ae的反相高效液相色譜法主要采用c30作為色譜柱，同時完成總視黃醇和α,β,γ和δ等四種生育酚的測定。gb?10765-2021嬰兒配方食品、gb?10766-2021較大嬰兒配方食品中規(guī)定維生素a的允許使用量需折算成視黃醇當量(re)，維生素e的允許使用量需折算成α生育酚當量(te)。然而目前與之配套的現(xiàn)行標準方法(gb5009.82-2016)還不能分離檢測維生素a的異構(gòu)體。同時標準方法所采用的樣品預(yù)處理需要經(jīng)過皂化、液-液萃取、洗滌、濃縮、復溶等多個步驟，過程繁瑣又耗時，且復雜的操作步驟也易造成試樣中被測維生素的降解和損失，影響結(jié)果的準確性和穩(wěn)定性。在線固相萃取(online?spe)方法允許樣品皂化溶液直接上機分析，可大大簡化樣品分析流程，提升分析效率，是一種綠色、高效的分析方法。目前基于online?spe-lc的建立的分析方法僅能完成va總量和ve的測定，還不能兼顧va順反異構(gòu)體的分離。
技術(shù)實現(xiàn)思路
1、本發(fā)明的目的是為了克服現(xiàn)有技術(shù)存在的不能同時測定全反式維生素a及其異構(gòu)體13-順式維生素a，以及檢測步驟復雜和檢測成本高、分析效率低等問題，提供一種同時測定7種脂溶性維生素類化合物的方法。
2、為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供一種同時測定7種脂溶性維生素化合物的方法，該方法包括如下步驟：
3、0-4.5min，上樣、除雜及富集過程：上樣泵將自動進樣器的樣品溶液轉(zhuǎn)移至在線固相萃取柱中，利用初始流動相清洗并去除基質(zhì)干擾成分；同時分析泵通過切換閥與液相色譜分析柱連通進行平衡；
4、4.5-6.5min，目標物轉(zhuǎn)移過程：調(diào)整切換閥的連接狀態(tài)，將所述在線固相萃取柱的兩端分別與液相色譜的分析柱和分析泵連通，分析泵的流動相將分析物從固相萃取柱反向沖洗并轉(zhuǎn)移至液相色譜的分析柱內(nèi)；
5、6.5-42min，分析柱的分析及在線固相萃取柱的沖洗和平衡過程：調(diào)整切換閥至0-4.5min時的連接狀態(tài)，上樣泵沖洗和平衡固相萃取柱，分析泵配合液相色譜的分析柱完成分析物的分離和分析；
6、其中，所述在線固相萃取柱的填料為聚乙烯吡咯烷酮或聚苯乙烯-二乙烯苯，所述分析柱為硅膠基質(zhì)的極性基團嵌入型的反相色譜柱。
7、優(yōu)選地，上樣泵的流動相條件包括：流動相a為水，流動相b為甲醇，流動相c為乙腈，流動相d為甲基叔丁基醚；0-4.5min為50％的流動相a和50％的流動相b；4.5-5min流動相b增加為100％同時流動相a降低至0；5-10min流動相c增加至100％同時流動相b降低至0；10-20min為100％的流動相c；20-25min流動相c降低至80％同時流動相d增加至20％；25-30min為80％的流動相c和20％的流動相d；30-35min流動相c增加至100％同時流動相d降低至0；35-36min流動相c降低至0同時流動相a和流動相b均增加至50％；36-42min為50％的流動相a和50％的流動相b。
8、優(yōu)選地，上樣泵的流動相的流速為0.2-4ml/min。
9、優(yōu)選地，分析泵的流動相條件包括：流動相a為水，流動相b為甲醇，流動相c為乙腈；0-6.5min為20％的水和80％的乙腈；6.5-7min流動相a降低至10％、流動相b增加至90％同時流動相c降低至0；7-8min為10％的流動相a和90％的流動相b；8-36min流動相a降低至4％同時流動相b增加至96％；36-37min流動相a降低至0同時流動相b增加至100％，37-42min為100％流動相b。
10、優(yōu)選地，分析柱的柱溫為20-45℃。
11、優(yōu)選地，分析泵的流動相的流速為0.5-2ml/min。
12、優(yōu)選地，液相色譜的檢測器為紫外檢測器或紫外檢測器與熒光檢測器串聯(lián)使用。
13、優(yōu)選地，紫外檢測器的檢測條件包括：0-16min，檢測波長為325nm；16-26.5min，檢測波長為294nm；26.5-29min，檢測波長為264nm；29-42min，檢測波長為294nm。
14、優(yōu)選地，熒光檢測器的檢測條件包括：激發(fā)波長為294nm，發(fā)射波長為328nm。
15、優(yōu)選地，在線固相萃取柱的柱長為5-100mm；
16、優(yōu)選地，在線固相萃取柱的內(nèi)徑為2.1-4.6mm；
17、優(yōu)選地，在線固相萃取柱的填料的粒徑為5-50μm。
18、優(yōu)選地，所述分析柱的柱長為50-600mm；
19、優(yōu)選地，分析柱的內(nèi)徑為2.1-4.6mm。
20、優(yōu)選地，7種脂溶性維生素類化合物為13-順式維生素a、全反式維生素a、α-生育酚、β-生育酚、γ生育酚、δ生育酚和α-生育三烯酚；
21、優(yōu)選地，13-順式維生素a與全反式維生素a的分離度＞2.6；β-生育酚與γ-生育酚的分離度＞1.5。
22、本發(fā)明建立了基于在線固相萃取和高效液相色譜法同時測定7種脂溶性維生素類化合物的方法，該方法操作簡單、自動化程度高。該方法可以直接將皂化液上機分析，42min內(nèi)可完成對7個目標化合物的分離與檢測。
1.一種同時測定7種脂溶性維生素類化合物的方法，其特征在于，該方法包括如下步驟：
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，上樣泵的流動相條件包括：流動相a為水，流動相b為甲醇，流動相c為乙腈，流動相d為甲基叔丁基醚；0-4.5min為50％的流動相a和50％的流動相b；4.5-5min流動相b增加為100％同時流動相a降低至0；5-10min流動相c增加至100％同時流動相b降低至0；10-20min為100％的流動相c；20-25min流動相c降低至80％同時流動相d增加至20％；25-30min為80％的流動相c和20％的流動相d；30-35min流動相c增加至100％同時流動相d降低至0；35-36min流動相c降低至0同時流動相a和流動相b均增加至50％；36-42min為50％的流動相a和50％的流動相b。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于，上樣泵的流動相的流速為0.2-4ml/min。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于，分析泵的流動相條件包括：流動相a為水，流動相b為甲醇，流動相c為乙腈；0-6.5min為20％的水和80％的乙腈；6.5-7min流動相a降低至10％、流動相b增加至90％同時流動相c降低至0；7-8min為10％的流動相a和90％的流動相b；8-36min流動相a降低至4％同時流動相b增加至96％；36-37min流動相a降低至0同時流動相b增加至100％，37-42min為100％流動相b。
5.根據(jù)權(quán)利要求1或4所述的方法，其特征在于，分析柱的柱溫為20-45℃。
6.根據(jù)權(quán)利要求1或4所述的方法，其特征在于，分析泵的流動相的流速為0.5-2ml/min。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，液相色譜的檢測器為紫外檢測器或紫外檢測器與熒光檢測器串聯(lián)使用；
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，在線固相萃取柱的柱長為5-100mm；
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，所述分析柱的柱長為50-600mm；
10.根據(jù)權(quán)利要求1-9中所述的方法，7種脂溶性維生素類化合物為13-順式維生素a、全反式維生素a、α-生育酚、β-生育酚、γ生育酚、δ生育酚和α-生育三烯酚；