本公開涉及從植物如從枸杞中提取外泌體的方法、以及該方法提取的植物外泌體及其應(yīng)用。具體地，本公開植物外泌體的制備方法包括逐層過濾步驟，所述逐層過濾步驟依次包括深層過濾和膜過濾。

背景技術(shù)：

1、外泌體是由細(xì)胞分泌的具有磷脂雙分子層的一種納米顆粒，直徑通常在30-200nm，含有豐富的蛋白質(zhì)和核酸物質(zhì)等。外泌體能在細(xì)胞間傳遞蛋白、mrna、microrna等活性物質(zhì)，參與許多重要的生理、病理過程，其獨特作用已經(jīng)受到越來越多的業(yè)內(nèi)關(guān)注。

2、目前，外泌體主要從乳源樣品、各種細(xì)胞培養(yǎng)上清液、腫瘤組織的滲出液等材料中獲取。但是，從細(xì)胞培養(yǎng)上清液等來源中獲取外泌體的材料來源有限、成本較高，所獲得的外泌體含量低，提純后的成本更高，這就制約了外泌體的大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。

3、各種植物也是外泌體的重要來源，且植物來源的外泌體樣納米顆粒(plantderived?exosome-like?nanoparticles，pen)的提取率遠高于哺乳動物細(xì)胞培養(yǎng)物的提取率，表明其作為納米工廠的經(jīng)濟效力[1]。最重要的是，最近的研究表明植物外泌體可以被腸道巨噬細(xì)胞吸收，發(fā)揮細(xì)胞間通訊和免疫調(diào)節(jié)的作用[2-3]。

4、正確的提取和純化方法對于外泌體的分析至關(guān)重要，因為它們通常存在于過于復(fù)雜的基質(zhì)中。外泌體提取方法的研究不僅要考察提取物的特異性和純度，還需要考慮操作的簡單性和規(guī)模效率。目前，分離外泌體較多使用的方法包括超速離心法、聚合物沉淀法、凝膠排阻法、抗體親和沉淀法、密度梯度離心法、膜過濾等。但是每種方法都有其缺陷，比如超速離心法操作繁雜、技術(shù)難度高、耗時，分離的外泌體可能因高速離心而受損，且含有大量雜蛋白；聚合物沉淀法提取的外泌體缺乏特異性和選擇性，純度低；凝膠排阻法的技術(shù)難度較高，但難以保證分離的外泌體無菌，耗時且難以規(guī)?；?；免疫親和層析通常會提高樣品的純度但會降低效率和回收率；而膜過濾提高效率和回收率但會降低其樣品特異性和純度[4]。

5、通常，哺乳動物來源的外泌體從生物體液中分離出來，而植物來源的外泌體則從質(zhì)外體洗滌液中分離出來。對于哺乳動物來源的外泌體，目前其分離和純化技術(shù)主要包括微流體技術(shù)，超速離心方法、基于外泌體尺寸的分離技術(shù)、沉淀技術(shù)、和免疫親和捕獲技術(shù)，而用于分離和純化植物來源的外泌體的可用方法主要基于用于哺乳動物來源的外泌體的既定技術(shù)，但具有不同程度缺點。例如，對于差速離心，由于植物和動物之間的生理差異，通過這種方法獲得的植物來源的外泌體經(jīng)?；旌嫌械鞍踪|(zhì)、核酸聚集體和其他囊泡，因而需要進一步使用密度梯度超速離心進行進一步純化以分離污染物。再例如，由于植物汁液中存在高分子量成分，例如纖維素和淀粉，其通常會導(dǎo)致離心困難，因而，需要使用各種離心方法的組合(例如差速離心與蔗糖密度梯度離心相結(jié)合)以解決傳統(tǒng)離心技術(shù)的上述缺點。此外，雖然其他幾種分離技術(shù)，如免疫親和捕獲、超濾或尺寸排阻色譜(sec)、共沉淀方法和微流體技術(shù)已成功應(yīng)用于哺乳動物來源的外泌體，但是對于植物來源的外泌體的分離并不理想。例如，雖然基于形成針對細(xì)胞外囊泡表面抗原的免疫復(fù)合物的免疫親和捕獲是純化哺乳動物細(xì)胞外泌體的理想方法，但是，對于植物來源的外泌體，有關(guān)植物來源的外泌體的標(biāo)記蛋白和特征抗體的不足限制了該技術(shù)的應(yīng)用。因此，適于哺乳動物外泌體提取的方法并不適用于植物外泌體的提取。

6、植物外泌體的分離缺乏通用的方法，目前研究中常用的是超速離心方法，或者組合多種手段如萃取、膜過濾除雜、微濾除菌、納濾濃縮、甚至輔之以絡(luò)合反應(yīng)來獲得植物外泌體[7]。如上文所述，盡管超速離心法通常被認(rèn)為是外泌體分離的金標(biāo)準(zhǔn)，可以分離出相對純的外泌體[5]，但超速離心方法具有諸多缺陷，且依賴于超高速離心力和持續(xù)時間、通過將顆粒沉降到底部到達分離的目的，因此耗時且提取規(guī)模受限于超速離心機的處理體積。

7、皮膚是抵御細(xì)菌和紫外線等外部刺激的重要保護屏障，皮膚屏障主要由角質(zhì)層和角質(zhì)形成細(xì)胞組成，其主要功能是保護體內(nèi)組織和液體不受外界環(huán)境影響[8]。紫外線的照射會導(dǎo)致皮膚的角質(zhì)層受到損傷，細(xì)胞內(nèi)屏障蛋白表達下降，從而使皮膚屏障功能受損[9]。同時皮膚也是紫外線誘導(dǎo)氧化損傷的靶器官，uvb所攜帶的能量可以活化皮膚中內(nèi)源的光敏性物質(zhì)，產(chǎn)生單態(tài)氧、氧自由基、過氧化氫等多種活性氧[10]。因此，抑制紫外線誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)活性氧反應(yīng)以及滲透性皮膚屏障破壞是抵擋皮膚光老化及皮膚病變的關(guān)鍵要素之一。

8、枸杞是一種常用的中藥成分[11]。它含有豐富的營養(yǎng)成分，包括胡蘿卜素、維生素a、鈣和鐵。通常，外泌體主要負(fù)責(zé)細(xì)胞間的物質(zhì)傳遞，從而進一步調(diào)控多種生理機制，包括免疫反應(yīng)和炎癥反應(yīng)[12]–[14]。然而，尚未發(fā)現(xiàn)有文獻報告由枸杞中來提取外泌體，更沒有研究其對皮膚屏障損傷和抗氧化方面具有有益作用。

9、因此，需要一種簡單高效、適合于工業(yè)化水平的大規(guī)模分離提取高純度植物外泌體尤其是枸杞外泌體的方法，以實現(xiàn)外泌體生產(chǎn)成本降低和產(chǎn)量提高，同時該外泌體具有對皮膚的有益效果。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、為克服現(xiàn)有技術(shù)中植物外泌體提取方法的欠缺和不足，發(fā)明人首次提出一種使用逐層過濾來分離提取植物外泌體的方法，該方法簡單、高效、適合于工業(yè)化規(guī)模(如圖1所示)，且分離提純的外泌體具有較高的純度。

2、具體地，本公開使用逐層過濾和超速離心兩種方法，從枸杞中分離得到植物外泌體。通過分析分離所得植物外泌體的物理特性和功效，并結(jié)合植物代謝組學(xué)分析，比較兩種方法提取的植物外泌體的區(qū)別，并由此篩選出一種適合于植物外泌體分離提取的方法。

3、研究結(jié)果表明，與超速離心的方法相比，逐層過濾處理相同質(zhì)量植物原料的時間縮短3倍，產(chǎn)量提高了至少40倍，且代謝組學(xué)分析顯示，逐層過濾分離提取的植物外泌體含有更多的活性代謝物。當(dāng)植物原料放大10倍甚至20倍時，逐層過濾分離提取的植物外泌體的方法優(yōu)勢更加明顯。此外，逐層過濾分離提取的植物外泌體具有典型的外泌體樣茶托形狀，蛋白含量豐富，并且在體外具有抗炎和免疫調(diào)節(jié)的功能活性。

4、具體地，本公開的逐層過濾方法相比于超速離心具有更低時間消耗，具有更高的外泌體產(chǎn)量或粒子濃度，能防止因雜質(zhì)過多導(dǎo)致的濾膜堵塞，且能保證產(chǎn)物無菌。使用本公開的逐層過濾方法提取的植物外泌體具有典型的外泌體樣的茶托形狀，粒徑在30-200nm范圍內(nèi)，并顯示出優(yōu)異的抗炎和免疫調(diào)節(jié)活性。

5、本公開的植物外泌體提取方法提適于大規(guī)模生產(chǎn)；優(yōu)選地，所述方法可以通過增加過濾的膜面積從而處理大規(guī)模生產(chǎn)所對應(yīng)的植物材料的量，例如質(zhì)量為至少約100g、200g、300g、400g、500g、600g、700g、800g、900g、1000g、2000g、3000g、4000g、5000g、6000g、7000g、8000g、9000g、10000g、50000g，甚至100000g的植物材料。

6、因此，一方面，本公開提供一種分離提取植物外泌體的方法，具體地通過深層過濾分離提取植物外泌體的方法，所述方法包括以下步驟：

7、(a)獲得植物材料；

8、(b)對獲得的植物材料進行預(yù)處理，獲得植物粗提取液；和

9、(c)對獲得的植物粗提取液進行逐層過濾處理，

10、其中，在步驟(c)中，所述逐層過濾處理包括深層過濾步驟，以及任選地膜過濾步驟。

11、在一種本公開的分離提取植物外泌體的方法實施方案中，在步驟(c)中，所述逐層過濾步驟包括使用深層過濾，優(yōu)選地，所述深層過濾采用約1-50μm孔徑的深層過濾，更優(yōu)選為約2-30μm孔徑的深層過濾。在具體的實施方案中，在步驟(c)中，所述逐層過濾步驟包括深層過濾步驟，所述深層過濾步驟使用深層囊式過濾(優(yōu)選具有約1-50μm孔徑)，更優(yōu)選所述深層囊式過濾為具有約2-30μm孔徑的深層囊式過濾。

12、在具體的實施方案中，在步驟(c)中，所述深層過濾步驟包括使用深層過濾器，優(yōu)選地，所述深層過濾器為具有約1-50μm孔徑的深層過濾器，更優(yōu)選為具有2-30μm孔徑的深層過濾器。在具體的實施方案中，所述深層過濾器為具有1-50μm孔徑的深層囊式過濾器，更優(yōu)選為具有約2-30μm孔徑的深層囊式過濾器，例如，適用的深層囊式過濾器包括頗爾公司(pall?corporation，ny)生產(chǎn)的深層過濾器，例如為supracaptmdepth?filter?capsules。

13、在一種本公開的分離提取植物外泌體的方法實施方案中，所述逐層過濾還包括在深層過濾步驟之后進行的至少一個膜過濾步驟，優(yōu)選地，所述膜過濾包括防堵塞膜過濾，或者還進一步包括除菌膜過濾，例如進行孔徑在約0.4-0.8μm的防堵塞膜過濾和/或孔徑在約0.1-0.3μm的除菌膜過濾，更優(yōu)選地，膜過濾包括約0.45-0.8μm的膜過濾和約0.1-0.22μm的膜過濾，最優(yōu)選地，膜過濾由依次進行的約0.45μm的防堵塞膜過濾和約0.22μm的除菌膜過濾組成。

14、在一種本公開的分離提取植物外泌體的方法實施方案中，所述深層過濾、0.45μm的膜過濾和0.22μm的膜過濾的流速為約20-1000ml/min，例如約20-500ml/min、約20-200ml/min、約30-100ml/min。

15、在一種本公開的分離提取植物外泌體的方法實施方案中，所述步驟(c)的逐層過濾由本公開一般或具體或優(yōu)選定義的深層過濾和本公開一般或具體或優(yōu)選定義的膜過濾組成。

16、在一種本公開的分離提取植物外泌體的方法實施方案中，在步驟(b)中，所述預(yù)處理包括混合、粉碎、研磨、攪拌、過濾、離心中的一種或多種，以獲得植物粗提取物。在具體的實施方案中，所述預(yù)處理包括混合、粉碎、過濾和離心。

17、在具體的實施方案中，所述步驟(b)中的混合使用水性溶液，例如水溶液；優(yōu)選地，所述水溶液為等滲水溶液；更優(yōu)選地，所述等滲水溶液為等滲氯化鈉水溶液，例如氯化鈉注射液。

18、在具體的實施方案中，所述步驟(b)可以在任何合適的溫度進行。例如，所述步驟(b)可以在以下溫度進行：約0℃、1℃、2℃、3℃、4℃、5℃、6℃、7℃、8℃、9℃、10℃、11℃、12℃、13℃、14℃、15℃、16℃、17℃、18℃、19℃、20℃、25℃、30℃、35℃或40℃，或者約0℃至約40℃內(nèi)的任意子范圍(例如，任意兩個上述溫度之間的任意范圍)，優(yōu)選約2-30℃、較優(yōu)選2-20℃，更優(yōu)選2-8℃，最優(yōu)選4℃。在一些實施方案中，可以在環(huán)境溫度(例如25℃)下進行本公開的所述步驟(b)。

19、在本公開的方法實施方案中，所述植物材料可以是陸生或水生的。優(yōu)選地，所述植物材料選自枸杞。

20、另一方面，本公開提供一種植物外泌體(優(yōu)選枸杞外泌體)，其通過前述一般或優(yōu)選定義的方法實施方案所制備；優(yōu)選地，所述外泌體具有約30-450nm的直徑，優(yōu)選約30-250nm的直徑，更優(yōu)選具有約30-200nm的直徑；和/或所述外泌體具有茶托形狀；和/或所述外泌體與超速離心方法所制備的植物外泌體相比在以下一個或多個方面具有更多的代謝物：脂質(zhì)和脂質(zhì)樣分子、有機氧化合物、苯丙烷和聚酮、有機雜環(huán)化合物、有機酸及其衍生物和/或苯類化合物。

21、另一方面，本公開提供一種植物外泌體(優(yōu)選枸杞外泌體)組合物，例如外泌體溶液，包含通過本公開一般或優(yōu)選定義的方法制備的植物外泌體，以及任選的適合的賦形劑或載體，所述賦形劑或載體就營養(yǎng)保健、藥學(xué)、食品、皮膚病學(xué)和/或化妝品而言是可接受的。

22、在一種具體的實施方案中，所述外泌體組合物是藥物組合物。在具體的實施方案中，所述外泌體組合物包含本公開方法制備的枸杞外泌體；和任選的藥學(xué)上可接受的載體。

23、在一種具體的實施方案中，所述外泌體組合物是食品組合物，其包含通過本公開一般或優(yōu)選定義的方法所制備的植物外泌體，以及任選的其他食物成分和/或可食用賦形劑和/或載體。在具體的實施方案中，所述食品組合物包含由本公開方法所制備的枸杞外泌體，以及任選的其他食物成分和/或可食用賦形劑和/或載體。

24、在一種具體的實施方案中，所述外泌體組合物是美容(或化妝品)組合物，其包含通過本公開一般或優(yōu)選定義的方法所制備的植物外泌體，以及任選地美容/化妝品可接受的賦形劑或載體。在具體的實施方案中，所述美容性組合物包含由本公開方法所制備的枸杞外泌體，以及至少一種美容/化妝品可接受的賦形劑或載體。

25、在一種具體的實施方案中，所述外泌體組合物是營養(yǎng)保健組合物，其包含通過本公開一般或優(yōu)選定義的方法所制備的植物外泌體，以及任選地營養(yǎng)保健可接受的賦形劑或載體。在具體的實施方案中，所述營養(yǎng)保健組合物包含由本公開方法所制備的枸杞外泌體，以及至少一種營養(yǎng)保健可接受的賦形劑或載體。

26、另一方面，本公開還提供由本公開方法所制備的植物外泌體(優(yōu)選枸杞外泌體)或包含其的組合物(包括但不限于藥物組合物/食品組合物/美容或化妝品組合物/營養(yǎng)保健組合物)的用途，其用于治療或預(yù)防—或有助于(或輔助用于)改善、緩解或控制—炎癥、優(yōu)選皮膚炎癥，或在皮膚學(xué)領(lǐng)域用于—或輔助用于—修護、抗炎、抗氧化、抗衰老、美白或保濕。

27、另一方面，本公開還提供由本公開方法所制備的植物外泌體(優(yōu)選枸杞外泌體)或包含其的組合物(包括但不限于藥物組合物/食品組合物/美容組合物/營養(yǎng)保健組合物)在制備產(chǎn)品(藥物、食品、營養(yǎng)保健品、美容/化妝品等)中的用途，所述產(chǎn)品用于治療或預(yù)防—或有助于(或輔助用于)改善、緩解或控制—炎癥、優(yōu)選皮膚炎癥，或在皮膚學(xué)領(lǐng)域用于或輔助用于修護、抗炎、抗氧化、抗衰老、美白或保濕。

28、另一方面，本公開提供一種治療或預(yù)防炎癥、優(yōu)選皮膚炎癥、或治療或預(yù)防皮膚學(xué)癥狀、或輔助用于改善、緩解或控制皮膚學(xué)癥狀的方法，其包括向有需要的對象施用通過前述一般或優(yōu)選定義的方法所制備的植物外泌體(優(yōu)選枸杞外泌體)或包含其的組合物(藥物組合物/食品組合物/美容或化妝品組合物/營養(yǎng)保健組合物)。

29、另一方面，本公開提供上述植物外泌體(優(yōu)選枸杞外泌體)或植物外泌體組合物在生物醫(yī)藥或藥物遞送系統(tǒng)中的用途。

30、另一方面，本公開還提供制備藥物、食品、營養(yǎng)保健品、美容/化妝品組合物的方法，包括根據(jù)本公開一般或優(yōu)選定義的方法制備得到植物外泌體(優(yōu)選枸杞外泌體)，并將所述植物外泌體摻入所述藥物、食品、營養(yǎng)保健品、美容/化妝品組合物中。