本發(fā)明屬于生物，具體涉及一種caix靶向降解劑，還涉及該caix靶向降解劑的制備方法，和在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、癌癥是目前主要的健康問(wèn)題之一，缺氧和酸性微環(huán)境是實(shí)體瘤的典型特征，二者會(huì)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、血管生成和轉(zhuǎn)移、糖酵解代謝等過(guò)程，還會(huì)對(duì)基因和蛋白質(zhì)的表達(dá)產(chǎn)生負(fù)向影響。除此之外，缺氧和酸性微環(huán)境在腫瘤學(xué)中被公認(rèn)為是導(dǎo)致治療耐藥性和預(yù)后不良的關(guān)鍵因素。缺氧和低ph所造成的生物還原環(huán)境會(huì)影響大多數(shù)化療藥物的穩(wěn)定性、穿透性和生物過(guò)程，從而降低其抗癌效果。因此，調(diào)控腫瘤缺氧和酸性微環(huán)境可能會(huì)改善抗癌藥物的療效，在癌癥治療中具有深遠(yuǎn)的臨床意義。

2、碳酸酐酶ix(caix/ca9)是一種在發(fā)展和侵襲性腫瘤中過(guò)表達(dá)的跨膜蛋白，僅與低氧性腫瘤相關(guān)，其表達(dá)受缺氧誘導(dǎo)因子(hif-1a)的缺氧依賴性調(diào)控，通常被認(rèn)為是預(yù)后不良的指標(biāo)。此外，caix可以催化二氧化碳水合物轉(zhuǎn)變?yōu)樘妓釟潲}和質(zhì)子，從而參與缺氧實(shí)體瘤的ph調(diào)節(jié)。caix在促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移的過(guò)程中發(fā)揮了重要的作用，是具有研究意義的治療靶點(diǎn)。因此，抑制caix可有效改善缺氧和酸性微環(huán)境的特征，為臨床治療實(shí)體瘤提供更有效的手段。

3、由于各種癌癥的發(fā)展、血管生成、轉(zhuǎn)移和耐藥特性等過(guò)程都與caix的異常活性直接或間接性相關(guān)，因此caix已成為一個(gè)有前途的藥物靶點(diǎn)，抑制caix酶的活性能夠改善缺氧和酸性微環(huán)境，為臨床治療實(shí)體瘤提供更有效的手段。但是，目前缺乏能夠特異性靶向降解caix的化合物，這一部分研究?jī)?nèi)容在癌癥治療的臨床評(píng)估上存在一定的空缺。

4、目前，針對(duì)抑制caix主要有兩種策略：?jiǎn)慰寺】贵w和caix小分子抑制劑。第一種單克隆抗體的治療策略是利用具有誘導(dǎo)細(xì)胞毒性的特異性抗體的caix介導(dǎo)的免疫療法抑制caix，從而在臨床治療癌癥。其中，用于治療轉(zhuǎn)移性腎細(xì)胞癌的為靶向caix的嵌合式單克隆抗體抗體girentuximab，但是，在iii期臨床研究ariser中的輔助治療對(duì)腎切除術(shù)后復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)高的rcc患者的藥物相關(guān)不良反應(yīng)達(dá)到21.6％，未達(dá)到預(yù)期的臨床獲益。

5、第二種caix小分子抑制劑策略是基于caix的催化活性對(duì)腫瘤細(xì)胞的存活和侵襲性至關(guān)重要這一理論依據(jù)。然而，僅減少caix表達(dá)細(xì)胞或抑制caix不足以有良好的治療反應(yīng)，因?yàn)槟[瘤存在異質(zhì)性并且藥物靶點(diǎn)具有分期特異性差異表達(dá)的特征。設(shè)計(jì)ca抑制劑主要存在的問(wèn)題是ca異構(gòu)體活性位點(diǎn)的相似結(jié)構(gòu)會(huì)干擾小分子的選擇性，導(dǎo)致現(xiàn)有技術(shù)中caix小分子抑制劑的腫瘤特異性低，對(duì)正常細(xì)胞會(huì)造成損害。因此，迫切需要開(kāi)發(fā)特異性高的靶向降解caix的小分子化合物。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的在于提供一種cai?x靶向降解劑，解決了現(xiàn)有caix降解劑容易產(chǎn)生抗藥性和腫瘤特異性低的不足。

2、為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案：

3、一種caix靶向降解劑，包括caix靶蛋白配體、整合素配體和連接體；所述caix靶蛋白配體和所述整合素配體過(guò)所述連接體連接。

4、本發(fā)明，caix靶向降解劑中連接體將特異性識(shí)別碳酸酐酶ix的配體和特異性結(jié)合整合素受體的配體連接在一起。由于碳酸酐酶ix在腫瘤所在區(qū)域富集，使得caix靶向降解劑能夠特異性地靶向腫瘤區(qū)域；整合素作為一種能夠連接細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外基質(zhì)(ecm)的異源二聚體跨膜蛋白受體，表達(dá)于細(xì)胞表面，主要在哺乳動(dòng)物中充當(dāng)信號(hào)蛋白，且廣泛表達(dá)于多種腫瘤細(xì)胞表面，整合素與其配體結(jié)合，能形成受體-配體介導(dǎo)傳遞系統(tǒng)，從而將分泌蛋白或膜蛋白引導(dǎo)到溶酶體進(jìn)行降解。因此本發(fā)明caix靶向降解劑是一種新的caix降解劑，可以有效降解腫瘤細(xì)胞上高表達(dá)的caix和整合素。該降解劑可有效誘導(dǎo)caix降解，在缺氧條件下抑制腫瘤細(xì)胞的存活，具有靶向腫瘤區(qū)域以及利用整合素和溶酶體降解碳酸酐酶ix的功能，進(jìn)而改變腫瘤患者內(nèi)環(huán)境的缺氧和微酸性環(huán)境，起到抑制缺氧腫瘤細(xì)胞存活的作用。其腫瘤靶向性高，對(duì)正常細(xì)胞的毒副作用較小，可使用較小劑量以獲得較佳的效果。

5、本發(fā)明中，所述cai?x靶蛋白配體具有磺胺基團(tuán)。具有磺胺基團(tuán)的配體，磺胺基團(tuán)可以靶向ca活性中心的zn2+，形成配位鍵，干擾碳酸酐酶的功能。

6、進(jìn)一步地，所述caix靶蛋白配體為4-[[5-(氨基磺酰基)-1，3，4-噻二唑]氨基]-4-氧丁酸。

7、本發(fā)明中，所述整合素配體包括rgd序列的多肽、環(huán)狀rgd序列、包含rgd的環(huán)五肽序列、環(huán)肽cilengitide序列、包含rgd序列的抗體、以及包含rgd序列的蛋白之中的一種或多種。

8、優(yōu)選地，所述整合素配體為環(huán)狀rgd序列。rgd特異性識(shí)別的整合素αvβ3受體在腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)，且特異性結(jié)合的caix在侵襲性強(qiáng)的腫瘤細(xì)胞而非正常組織中高表達(dá)，具有腫瘤細(xì)胞高選擇性。環(huán)狀rgd序列使得降解劑將整個(gè)致病蛋白經(jīng)溶酶體降解，能夠克服腫瘤的耐藥性，從而減少藥物的用量，避免了因高劑量引起的脫靶效應(yīng)，使其具有低毒性和高安全性。相比于上述其他針對(duì)整合素αvβ3的抗體和蛋白，含有rgd(arg-gly-asp)序列的環(huán)狀小分子還具有以下優(yōu)點(diǎn)：1.分子量小、體積小、合成簡(jiǎn)單；2.穩(wěn)定性高、親水性好；3.更容易與熒光標(biāo)記，螯合劑或載體偶聯(lián)。

9、本發(fā)明中，所述連接體的結(jié)構(gòu)包括含芳香環(huán)、雜環(huán)、雜原子和官能團(tuán)中的一種或多種的烷基鏈。

10、進(jìn)一步地，所述連接體結(jié)構(gòu)式如下：

11、

12、進(jìn)一步地，所述連接體結(jié)構(gòu)式如下：

13、此連接結(jié)構(gòu)為最優(yōu)的連接體結(jié)構(gòu)，在caix靶向降解劑低濃度時(shí)仍然保持較好的降解caix的功能。

14、一種caix靶向降解劑的制備方法，包括以下步驟：

15、s1、反應(yīng)瓶中依次加入boc-6-氨基己酸、dcc和n-羥基琥珀酰亞胺，用無(wú)水n,n-二甲基甲酰胺攪拌溶解，室溫反應(yīng)，向溶液中加入3-疊氮基丙胺和diea，室溫?cái)嚢瑁蛛x純化，干燥后得到白色粉末boc-l1-azide；

16、s2、將所述白色粉末boc-l1-azide在冰浴條件下溶于tfa/dcm中，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)，減壓蒸發(fā)溶劑，得到脫除boc保護(hù)基的胺粗品；

17、s3、將所述胺粗品、4-[[5-(氨基磺?；?-1，3，4-噻二唑]氨基]-4-氧丁酸和diea溶于無(wú)水dmf中，加入hatu，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)液，分離純化，干燥后得到sul-l1-azide；

18、s4、將sul-l1-azide、alkyne-crgd、cuso4·5h2o和navc溶解在dmf/h2o，反應(yīng)，分離純化，得到caix靶向降解劑(sul-l1-rgd)。

19、此降解劑的制備方法工藝簡(jiǎn)單、且產(chǎn)率高，有利于企業(yè)的生產(chǎn)。利用上述制備方法合成了具有降解碳酸酐酶ix功能和整合素αvβ3受體功能的降解劑sul-linker-rgd，它作為一種新型的碳酸酐酶ix降解劑，為基于缺氧和酸性微環(huán)境的實(shí)體腫瘤的治療提供了一種新的策略，在癌癥治療藥物中具有很大的應(yīng)用潛力。

20、進(jìn)一步地，在步驟s1中boc-6-氨基己酸、dcc和n-羥基琥珀酰亞胺的質(zhì)量比例為2：1：1-1：2：2。

21、進(jìn)一步地，在步驟s2中室溫反應(yīng)的時(shí)間為1-3小時(shí)。

22、進(jìn)一步地，在步驟s2中tfa/dcm的濃度范圍為10-30％。

23、進(jìn)一步地，在步驟s3中4-[[5-(氨基磺?；?-1，3，4-噻二唑]氨基]-4-氧丁酸和diea的質(zhì)量比例為1:5-1:20。

24、進(jìn)一步地，在步驟s3中diea和無(wú)水dmf的質(zhì)量比例為1:10-1:5。

25、一種caix靶向降解劑在制備腫瘤疫苗或抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。該caix靶向降解劑能夠高特異性地靶向腫瘤區(qū)域，并同步降解腫瘤患者體內(nèi)的碳酸酐酶ix和整合素，從而改變腫瘤患者內(nèi)環(huán)境的缺氧和微酸性環(huán)境，起到抑制缺氧腫瘤細(xì)胞存活的作用。

26、進(jìn)一步地，所述腫瘤包括乳腺癌或結(jié)腸癌。

27、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是：

28、(1)本發(fā)明caix靶向降解劑，是一種雙功能分子降解劑，具有特異性識(shí)別caix的配體和能與整合素受體特異性結(jié)合的配體，兩者通過(guò)連接體連接，能夠有效降解腫瘤細(xì)胞表面上高表達(dá)的caix和整合素αvβ3受體。整合素αvβ3受體在腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)，caix在侵襲性強(qiáng)的腫瘤細(xì)胞而非正常組織中高表達(dá)，該降解劑具有腫瘤細(xì)胞高選擇性，特異性強(qiáng)。

29、(2)本發(fā)明caix靶向降解劑在缺氧條件下可有效誘導(dǎo)碳酸酐酶ix和整合素αvβ3受體降解，抑制腫瘤細(xì)胞的存活，將整個(gè)致病蛋白經(jīng)溶酶體降解，從而克服腫瘤耐藥性；以此可改善實(shí)體腫瘤中特有的缺氧和酸性微環(huán)境，從而在治療癌癥中發(fā)揮一定作用。

30、(3)本發(fā)明降解劑特異性結(jié)合的碳酸酐酶ix在侵襲性強(qiáng)的腫瘤細(xì)胞而非正常組織中高表達(dá)，具有腫瘤細(xì)胞高選擇性，從而減少caix靶向降解劑的用量，避免了因高劑量引起的脫靶效應(yīng)，使其具有低毒性和高安全性，為治療或預(yù)防各種癌癥提供新的方案。