本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，特別是針對(duì)一種基于誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的質(zhì)粒消除模塊。
背景技術(shù)：
1、游離型質(zhì)粒是動(dòng)植物、微生物細(xì)胞遺傳操作的通用平臺(tái)，可用于基因組編輯、異源蛋白表達(dá)、基因電路搭建等目的。但當(dāng)使用基因組編輯或基因電路質(zhì)粒實(shí)現(xiàn)基因組編輯或基因電路設(shè)計(jì)目的后，搭載在質(zhì)粒上的基因組編輯工具或基因電路就成了細(xì)胞基因組的不穩(wěn)定因素，此時(shí)需要對(duì)質(zhì)粒進(jìn)行消除，以獲得無質(zhì)粒細(xì)胞。現(xiàn)行的質(zhì)粒消除技術(shù)主要分為3種，分別是溫敏復(fù)制子質(zhì)粒消除、sacb質(zhì)粒消除以及crispr蛋白相關(guān)質(zhì)粒消除技術(shù)。
2、溫敏復(fù)制子質(zhì)粒消除效率偏低，常用于低拷貝質(zhì)粒消除，對(duì)于中高拷貝質(zhì)粒消除效果不佳。且同個(gè)細(xì)胞內(nèi)同種復(fù)制子一般只能同時(shí)服務(wù)一種質(zhì)粒，若用溫敏復(fù)制子服務(wù)多種質(zhì)粒則可能加劇質(zhì)粒的自發(fā)丟失，不利于相關(guān)實(shí)驗(yàn)或生產(chǎn)工作的開展。
3、基于sacb基因質(zhì)粒消除能同時(shí)服務(wù)于多個(gè)質(zhì)粒，但當(dāng)多種質(zhì)粒存在細(xì)胞內(nèi)時(shí)，基于sacb基因的質(zhì)粒消除方法無法準(zhǔn)確的消除特定種類的質(zhì)粒，且其對(duì)突變的耐受能力較弱，容易出現(xiàn)失效的情況。
4、基于crispr蛋白的質(zhì)粒消除技術(shù)能夠同時(shí)消除多種質(zhì)粒，并自由選擇需要消除的質(zhì)粒種類，但存在crispr蛋白基因突變失效或crispr蛋白切割脫靶的風(fēng)險(xiǎn)，且crispr相關(guān)蛋白元件基因序列較長，不利于在難以轉(zhuǎn)入大質(zhì)粒的底盤微生物中使用。當(dāng)?shù)妆P細(xì)胞內(nèi)無天然crispr蛋白可利用時(shí)，需要額外的轉(zhuǎn)入帶有crispr蛋白的質(zhì)粒，而帶crispr蛋白的質(zhì)粒自靶向消除失敗率較高。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
1、本發(fā)明提出了一種基于反義rna的質(zhì)粒消除技術(shù)，設(shè)計(jì)了質(zhì)粒消除模塊，該模塊能促進(jìn)細(xì)胞中游離型質(zhì)粒發(fā)生丟失，能高效實(shí)現(xiàn)多種游離型質(zhì)粒的選擇消除或同步消除，能應(yīng)用于真核、原核細(xì)胞中的不同種類(拷貝數(shù))游離型質(zhì)粒的選擇消除或同步消除，對(duì)于序列突變的耐受性優(yōu)于基于crispr蛋白的質(zhì)粒消除技術(shù)。相關(guān)蛋白元件基因序列長度小于crispr，對(duì)于難以轉(zhuǎn)入大質(zhì)粒的底盤細(xì)胞依然適用。
2、針對(duì)代謝關(guān)鍵基因設(shè)計(jì)的反義rna，可以降低該代謝關(guān)鍵基因的表達(dá)，從而影響細(xì)胞生長速率。在細(xì)胞擴(kuò)增和傳代時(shí)，質(zhì)粒隨機(jī)分配到子代，含有這種消除模塊的質(zhì)粒的子代細(xì)胞數(shù)量會(huì)越來越少，不含有該消除模塊的質(zhì)粒的子代細(xì)胞因生長迅速會(huì)變得越來越多，從而達(dá)到富集無質(zhì)粒細(xì)胞實(shí)現(xiàn)質(zhì)粒消除的目的。
3、本發(fā)明設(shè)計(jì)的質(zhì)粒消除模塊，除反義rna表達(dá)區(qū)域須部署在待消除質(zhì)粒上以外，其余區(qū)域部署于待消除質(zhì)粒所在的細(xì)胞內(nèi)即可。完成部署后，本發(fā)明設(shè)計(jì)的質(zhì)粒消除模塊可在部署范圍內(nèi)高效的實(shí)現(xiàn)質(zhì)粒消除。
4、本發(fā)明的意義在于提出了一種便捷可用、可編程、適應(yīng)性廣、穩(wěn)定性強(qiáng)、所需序列較短的通用的質(zhì)粒消除模塊構(gòu)建思路，在滿足前置條件的情況下，該質(zhì)粒消除模塊可用于基因工程菌構(gòu)建后的構(gòu)建質(zhì)粒消除、人工構(gòu)建的質(zhì)粒消除。
5、為了實(shí)現(xiàn)上述目標(biāo)，本發(fā)明采用如下的技術(shù)方案：
6、根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，一種基于誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的質(zhì)粒消除模塊，包括兩類相互獨(dú)立的表達(dá)區(qū)域，其中一類區(qū)域?yàn)檎T導(dǎo)因子轉(zhuǎn)錄區(qū)域，由誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子片段自帶的組成型啟動(dòng)子(包括rna聚合酶結(jié)合位點(diǎn)及轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn))、核糖體結(jié)合位點(diǎn)(rbs)、誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子翻譯區(qū)、終止子構(gòu)成；另一類區(qū)域?yàn)榉戳xrna表達(dá)區(qū)域，包括與誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子相對(duì)應(yīng)的誘導(dǎo)因子啟動(dòng)子、反義rna及終止子構(gòu)成；所述反義rna為代謝關(guān)鍵基因mrna的反義rna，能與代謝關(guān)鍵基因mrna結(jié)合阻礙代謝關(guān)鍵基因mrna翻譯。
7、根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述的誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子為阿拉伯糖轉(zhuǎn)錄因子。
8、根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述的誘導(dǎo)因子啟動(dòng)子為阿拉伯糖啟動(dòng)子。
9、根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述的反義rna表達(dá)區(qū)域搭載于待消除質(zhì)粒中。
10、根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述的待消除質(zhì)粒為細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定游離余基因組之外的能獨(dú)立復(fù)制，或隨基因組復(fù)制并被傳遞給子代細(xì)胞的環(huán)狀或線性dna。
11、根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述的待消除質(zhì)粒包括pet28a、pec-xk99e、酵母2μ質(zhì)粒中任意一項(xiàng)。
12、根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述的反義rna干擾的基因?yàn)榇x關(guān)鍵基因。
13、根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述的代謝關(guān)鍵基因?yàn)閠ca循環(huán)相關(guān)基因、蛋白質(zhì)合成相關(guān)基因、有氧呼吸相關(guān)基因、無氧呼吸相關(guān)基因、脂質(zhì)合成相關(guān)基因、細(xì)胞壁合成相關(guān)基因、糖類轉(zhuǎn)運(yùn)途徑相關(guān)基因、氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)途徑相關(guān)基因、atp合成相關(guān)基因、細(xì)胞骨架合成相關(guān)基因、nadph/nadp+合成相關(guān)基因、nadh/nad+合成相關(guān)基因、維生素合成相關(guān)基因、一碳轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)相關(guān)基因、二氧化碳固定相關(guān)基因、dna/rna合成相關(guān)基因、氨基酸合成相關(guān)基因、核糖合成相關(guān)基因、核糖體合成相關(guān)基因、核糖體組裝相關(guān)基因、氨酰trna合成酶相關(guān)基因及上述基因的同工酶基因。
14、根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述質(zhì)粒消除模塊的消除對(duì)象為所有具備穩(wěn)定游離質(zhì)粒、游離質(zhì)粒有一定概率不會(huì)分配給子細(xì)胞、且游離質(zhì)粒消除不會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞死亡或無法增殖的微生物、動(dòng)物或植物細(xì)胞。
15、為便于本專業(yè)技術(shù)人員理解本發(fā)明，主要詞匯解釋如下：
16、基因電路：將特定的基因元件如啟動(dòng)子、終止子、蛋白質(zhì)翻譯區(qū)、特定蛋白質(zhì)結(jié)合區(qū)按照一定規(guī)律組合在一起單位點(diǎn)或多位點(diǎn)布置以實(shí)現(xiàn)特定功能的dna序列的組合。
17、便捷可用：該模塊可以以pcr產(chǎn)物/質(zhì)粒等形式保存，可通過吉布森組裝、金門克隆、酶切酶連、基因組編輯等形式插入細(xì)胞外或細(xì)胞內(nèi)的質(zhì)粒上。
18、可編程：該模塊的使用不受質(zhì)粒拷貝數(shù)限制，且可通過組合不同的調(diào)控蛋白在含有復(fù)數(shù)種質(zhì)粒的細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)選擇性消除。
19、適應(yīng)性廣：該模塊可通過密碼子優(yōu)化/替換相關(guān)控制的元件的形式跨物種使用。
20、穩(wěn)定性強(qiáng)：即使反義rna與目的mrna存在一定的序列偏差也不影響本發(fā)明提出的模塊的功能。
21、所需序列較短：當(dāng)使用細(xì)胞本底調(diào)控因子時(shí)，本發(fā)明提出的質(zhì)粒消除模塊序列總長通?？尚∮?kbp，甚至小于100bp，當(dāng)自帶調(diào)控因子時(shí)，本發(fā)明提出的質(zhì)粒消除模塊序列總長通常不會(huì)超過3kbp。
22、構(gòu)建質(zhì)粒：主要指搭在了基因組編輯必須功能蛋白用于輔助實(shí)現(xiàn)基因工程細(xì)胞基因組編輯目的的工具質(zhì)粒，這類質(zhì)粒在完成工程細(xì)胞基因組編輯后通常需要消除，以避免在工程細(xì)胞應(yīng)用中引入或造成額外的突變。
23、人工構(gòu)建質(zhì)粒：主要是指不涉及基因組編輯的、人工搭建的表達(dá)同源/異源蛋白或一些功能基因電路的質(zhì)粒。
24、質(zhì)粒的骨架：搭載質(zhì)粒復(fù)制子與質(zhì)粒維持基因的dna序列。
25、游離質(zhì)粒：能在細(xì)胞中自主輔助或隨基因組共同復(fù)制，能伴隨細(xì)胞增殖分配給子細(xì)胞，且能穩(wěn)定游離余基因組之外的線性或環(huán)狀雙鏈dna。
26、組成型啟動(dòng)子：能被大腸桿菌σ因子識(shí)別并招募rna聚合酶亞基對(duì)下游進(jìn)行轉(zhuǎn)錄的特定dna序列。
27、舉例說明如下：
28、大腸桿菌相關(guān)序列：
29、大腸桿菌acnb基因干擾區(qū)全序列：
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74、pet28a質(zhì)粒全序列：
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146、tgccaccgctgagcaataactagcataaccccttggggcctctaaacgggtcttgaggggttttttgctgaaaggaggaactatatccggat(seq?id?no：2)
147、阿拉伯糖啟動(dòng)子序列(箭頭為轉(zhuǎn)錄起始方向)：
148、aagaaaccaattgtccatattgcatcagacattgccgtcactgcgtcttttactggctcttctcgctaaccaaaccggtaaccccgcttattaaaagcattctgtaacaaagcgggaccaaagccatgacaaaaacgcgtaacaaaagtgtctataatcacggcagaaaagtccacattgattatttgcacggcgtcacactttgctatgccatagcatttttatccataagattagcggatcctacctgacgctttttatcgcaactctctactgtttctccat→(seq?idno：3)
149、t7終止子序列(箭頭為轉(zhuǎn)錄終止方向)：
150、→ctagcataaccccttggggcctctaaacgggtcttgaggggttttttg(seq?id?no：4)
151、阿拉伯糖轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)框(包含啟動(dòng)子、cds區(qū)、終止子)：
152、ggatttctgttcatgggggtaatgataccgatggcgcacatttccccgaaaagtgccacctgcatcgatttattatgacaacttgacggctacatcattcactttttcttcacaaccggcacggaactcgctcgggctggccccggtgcattttttaaatacccgcgagaaatagagttgatcgtcaaaaccaacattgcgaccgacggtggcgataggcatccgggtggtgctcaaaagcagcttcgcctggctgatacgttggtcctcgcgccagcttaagacgctaatccctaactgctggcggaaaagatgtgacagacgcgacggcgacaagcaaacatgctgtgcgacgctggcgatatcaaaattgctgtctgccaggtgatcgctgatgtactgacaagcctcgcgtacccgattatccatcggtggatggagcgactcgttaatcgcttccatgcgccgcagtaacaattgctcaagcagatttatcgccagcagctccgaatagcgcccttccccttgcccggcgttaatgatttgcccaaacaggtcgctgaaatgcggctggtgcgcttcatccgggcgaaagaaccccgtattggcaaatattgacggccagttaagccattcatgccagtaggcgcgcggacgaaagtaaacccactggtgataccattcgcgagcctccggatgacgaccgtagtgatgaatctctcctggcgggaacagcaaaatatcacccggtcggcaaacaaattctcgtccctgatttttcaccaccccctgaccgcgaatggtgagattgagaatataacctttcattcccagcggtcggtcgataaaaaaatcgagataaccgttggcctcaatcggcgttaaacccgccaccagatgggcattaaacgagtatcccggcagcaggggatcattttgcgcttcagccatacttttcatactcccgccattcagagaagaaaccaattgtccatattgcatcagacattgccgtcactgcgtcttttactggctcttctcgctaaccaaaccggtaaccccgcttattaaaagcattctgtaacaaagcgggaccaaagccatgacaaaaacgcgtaacaaaagtgtct(seq?id?no：5)
153、谷氨酸棒桿菌相關(guān)序列：
154、谷氨酸棒桿菌acn基因cds區(qū)全序列：
155、ttggagctcactgtgactgaaagcaagaactccttcaatgctaagagcacccttgaagt
156、tggcgacaagtcctatgactacttcgccctctctgcagtgcctggcatggagaagctgc
157、cgtactccctcaaggttctcggagagaaccttcttcgtaccgaagacggcgcaaacatc
158、accaacgagcacattgaggctatcgccaactgggatgcatcttccgatccaagcatcga
159、aatccagttcaccccagcccgtgttctcatgcaggacttcaccggtgtcccttgtgtagt
160、tgacctcgcaaccatgcgtgaggcagttgctgcactcggtggcgaccctaacgacgtca
161、acccactgaacccagccgagatggtcattgaccactccgtcatcgtggaggctttcggc
162、cgcccagatgcactggctaagaacgttgagatcgagtacgagcgcaacgaggagcgtt
163、accagttcctgcgttggggttccgagtccttctccaacttccgcgttgttcctccagga
164、accggtatcgtccaccaggtcaacattgagtacttggctcgcgtcgtcttcgacaacga
165、gggccttgcatacccagatacctgcatcggtaccgactcccacaccaccatggaaaacg
166、gcctgggcatcctgggctggggcgttggtggcattgaggctgaagcagcaatgctcgg
167、ccagccagtgtccatgctgatccctcgcgttgttggcttcaagttgaccggcgagatcc
168、cagtaggcgttaccgcaactgacgttgtgctgaccatcaccgaaatgctgcgcgaccac
169、ggcgtcgtccagaagttcgttgagttctacggctccggtgttaaggctgttccactggc
170、taaccgtgcaaccatcggcaacatgtccccagagttcggctccacctgtgcgatgttcc
171、caatcgacgaggagaccaccaagtacctgcgcctcaccggccgcccagaagagcaggt
172、tgcactggtcgaggcttacgccaaggcgcagggcatgtggctcgacgaggacaccgtt
173、gaagctgagtactccgagtacctcgagctggacctgtccaccgttgttccttccatcgc
174、tggccctaagcgcccacaggaccgcatccttctctccgaggcaaaggagcagttccgta
175、aggatctgccaacctacaccgacgacgctgtttccgtagacacctccatccctgcaacc
176、cgcatggttaacgaaggtggcggacagcctgaaggcggcgtcgaagctgacaactaca
177、acgcttcctgggctggctccggcgagtccttggctactggcgcagaaggacgtccttcc
178、aagccagtcaccgttgcatccccacagggtggcgagtacaccatcgaccacggcatggt
179、tgcaattgcatccatcacctcttgcaccaacacctctaacccatccgtgatgatcggcgc
180、tggcctgatcgcacgtaaggcagcagaaaagggcctcaagtccaagccttgggttaag
181、accatctgtgcaccaggttcccaggttgtcgacggctactaccagcgcgcagacctctg
182、gaaggaccttgaggccatgggcttctacctctccggcttcggctgcaccacctgtattg
183、gtaactccggcccactgccagaggaaatctccgctgcgatcaacgagcacgacctgac
184、cgcaaccgcagttttgtccggtaaccgtaacttcgagggacgtatctcccctgacgtta
185、agatgaactacctggcatccccaatcatggtcattgcttacgcaatcgctggcaccatgg
186、acttcgacttcgagaacgaagctcttggacaggaccaggacggcaacgacgtcttcct
187、gaaggacatctggccttccaccgaggaaatcgaagacaccatccagcaggcaatctcc
188、cgtgagctttacgaagctgactacgcagatgtcttcaagggtgacaagcagtggcagg
189、aactcgatgttcctaccggtgacaccttcgagtgggacgagaactccacctacatccgc
190、aaggcaccttacttcgacggcatgcctgtcgagccagtggcagtcaccgacatccaggg
191、cgcacgcgttctggctaagctcggcgactctgtcaccaccgaccacatctcccctgctt
192、cctccattaagccaggtacccctgcagctcagtacttggatgagcacggtgtggaacgc
193、cacgactacaactccctgggttccaggcgtggtaaccacgaggtcatgatgcgcggcac
194、cttcgccaacatccgcctccagaaccagctggttgacatcgcaggtggctacacccgcg
195、acttcacccaggagggtgctccacaggcgttcatctacgacgcttccgtcaactacaag
196、gctgctggcattccgctggtcgtcttgggcggcaaggagtacggcaccggttcttcccg
197、tgactgggcagctaagggcactaacctgctcggaattcgcgcagttatcaccgagtcct
198、tcgagcgtattcaccgctccaacctcatcggtatgggcgttgtcccactgcagttccctg
199、caggcgaatcccacgagtccctgggccttgacggcaccgagaccttcgacatcaccgg
200、actgaccgcactcaacgagggcgagactcctaagactgtcaaggtcaccgcaaccaag
201、gagaacggcgacgtcgtcgagttcgacgcagttgtccgcatcgacaccccaggtgagg
202、ctgactactaccgccacggcggcatcctgcagtacgtgctgcgtcagatggctgcttcttctaagtaa(seq?id?no：6)
203、谷氨酸棒桿菌pec-xk99e質(zhì)粒序列：
204、gaattcgagctcggtacccggggatcctctagagtcgacctgcaggcatgcaagcttgg
205、ctgttttggcggatgagagaagattttcagcctgatacagattaaatcagaacgcagaa
206、gcggtctgataaaacagaatttgcctggcggcagtagcgcggtggtcccacctgacccc
207、atgccgaactcagaagtgaaacgccgtagcgccgatggtagtgtggggtctccccatgc
208、gagagtagggaactgccaggcatcaaataaaacgaaaggctcagtcgaaagactgggc
209、ctttcgttttatctgttgtttgtcggtgaacgctctcctgagtaggacaaatccgccggg
210、agcggatttgaacgttgcgaagcaacggcccggagggtggcgggcaggacgcccgcca
211、taaactgccaggcatcaaattaagcagaaggccatcctgacggatggcctttttgcgtt
212、tctacaaactctttttgtttatttttctaaatacattcaaatatgtatccgctcatgaatta
213、attccgctagatgacgtgcggcttcgacctcctgggcgtggcgcttgttggcgcgctcg
214、cggctggctgcggcacgacacgcgtctgagcagtattttgcgcgccgtcctcgtgggtc
215、aggccggggtgggatcaggccaccgcagtaggcgcagctgatgcgatcctccactactg
216、cgcgtcctcctggcgctgccgagcacgcagctcgtcggccagctcttcaaggtcggcc
217、acaagcgtttctaggtcgctcgcggcacttgcccagtcgcgtgatgctggcgcgtctgt
218、cgtatcgagggcgcggaaaaatccgatcaccgtttttaaatcgacggcggcatcgagtg
219、cgtcggactccagcgcgacatcggagagatccaccgctgatgcttcaggccagttttgg
220、tacttcgtcgtgaaggtcatgacaccattataacgaacgttcgttaaaaattctagcccc
221、aattctgataatttcttccggcactcctgcgaaaacctgcgagacttcttgcccagaaa
222、aaacgccaagcgcagcggttaccgcactttttttccaggtgatttcaccctgaccagcg
223、aagcggcactttagtgcatgaggtgtgcccctggtttcccctctttggagggttcaacc
224、caaaaaagcacacaagcaaaaatgaaaatcatcatgagcaagttggtgcgaagcagca
225、acgcgctagctccaaaaaggtctccaggatctcgaggagatttttgagggggagggag
226、tcgaggaagagccagagcagaaggcggggaaccgttctctgccgacagcgtgagccc
227、cccttaaaaatcaggccggggaggaaccggggagggatcagagctaggagcgagaca
228、ccctaaagggggggaaccgttttctgctgacggtgtttcgtttattagttttcagcccgt
229、ggatagcggagggtgagggcaagtgagagccagagcaaggacgggacccctaaaggg
230、gggaaccgttttctgctgacggtgtttcgtttattagttttcagcccgtggacggccgcg
231、tttagcttccattccaagtgcctttctgacttgttggatgcgcctttcactgacacctag
232、ttcgcctgcaagctcacgagtcgagggatcagcaaccgattgagaacgggcatccagg
233、atcgcagttttgacgcgaagttcgagcaactcgcctgtcatttctcggcgtttgtttgct
234、tccgctaatcgctgtcgcgtctcctgcgcatacttactttctgggtcagcccatctgcgt
235、gcattcgatgtagctgcgccccgtcgccccatcgtcgctagagctttccgccctcggctg
236、ctctgcgtttccacccgacgagcagggacgactggctggcctttagccacgtagccgcg
237、cacacgacgcgccatcgtcaggcgatcacgcatggcgggaagatccggctcccggccg
238、tctgcaccgaccgcctgggcaacgttgtacgccacttcatacgcgtcgatgatcttggca
239、tcttttaggcgctcaccagcagctttgagctggtatcccacggtcaacgcgtggcgaaa
240、cgcggtctcgtcgcgcgctcgctctggatttgtccagagcactcgcacgccgtcgatca
241、ggtcgccggacgcgtccagggcgctcggcaggctcgcgtccaaaatcgctagcgcctt
242、ggcttctgcggtggcgcgttgtgccgcttcaatgcgggcgcgtccgctggaaaagtcct
243、gctcaatgtactttttcggcttctgtgatccggtcatcgttcgagcaatctccattaggtc
244、ggccagccgatccacacgatcatgctggcagtgccatttataggctgtcggatcgtctga
245、gacgtgcagcggccaccggctcagcctatgcgaaaaagcctggtcagcgccgaaaaca
246、cgagtcatttcttccgtcgttgcagccagcaggcgcatatttgggctggttttacctgct
247、gcggcatacaccgggtcaatgagccagatgagctggcatttcccgctcagcggattcac
248、gccgatccaagccggcgctttttctaggcgtgcccatttctctaaaatcgcgtagacctg
249、cgggtttacgtgctcaatcttcccgccggcctggtggctgggcacatcgatgtcaagca
250、cgatcaccgcggcatgttgcgcgtgcgtcagcgcaacgtactggcaccgcgtcagcgct
251、tttgagccagcccggtagagctttggttgggtttcgccggtatccgggtttttaatccag
252、gcgctcgcgaaatctcttgtcttgctgccctggaagctttcgcgtcccaggtgagcgag
253、cagttcgcggcgatcttctgccgtccagccgcgtgagccgcagcgcatagcttcggggt
254、gggtgtcgaacagatcggcggacaatttccacgcgctagctgtgactgtgtcctgcgga
255、tcggctagagtcatgtcttgagtgctttctcccagctgatgactgggggttagccgacg
256、ccctgtgagttcccgctcacggggcgttcaactttttcaggtatttgtgcagcttatcgt
257、gttttcttcgtaaatgaacgcttaactaccttgttaaacgtggcaaataggcaggattga
258、tggggatctagcttcacgctgccgcaagcactcagggcgcaagggctgctaaaggaag
259、cggaacacgtagaaagccagtccgcagaaacggtgctgaccccggatgaatgtcagct
260、actgggctatctggacaagggaaaacgcaagcgcaaagagaaagcaggtagcttgca
261、gtgggcttacatggcgatagctagactgggcggttttatggacagcaagcgaaccggaa
262、ttgccagctggggcgccctctggtaaggttgggaagccctgcaaagtaaactggatgg
263、ctttcttgccgccaaggatctgatggcgcaggggatcaagatctgatcaagagacagga
264、tgaggatcgtttcgcatgattgaacaagatggattgcacgcaggttctccggccgcttg
265、ggtggagaggctattcggctatgactgggcacaacagacaatcggctgctctgatgccg
266、ccgtgttccggctgtcagcgcaggggcgcccggttctttttgtcaagaccgacctgtcc
267、ggtgccctgaatgaactccaagacgaggcagcgcggctatcgtggctggccacgacgg
268、gcgttccttgcgcagctgtgctcgacgttgtcactgaagcgggaagggactggctgcta
269、ttgggcgaagtgccggggcaggatctcctgtcatctcaccttgctcctgccgagaaagt
270、atccatcatggctgatgcaatgcggcggctgcatacgcttgatccggctacctgcccatt
271、cgaccaccaagcgaaacatcgcatcgagcgagcacgtactcggatggaagccggtctt
272、gtcgatcaggatgatctggacgaagagcatcaggggctcgcgccagccgaactgttcg
273、ccaggctcaaggcgcggatgcccgacggcgaggatctcgtcgtgacccatggcgatgc
274、ctgcttgccgaatatcatggtggaaaatggccgcttttctggattcatcgactgtggccg
275、gctgggtgtggcggaccgctatcaggacatagcgttggctacccgtgatattgctgaag
276、agcttggcggcgaatgggctgaccgcttcctcgtgctttacggtatcgccgctcccgatt
277、cgcagcgcatcgccttctatcgccttcttgacgagttcttctgagcgggactctggggtt
278、cgcggaatcatgaccaaaatcccttaacgtgagttttcgttccactgagcgtcagaccc
279、cgtagaaaagatcaaaggatcttcttgagatcctttttttctgcgcgtaatctgctgctt
280、gcaaacaaaaaaaccaccgctaccagcggtggtttgtttgccggatcaagagctacca
281、actctttttccgaaggtaactggcttcagcagagcgcagataccaaatactgtccttcta
282、gtgtagccgtagttaggccaccacttcaagaactctgtagcaccgcctacatacctcgct
283、ctgctaatcctgttaccagtggctgctgccagtggcgataagtcgtgtcttaccgggttg
284、gactcaagacgatagttaccggataaggcgcagcggtcgggctgaacggggggttcgt
285、gcacacagcccagcttggagcgaacgacctacaccgaactgagatacctacagcgtga
286、gctatgagaaagcgccacgcttcccgaagggagaaaggcggacaggtatccggtaagc
287、ggcagggtcggaacaggagagcgcacgagggagcttccagggggaaacgcctggtat
288、ctttatagtcctgtcgggtttcgccacctctgacttgagcgtcgatttttgtgatgctcgt
289、caggggggcggagcctatggaaaaacgccagcaacgcggcctttttacggttcctggc
290、cttttgctggccttttgctcacatgttctttcctgcgttatcccctgattctgtggataac
291、cgtattaccgcctttgagtgagctgataccgctcgccgcagccgaacgaccgagcgcag
292、cgagtcagtgagcgaggaagcggaagagcgcctgatgcggtattttctccttacgcatc
293、tgtgcggtatttcacaccgcatatggtgcactctcagtacaatctgctctgatgccgcata
294、gttaagccagtatacactccgctatcgctacgtgactgggtcatggctgcgccccgacac
295、ccgccaacacccgctgacgcgccctgacgggcttgtctgctcccggcatccgcttacag
296、acaagctgtgaccgtctccgggagctgcatgtgtcagaggttttcaccgtcatcaccga
297、aacgcgcgaggcagcagatcaattcgcgcgcgaaggcgaagcggcatgcatttacgtt
298、gacaccatcgaatggtgcaaaacctttcgcggtatggcatgatagcgcccggaagagag
299、tcaattcagggtggtgaatgtgaaaccagtaacgttatacgatgtcgcagagtatgccg
300、gtgtctcttatcagaccgtttcccgcgtggtgaaccaggccagccacgtttctgcgaaa
301、acgcgggaaaaagtggaagcggcgatggcggagctgaattacattcccaaccgcgtgg
302、cacaacaactggcgggcaaacagtcgttgctgattggcgttgccacctccagtctggcc
303、ctgcacgcgccgtcgcaaattgtcgcggcgattaaatctcgcgccgatcaactgggtgc
304、cagcgtggtggtgtcgatggtagaacgaagcggcgtcgaagcctgtaaagcggcggtg
305、cacaatcttctcgcgcaacgcgtcagtgggctgatcattaactatccgctggatgaccag
306、gatgccattgctgtggaagctgcctgcactaatgttccggcgttatttcttgatgtctctg
307、accagacacccatcaacagtattattttctcccatgaagacggtacgcgactgggcgtg
308、gagcatctggtcgcattgggtcaccagcaaatcgcgctgttagcgggcccattaagttc
309、tgtctcggcgcgtctgcgtctggctggctggcataaatatctcactcgcaatcaaattca
310、gccgatagcggaacgggaaggcgactggagtgccatgtccggttttcaacaaaccatg
311、caaatgctgaatgagggcatcgttcccactgcgatgctggttgccaacgatcagatggc
312、gctgggcgcaatgcgcgccattaccgagtccgggctgcgcgttggtgcggatatctcgg
313、tagtgggatacgacgataccgaagacagctcatgttatatcccgccgtcaaccaccatca
314、aacaggattttcgcctgctggggcaaaccagcgtggaccgcttgctgcaactctctcag
315、ggccaggcggtgaagggcaatcagctgttgcccgtctcactggtgaaaagaaaaacca
316、ccctggcgcccaatacgcaaaccgcctctccccgcgcgttggccgattcattaatgcagc
317、tggcacgacaggtttcccgactggaaagcgggcagtgagcgcaacgcaattaatgtga
318、gttagcgcgaattgatctggtttgacagcttatcatcgactgcacggtgcaccaatgctt
319、ctggcgtcaggcagccatcggaagctgtggtatggctgtgcaggtcgtaaatcactgca
320、taattcgtgtcgctcaaggcgcactcccgttctggataatgttttttgcgccgacatcata
321、acggttctggcaaatattctgaaatgagctgttgacaattaatcatccggctcgtataatgtgtggaattgtgagcggataacaatttcacacaggaaacagaccatg(seq?id?no：7)阿拉伯糖啟動(dòng)子序列(箭頭為轉(zhuǎn)錄起始方向)：
322、aagaaaccaattgtccatattgcatcagacattgccgtcactgcgtcttttactggctct
323、tctcgctaaccaaaccggtaaccccgcttattaaaagcattctgtaacaaagcgggacc
324、aaagccatgacaaaaacgcgtaacaaaagtgtctataatcacggcagaaaagtccaca
325、ttgattatttgcacggcgtcacactttgctatgccatagcatttttatccataagattagcggatcctacctgacgctttttatcgcaactctctactgtttctccat→(seq?id?no：8)t7終止子序列(箭頭為轉(zhuǎn)錄終止方向)：
326、→ctagcataaccccttggggcctctaaacgggtcttgaggggttttttg(seq?id?no：9)阿拉伯糖轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)框(包含啟動(dòng)子、cds區(qū)、終止子)：
327、ggatttctgttcatgggggtaatgataccgatggcgcacatttccccgaaaagtgccacc
328、tgcatcgatttattatgacaacttgacggctacatcattcactttttcttcacaaccggca
329、cggaactcgctcgggctggccccggtgcattttttaaatacccgcgagaaatagagttg
330、atcgtcaaaaccaacattgcgaccgacggtggcgataggcatccgggtggtgctcaaaa
331、gcagcttcgcctggctgatacgttggtcctcgcgccagcttaagacgctaatccctaact
332、gctggcggaaaagatgtgacagacgcgacggcgacaagcaaacatgctgtgcgacgct
333、ggcgatatcaaaattgctgtctgccaggtgatcgctgatgtactgacaagcctcgcgtac
334、ccgattatccatcggtggatggagcgactcgttaatcgcttccatgcgccgcagtaacaa
335、ttgctcaagcagatttatcgccagcagctccgaatagcgcccttccccttgcccggcgtt
336、aatgatttgcccaaacaggtcgctgaaatgcggctggtgcgcttcatccgggcgaaaga
337、accccgtattggcaaatattgacggccagttaagccattcatgccagtaggcgcgcgga
338、cgaaagtaaacccactggtgataccattcgcgagcctccggatgacgaccgtagtgatg
339、aatctctcctggcgggaacagcaaaatatcacccggtcggcaaacaaattctcgtccct
340、gatttttcaccaccccctgaccgcgaatggtgagattgagaatataacctttcattccca
341、gcggtcggtcgataaaaaaatcgagataaccgttggcctcaatcggcgttaaacccgcc
342、accagatgggcattaaacgagtatcccggcagcaggggatcattttgcgcttcagccata
343、cttttcatactcccgccattcagagaagaaaccaattgtccatattgcatcagacattgc
344、cgtcactgcgtcttttactggctcttctcgctaaccaaaccggtaaccccgcttattaaa
345、agcattctgtaacaaagcgggaccaaagccatgacaaaaacgcgtaacaaaagtgtct(seq?id?no：10)
346、釀酒酵母相關(guān)序列：
347、釀酒酵母aco1/glu1基因cds區(qū)全序列：
348、atgctgtctgcacgttctgccatcaagagacccattgttcgtggtcttgcgacagtctcc
349、aacttgactagagattcaaaagtcaaccaaaacttattagaagatcattcttttattaac
350、tacaagcagaatgtggaaacgctggatatcgtaagaaaaagattaaacaggccatttac
351、ctacgcggaaaagattttgtacggtcacttggatgaccctcatggtcaagatattcagag
352、aggtgtttcatacctaaaattaagaccagatcgtgttgcctgtcaagatgctactgctca
353、aatggctattttacaatttatgtccgctggtttaccacaggttgctaagccagtcactgtc
354、cactgtgaccatttgattcaagcacaagttggtggtgaaaaagatttgaagagagctat
355、agatctaaacaaggaagtttatgatttcttggcctctgccactgcgaaatataacatggg
356、tttctggaagccaggttccggtatcattcaccaaattgttctggaaaactacgctttccc
357、aggtgctttgatcattggtactgactcccatacaccaaatgctggtggtttaggtcaatt
358、ggctattggtgttggtggtgctgatgccgttgatgttatggcaggtcgtccatgggaatt
359、gaaggctccaaagatcttaggtgttaagttgactggtaagatgaacggttggacttctc
360、caaaggatattattttgaaattggctggtatcacaactgtcaaaggtggtactggtaaaa
361、ttgttgaatatttcggtgatggtgttgacaccttctccgctactggtatgggtaccatttg
362、taatatgggtgctgaaatcggtgctaccacatctgttttcccattcaacaaatctatgatt
363、gaatatttggaagcaactggtcgtggtaagatcgctgactttgctaaattataccacaag
364、gacctattatctgctgataaggatgctgaatacgatgaggtcgtcgaaattgacttgaac
365、actctggaaccatacatcaatgggccatttacccccgatttggctactccagtttctaag
366、atgaaggaagttgctgttgctaataactggccattggatgtcagagtcggtttgatcggt
367、tcttgtaccaattcctcttatgaagatatgtctcgttcagcatccattgtcaaggatgctg
368、ctgctcatggtttgaaatccaagaccattttcactgttactccaggttctgaacaaatca
369、gagccactattgaacgtgatggccaattagaaaccttcaaagaatttggtggtatcgttt
370、tggcaaacgcctgtggcccatgtattggtcaatgggatcgtagagatatcaagaaaggt
371、gacaagaatactatcgtttcctcttacaacagaaatttcacttctagaaatgatggtaac
372、ccacaaactcatgcttttgttgcatctccagaattagtaactgcgttcgccattgcgggt
373、gatttgagattcaaccctctaacagacaaattaaaggacaaggatggtaatgagttcat
374、gttgaaaccaccacatggtgatggtttgcctcaaagaggttatgatgctggtgagaaca
375、cttaccaagctccacctgcagaccgtagcaccgttgaagttaaagtttctccaacttca
376、gaccgtctacaactgttgaaaccattcaaaccttgggatggtaaggatgctaaagacat
377、gccaatcttgattaaggccgtcggtaagacaactactgatcatatttctatggctggtcca
378、tggttgaaatacagaggtcatttagaaaacatttctaataactatatgattggtgctatta
379、atgctgaaaacaagaaggctaactgtgttaaaaatgtatatactggtgaatacaaaggt
380、gttccagacactgctagagattacagagaccaaggtatcaagtgggttgttattggtga
381、tgaaaactttggtgaaggttcctctcgtgaacacgctgctttggaaccaagattcttgg
382、gcggtttcgctatcatcacaaagtctttcgctcgtatccatgaaactaacttgaaaaaac
383、aaggtctattgccattgaacttcaagaacccagctgactatgacaagatcaaccctgat
384、gacagaatcgatattctgggtctagctgaattggctccaggtaagcctgtaacaatgag
385、agttcatccaaagaatggtaagccatgggatgctgtgttgacccatactttcaacgatga
386、gcaaattgaatggttcaaatatggttctgccttaaataaaattaaggccgatgagaagaaataa(seqid?no：11)
387、釀酒酵母2μ穿梭質(zhì)粒序列：
388、caactttgtatagaaaagttgacggattagaagccgccgagcgggtgacagccctccga
389、aggaagactctcctccgtgcgtcctcgtcttcaccggtcgcgttcctgaaacgcagatg
390、tgcctcgcgccgcactgctccgaacaataaagattctacaatactagcttttatggttatg
391、aagaggaaaaattggcagtaacctggccccacaaaccttcaaatgaacgaatcaaatt
392、aacaaccataggatgataatgcgattagttttttagccttatttctggggtaattaatcag
393、cgaagcgatgatttttgatctattaacagatatataaatgcaaaaactgcataaccacttt
394、aactaatactttcaacattttcggtttgtattacttcttattcaaatgtaataaaagtatca
395、acaaaaaattgttaatatacctctatactttaacgtcaaggagaaaaaacccaagtttgt
396、acaaaaaagcaggctgccaccatggtgagcaagggcgaggagctgttcaccggggtg
397、gtgcccatcctggtcgagctggacggcgacgtaaacggccacaagttcagcgtgtccg
398、gcgagggcgagggcgatgccacctacggcaagctgaccctgaagttcatctgcaccac
399、cggcaagctgcccgtgccctggcccaccctcgtgaccaccctgacctacggcgtgcagt
400、gcttcagccgctaccccgaccacatgaagcagcacgacttcttcaagtccgccatgccc
401、gaaggctacgtccaggagcgcaccatcttcttcaaggacgacggcaactacaagaccc
402、gcgccgaggtgaagttcgagggcgacaccctggtgaaccgcatcgagctgaagggcat
403、cgacttcaaggaggacggcaacatcctggggcacaagctggagtacaactacaacagc
404、cacaacgtctatatcatggccgacaagcagaagaacggcatcaaggtgaacttcaagat
405、ccgccacaacatcgaggacggcagcgtgcagctcgccgaccactaccagcagaacacc
406、cccatcggcgacggccccgtgctgctgcccgacaaccactacctgagcacccagtccgc
407、cctgagcaaagaccccaacgagaagcgcgatcacatggtcctgctggagttcgtgacc
408、gccgccgggatcactctcggcatggacgagctgtacaagtaaacccagctttcttgtac
409、aaagtggtagcggccgctcgagcatgcatctagagggccgcatcatgtaattagttatgt
410、cacgcttacattcacgccctccccccacatccgctctaaccgaaaaggaaggagttaga
411、caacctgaagtctaggtccctatttatttttttatagttatgttagtattaagaacgttatt
412、tatatttcaaatttttcttttttttctgtacagacgcgtgtacgcatgtaacattatactga
413、aaaccttgcttgagaaggttttgggacgctcgaaggctttaatttgcaagctgcggccc
414、tgcattaatgaatcggccaacgcgcggggagaggcggtttgcgtattgggcgctcttcc
415、gcttcctcgctcactgactcgctgcgctcggtcgttcggctgcggcgagcggtatcagc
416、tcactcaaaggcggtaatacggttatccacagaatcaggggataacgcaggaaagaaca
417、tgtgagcaaaaggccagcaaaaggccaggaaccgtaaaaaggccgcgttgctggcgt
418、ttttccataggctccgcccccctgacgagcatcacaaaaatcgacgctcaagtcagagg
419、tggcgaaacccgacaggactataaagataccaggcgtttccccctggaagctccctcgt
420、gcgctctcctgttccgaccctgccgcttaccggatacctgtccgcctttctcccttcggg
421、aagcgtggcgctttctcatagctcacgctgtaggtatctcagttcggtgtaggtcgttcg
422、ctccaagctgggctgtgtgcacgaaccccccgttcagcccgaccgctgcgccttatccg
423、gtaactatcgtcttgagtccaacccggtaagacacgacttatcgccactggcagcagcc
424、actggtaacaggattagcagagcgaggtatgtaggcggtgctacagagttcttgaagtg
425、gtggcctaactacggctacactagaagaacagtatttggtatctgcgctctgctgaagcc
426、agttaccttcggaaaaagagttggtagctcttgatccggcaaacaaaccaccgctggta
427、gcggtggtttttttgtttgcaagcagcagattacgcgcagaaaaaaaggatctcaagaa
428、gatcctttgatcttttctacggggtctgacgctcagtggaacgaaaactcacgttaagg
429、gattttggtcatgagattatcaaaaaggatcttcacctagatccttttaaattaaaaatga
430、agttttaaatcaatctaaagtatatatgagtaaacttggtctgacagttaccaatgcttaa
431、tcagtgaggcacctatctcagcgatctgtctatttcgttcatccatagttgcctgactccc
432、cgtcgtgtagataactacgatacgggagggcttaccatctggccccagtgctgcaatgat
433、accgcgagacccacgctcaccggctccagatttatcagcaataaaccagccagccggaa
434、gggccgagcgcagaagtggtcctgcaactttatccgcctccatccagtctattaattgtt
435、gccgggaagctagagtaagtagttcgccagttaatagtttgcgcaacgttgttgccatt
436、gctacaggcatcgtggtgtcacgctcgtcgtttggtatggcttcattcagctccggttcc
437、caacgatcaaggcgagttacatgatcccccatgttgtgcaaaaaagcggttagctcctt
438、cggtcctccgatcgttgtcagaagtaagttggccgcagtgttatcactcatggttatggc
439、agcactgcataattctcttactgtcatgccatccgtaagatgcttttctgtgactggtgag
440、tactcaaccaagtcattctgagaatagtgtatgcggcgaccgagttgctcttgcccggc
441、gtcaatacgggataataccgcgccacatagcagaactttaaaagtgctcatcattggaaa
442、acgttcttcggggcgaaaactctcaaggatcttaccgctgttgagatccagttcgatgt
443、aacccactcgtgcacccaactgatcttcagcatcttttactttcaccagcgtttctgggt
444、gagcaaaaacaggaaggcaaaatgccgcaaaaaagggaataagggcgacacggaaat
445、gttgaatactcatactcttcctttttcaatgggtaataactgatataattaaattgaagctc
446、taatttgtgagttgagtatacatgcatttacttataatacagtttttcagaagaactcgtc
447、aagaaggcgatagaaggcgatgcgctgcgaatcgggagcggcgataccgtaaagcacg
448、aggaagcggtcagcccattcgccgccaagctcttcagcaatatcacgggtagccaacgc
449、tatgtcctgatagcggtccgccacacccagccggccacagtcgatgaatccagaaaagc
450、ggccattttccaccatgatattcggcaagcaggcatcgccatgggtcacgacgagatcct
451、cgccgtcgggcatgctcgccttgagcctggcgaacagttcggctggcgcgagcccctga
452、tgctcttcgtccagatcatcctgatcgacaagaccggcttccatccgagtacgtgctcgc
453、tcgatgcgatgtttcgcttggtggtcgaatgggcaggtagccggatcaagcgtatgcag
454、ccgccgcattgcatcagccatgatggatactttctcggcaggagcaaggtgagatgaca
455、ggagatcctgccccggcacttcgcccaatagcagccagtcccttcccgcttcagtgaca
456、acgtcgagcacagctgcgcaaggaacgcccgtcgtggccagccacgatagccgcgctg
457、cctcgtcttgcagttcattcagggcaccggacaggtcggtcttgacaaaaagaaccgg
458、gcgcccctgcgctgacagccggaacacggcggcatcagagcagccgattgtctgttgt
459、gcccagtcatagccgaatagcctctccacccaagcggccggagaacctgcgtgcaatcc
460、atcttgttcaatcatgatttatcttcgtttcctgcaggtttttgttctgtgcagttgggtt
461、aagaatactgggcaatttcatgtttctttcaacactacatatgcgtatatataccaatctaa
462、gtctgtgctccttccttcgttcttccttctgttcggagattaccgaatcaaaaaaatttc
463、aaggaaaccgaaatcaaaaaaaagaataaaaaaaaaatgatgaattgaaaagctagct
464、tatcgatgataagctgtcaaacatgagaattaattccacggactatagactatacctagta
465、tactccgtctactgtacgatacacttccgctcaggtccttgtcctttaacgaggccttac
466、cactcttttgttactctattgatccagctcagcaaaggcagtgtgatctaagattctatct
467、tcgcgatgtagtaaaactagctagaccgagaaagagactagaaatgcaaaaggcactt
468、ctacaatggctgccatcattattatccgatgtgacgctgcagcttctcaatgatattcgaa
469、tacgctttgaggagatacagcctaatatccgacaaactgttttacagatttacgatcgta
470、cttgttacccatcattgaattttgaacatccgaacctgggagttttccctgaaacagata
471、gtatatttgaacctgtataataatatatagtctagcgctttacggaagacaatgtatgtatt
472、tcggttcctggagaaactattgcatctattgcataggtaatcttgcacgtcgcatccccg
473、gttcattttctgcgtttccatcttgcacttcaatagcatatctttgttaacgaagcatctg
474、tgcttcattttgtagaacaaaaatgcaacgcgagagcgctaatttttcaaacaaagaat
475、ctgagctgcatttttacagaacagaaatgcaacgcgaaagcgctattttaccaacgaag
476、aatctgtgcttcatttttgtaaaacaaaaatgcaacgcgagagcgctaatttttcaaaca
477、aagaatctgagctgcatttttacagaacagaaatgcaacgcgagagcgctattttacca
478、acaaagaatctatacttcttttttgttctacaaaaatgcatcccgagagcgctatttttct
479、aacaaagcatcttagattactttttttctcctttgtgcgctctataatgcagtctcttgat
480、aactttttgcactgtaggtccgttaaggttagaagaaggctactttggtgtctattttct
481、cttccataaaaaaagcctgactccacttcccgcgtttactgattactagcgaagctgcgg
482、gtgcattttttcaagataaaggcatccccgattatattctataccgatgtggattgcgcat
483、actttgtgaacagaaagtgatagcgttgatgattcttcattggtcagaaaattatgaacg
484、gtttcttctattttgtctctatatactacgtataggaaatgtttacattttcgtattgttttc
485、gattcactctatgaatagttcttactacaatttttttgtctaaagagtaatactagagata
486、aacataaaaaatgtagaggtcgagtttagatgcaagttcaaggagcgaaaggtggatg
487、ggtaggttatatagggatatagcacagagatatatagcaaagagatacttttgagcaatgt
488、ttgtggaagcggtattcgcaatgggaagctccaccccggttgataatcagaaaagcccc
489、aaaaacaggaagattgtataagcaaatatttaaattgtaagcgttaatattttgttaaaat
490、tcgcgttaaatttttgttaaatcagctcattttttaaccaataggccgaaatcggcaaaat
491、cccttataaatcaaaagaatagaccgagatagggttgagtgttgttccagtttggaaca
492、agagtccactattaaagaacgtggactccaacgtcaaagggcgaaaaaccgtctatca
493、gggcgatggcccactacgtgaaccatcaccctaatcaagttttttggggtcgaggtgcc
494、gtaaagcactaaatcggaaccctaaagggagcccccgatttagagcttgacggggaaa
495、gccggcgaacgtggcgagaaaggaagggaagaaagcgaaaggagcgggcgctaggg
496、cgctggcaagtgtagcggtcacgctgcgcgtaaccaccacacccgccgcgcttaatgcgccgctacagggcgcgtggggatcgatccactagt(seq?id?no：12)
497、釀酒酵母硫酸新霉素抗性基因序列(包含啟動(dòng)子、表達(dá)框、終止子)：gtgagttgagtatacatgcatttacttataatacagtttttcagaagaactcgtcaagaaggcgatagaaggcgatgcgctgcgaatcgggagcggcgataccgtaaagcacgaggaagcggtcagcccattcgccgccaagctcttcagcaatatcacgggtagccaacgctatgtcctgatagcggtccgccacacccagccggccacagtcgatgaatccagaaaagcggccattttccaccatgatattcggcaagcaggcatcgccatgggtcacgacgagatcctcgccgtcgggcatgctcgccttgagcctggcgaacagttcggctggcgcgagcccctgatgctcttcgtccagatcatcctgatcgacaagaccggcttccatccgagtacgtgctcgctcgatgcgatgtttcgcttggtggtcgaatgggcaggtagccggatcaagcgtatgcagccgccgcattgcatcagccatgatggatactttctcggcaggagcaaggtgagatgacaggagatcctgccccggcacttcgcccaatagcagccagtcccttcccgcttcagtgacaacgtcgagcacagctgcgcaaggaacgcccgtcgtggccagccacgatagccgcgctgcctcgtcttgcagttcattcagggcaccggacaggtcggtcttgacaaaaagaaccgggcgcccctgcgctgacagccggaacacggcggcatcagagcagccgattgtctgttgtgcccagtcatagccgaatagcctctccacccaagcggccggagaacctgcgtgcaatccatcttgttcaatcatgatttatcttcgtttcctgcaggtttttgttctgtgcagttgggttaagaatactgggcaatttcatgtttctttcaacactacatatgcgtatatataccaatctaagtctgtgctccttccttcgttcttccttctg(seq?id?no：13)
498、穿梭載體大腸桿菌復(fù)制子序列：
499、tttccataggctccgcccccctgacgagcatcacaaaaatcgacgctcaagtcagaggt
500、ggcgaaacccgacaggactataaagataccaggcgtttccccctggaagctccctcgtg
501、cgctctcctgttccgaccctgccgcttaccggatacctgtccgcctttctcccttcggga
502、agcgtggcgctttctcatagctcacgctgtaggtatctcagttcggtgtaggtcgttcgc
503、tccaagctgggctgtgtgcacgaaccccccgttcagcccgaccgctgcgccttatccgg
504、taactatcgtcttgagtccaacccggtaagacacgacttatcgccactggcagcagcca
505、ctggtaacaggattagcagagcgaggtatgtaggcggtgctacagagttcttgaagtgg
506、tggcctaactacggctacactagaagaacagtatttggtatctgcgctctgctgaagcca
507、gttaccttcggaaaaagagttggtagctcttgatccggcaaacaaaccaccgctggtag
508、cggtggtttttttgtttgcaagcagcagattacgcgcagaaaaaaaggatctcaa(seq?id?no：14)
509、穿梭載體氨芐青霉素抗性基因表達(dá)框(包含啟動(dòng)子、表達(dá)框、終止子)：ggatcttcacctagatccttttaaattaaaaatgaagttttaaatcaatctaaagtatatatgagtaaacttggtctgacagttaccaatgcttaatcagtgaggcacctatctcagcgatctgtctatttcgttcatccatagttgcctgactccccgtcgtgtagataactacgatacgggagggcttaccatctggccccagtgctgcaatgataccgcgagacccacgctcaccggctccagatttatcagcaataaaccagccagccggaagggccgagcgcagaagtggtcctgcaactttatccgcctccatccagtctattaattgttgccgggaagctagagtaagtagttcgccagttaatagtttgcgcaacgttgttgccattgctacaggcatcgtggtgtcacgctcgtcgtttggtatggcttcattcagctccggttcccaacgatcaaggcgagttacatgatcccccatgttgtgcaaaaaagcggttagctccttcggtcctccgatcgttgtcagaagtaagttggccgcagtgttatcactcatggttatggcagcactgcataattctcttactgtcatgccatccgtaagatgcttttctgtgactggtgagtactcaaccaagtcattctgagaatagtgtatgcggcgaccgagttgctcttgcccggcgtcaatacgggataataccgcgccacatagcagaactttaaaagtgctcatcattggaaaacgttcttcggggcgaaaactctcaaggatcttaccgctgttgagatccagttcgatgtaacccactcgtgcacccaactgatcttcagcatcttttactttcaccagcgtttctgggtgagcaaaaacaggaaggcaaaatgccgcaaaaaagggaataagggcgacacggaaatgttgaatactcatactcttcctttttcaatgggtaataactgatataattaaattgaagctctaatttgtgagttgagtatacatgc(seq?id?no：15)
510、釀酒酵母誘導(dǎo)型啟動(dòng)子gal1序列：
511、acggattagagccgccgagcgacgagcgagcggagcgcagcagcgccgaaggaagac
512、tctcctccgtgcgctcctcgtctcgtcttcaccggtcgtcgtcctgaaacgagatgtgtg
513、cctcgcgccgcactgctccgaacaataatacaataaagattctacaatactagctatggtt
514、atggttatgaagagaaaaatggcagtacctggccccaaacctcaaatgaacgaatcaat
515、taacaaccataggatgatgataatgcgattagttagcttattctatttctggggtaattaat
516、cagcgaagcgatgatgattttgatctattacagatatataatgcaaaactgcataaccact
517、taactaactaatataatactttcaacattttcgtgttgattacttcttatcaaatgtaatacaaaaattgtaatatatacctatactactactacttaacgtcaaggagacc(seq?id?no：16)酵母終止子cyc1序列：
518、atcatgtaattagttatgtcacgcttacattcacgccctccccccacatccgctctaaccg
519、aaaaggaaggagttagacaacctgaagtctaggtccctatttatttttttatagttatgtt
520、agtattaagaacgttatttatatttcaaatttttcttttttttctgtacagacgcgtgtacg
521、catgtaacattatactgaaaaccttgcttgagaaggttttgggacgctcgaaggctttaatttgcaagct(seq?id?no：17)
522、本發(fā)明的有益效果在于：
523、本發(fā)明設(shè)計(jì)了一種基于反義rna的、模塊化的質(zhì)粒消除技術(shù)，構(gòu)建質(zhì)粒消除模塊所需元件簡單易得，質(zhì)粒模塊消除效率高，可根據(jù)需要自由設(shè)置消除對(duì)象，可實(shí)現(xiàn)多種質(zhì)粒的選擇性或同步消除。且本發(fā)明應(yīng)用范圍廣，真核原核生物中均可應(yīng)用該技術(shù)，中心代謝途徑相關(guān)基因皆可結(jié)合反義rna用于質(zhì)粒消除，中心代謝途徑之外的氨基酸、核酸、脂質(zhì)合成途徑、轉(zhuǎn)錄翻譯、dna復(fù)制、細(xì)胞壁、細(xì)胞膜、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等代謝相關(guān)基因的反義rna同樣可應(yīng)用于本技術(shù)，還可通過增加反義rna種類、延長反義rna長度等策略強(qiáng)化消除效果。