本發(fā)明屬于生物醫(yī)學,具體涉及一種人膀胱癌維迪西妥單抗耐藥細胞株及其構(gòu)建方法和相關(guān)應用。
背景技術(shù):
1、膀胱癌(bladder?cancer,blca)為泌尿系統(tǒng)中發(fā)病率最高的惡性腫瘤,近年來全球每年約有55萬例新發(fā)病例,死亡率高達33%。2022年全球新發(fā)61萬余起病例,位列癌癥第9位,其中有22萬余人因此喪生。在考慮到短期內(nèi)吸煙流行的假設(shè)情況下,預計到2040年,男性由于blca的死亡人數(shù)可能在16.3萬至24.5萬之間(死亡率以每年-3%、-2%和-1%的速度遞減),女性的死亡人數(shù)在11.9萬至17.6萬之間(死亡率以每年1%、2%和3%的速度遞增)。目前臨床blca藥物治療以傳統(tǒng)化療、免疫治療為主,雖然手術(shù)和化療可提高患者生存率,但預后效果仍不理想:膀胱癌的復發(fā)率和遷移率高達20%。約50%根治性膀胱切除術(shù)患者術(shù)后有復發(fā)或遷移,大多為遠處遷移。確診為遷移性疾病的患者5年生存率僅為5%,總生存時間9~15個月。在中國,膀胱癌2022年的發(fā)病人數(shù)為92883,占全球新發(fā)病例15%;發(fā)病率1.9%,在所有癌癥排名11;死亡人數(shù)為41364,占全球死亡人數(shù)19%;死亡率1.6%,在所有癌癥排名12。因此,探索膀胱癌耐藥機制,克服耐藥難題,提高藥物療效已成為膀胱癌治療亟待解決的關(guān)鍵課題。
2、維迪西妥單抗(商品名:愛地希?,研究代號:rc48)是由榮昌生物研發(fā)的中國首個原創(chuàng)抗體偶聯(lián)(adc)藥物,是一種新型抗her2?adc,包含能夠結(jié)合靶向腫瘤細胞上人表皮生長因子受體-2(her2)不同表位并顯示出高親和力的新型單克隆抗體,連接子和細胞毒藥物單甲基澳瑞他汀e(mmae)(一種半抑制濃度(ic50)在亞納摩爾等級范圍內(nèi)的有效微管蛋白結(jié)合劑,作為毒素載荷),能以腫瘤表面的?her2?蛋白為靶點,通過精準識別、穿透細胞膜,從而利用小分子細胞毒藥物殺死癌細胞,用于治療局部晚期或轉(zhuǎn)移性胃癌及尿路上皮癌患者。mmae一旦被釋放,也具有殺死鄰近腫瘤細胞(無論是否為?her2?表達)的能力,這被稱為旁殺效應。研究發(fā)現(xiàn),與具有較低膜通透性載荷的?adc?相比,具有較高膜通透性載荷的adc(如?mmae)具有更強的旁殺效應,表明維迪西妥單抗具有更高的抗腫瘤潛力。
3、盡管取得了眾多突破,但adc藥物在絕大部分腫瘤中幾乎都會遇到固有和獲得性耐藥。目前rc48的耐藥機制仍不清楚,因此通過建立膀胱癌rc48耐藥細胞系,從而探索膀胱癌耐藥機制、克服耐藥難題、提高藥物療效是本領(lǐng)域研究人員努力的方向。目前國內(nèi)外暫未見膀胱癌rc48耐藥細胞株、構(gòu)建方法及其應用的相關(guān)報道,也沒有rc48耐藥機制的相關(guān)研究。
技術(shù)實現(xiàn)思路
1、本發(fā)明針對上述問題進行。第一目的在于提供了一種人膀胱癌維迪西妥單抗耐藥細胞株;第二目的在于提供其構(gòu)建方法;第三目的在于提供其在膀胱癌研究中的相關(guān)應用。
2、具體的,本發(fā)明所采取的技術(shù)方案如下:
3、本發(fā)明第一方面,提供了一種膀胱癌維迪西妥單抗耐藥細胞株,以人膀胱移行細胞癌t24細胞為誘導對象,采用低濃度持續(xù)誘導和逐步增加藥物濃度及處理時間的方法,誘導培養(yǎng)細胞5個月;通過細胞形態(tài)學觀察、藥物耐藥性檢測、生長曲線測定、細胞凋亡流式檢測、轉(zhuǎn)錄組學測序、蛋白質(zhì)組學測序?qū)嶒炘u價該細胞的生物學特性,成功構(gòu)建了對rc48耐藥的人膀胱移行細胞癌細胞株。
4、具體的,該細胞株為人膀胱移行細胞癌rc48耐藥細胞株,命名為人膀胱癌耐藥細胞株t24-rc48(homo?sapiens),于2024年6月11日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心(cctcc),保藏編號為cctcc?no:c2024180,保藏地址:中國.武漢.武漢大學。
5、優(yōu)選的,該膀胱癌維迪西妥單抗耐藥細胞株在393.7μg/ml的rc48刺激后,仍能穩(wěn)定生長、傳代的人膀胱移行細胞癌株t24細胞;對rc48的耐藥指數(shù)為9.8??蓱糜诎螂装┠退帣C制等研究。
6、本發(fā)明第二方面,提供了上述膀胱癌維迪西妥單抗耐藥細胞株的誘導構(gòu)建方法,包括如下步驟:
7、(1)將人膀胱移行細胞癌t24細胞株常規(guī)培養(yǎng):將人膀胱移行細胞癌t24細胞
8、株常規(guī)培養(yǎng)于含10%胎牛血清和1%雙抗(100u/ml青霉素和100μg/ml鏈霉素)的mccoy's?5a培養(yǎng)液,于37℃、5%co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
9、(2)將t24細胞株接種于多孔板細胞培養(yǎng)瓶(如6孔板細胞培養(yǎng)瓶),培養(yǎng)一定
10、時間后(如24小時)更換培養(yǎng)基;通過濃度梯度法(分別加入多個濃度梯度的rc48)將最高rc48濃度作為初始ic50;再次更換新鮮培養(yǎng)液,繼續(xù)培養(yǎng)細胞,確定細胞能夠耐受的最高濃度作為初始給藥濃度并傳代該濃度處理下的細胞;
11、(3)將t24細胞接種于t25細胞培養(yǎng)瓶中,24小時后更換新鮮培養(yǎng)液,加入初
12、始給藥濃度的rc48進行誘導,24小時后更換新鮮培養(yǎng)液,細胞繼續(xù)培養(yǎng)至細胞飽和密度為80%以上,傳代1次;
13、(4)重復步驟(3)的操作,逐步增加rc48誘導濃度,直至細胞能在100μg/ml的
14、rc48處理24小時后存活并正常擴增;
15、(5)將t24細胞接種于t25細胞培養(yǎng)瓶中,24小時后更換新鮮培養(yǎng)液,加入
16、100μg/ml的rc48進行誘導,48小時后更換新鮮培養(yǎng)液,細胞繼續(xù)培養(yǎng)至細胞飽和密度為80%以上,傳代1次;
17、(6)重復步驟(5)的操作,逐步增加rc48誘導濃度,經(jīng)過5個月的誘導,獲得
18、rc48誘導建立的人膀胱移行細胞癌rc48耐藥細胞株t24-rc48。
19、細胞形態(tài)觀察顯示,與t24親本細胞對比,t24-rc48形態(tài)上呈現(xiàn)細胞整體偏小,呈現(xiàn)聚集生長,在形態(tài)上發(fā)生了變化;耐藥指數(shù)檢測顯示,t24-rc48對rc48的耐藥指數(shù)為9.8,對rc48的敏感度非常低;生長速率方面,受rc48的影響,t24-rc48明顯小于t24細胞;基因方面,t24-rc48的遺傳背景和生物學特性(基因和蛋白)均發(fā)生了顯著改變。
20、基于上述變化,本發(fā)明第三方面提供了人膀胱癌維迪西妥單抗耐藥細胞株的應用。如在篩選或開發(fā)治療膀胱癌藥物或膀胱癌耐藥逆轉(zhuǎn)藥物中的應用;在制備評價藥物抗腫瘤活性體系或評價抗腫瘤藥物敏感性體系中的應用。
21、進一步優(yōu)選,采用該耐藥細胞株可構(gòu)建為以下相關(guān)研究提供耐藥膀胱癌細胞或動物模型:研究耐藥膀胱癌細胞形態(tài)及生物學特點、研究膀胱癌耐藥機制、評價藥物的抗腫瘤活性、制備腫瘤細胞模型或制備腫瘤動物模型以及體外篩選和開發(fā)膀胱癌耐藥逆轉(zhuǎn)藥物。
22、具體的,膀胱癌細胞模型通過將上述膀胱癌維迪西妥單抗耐藥細胞株或由其建立起來的子代細胞通過轉(zhuǎn)染帶熒光標記的基因構(gòu)建得到;所述膀胱癌動物模型通過皮下接瘤或尾靜脈注射膀胱癌維迪西妥單抗耐藥細胞株建模的方法構(gòu)建得到。
23、本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比,具有以下優(yōu)點:
24、本發(fā)明提供的人膀胱移行細胞癌rc48耐藥細胞株的構(gòu)建方法,采用低濃度持續(xù)誘導并逐步增加rc48藥物濃度及處理時間的方法,有效地誘導了rc48耐藥細胞的形成。與此同時,本發(fā)明的構(gòu)建方法操作簡單,可有效彌補現(xiàn)有方法的不足。
25、本發(fā)明構(gòu)建的人膀胱移行細胞癌rc48耐藥細胞株t24-rc48,與親本細胞t24相比,細胞形態(tài)上整體偏小,呈現(xiàn)聚集生長,增殖周期變長;對rc48的敏感性大大降低,可在含有393.7μg/ml的rc48的培養(yǎng)體系中穩(wěn)定生長、傳代,對rc48的耐藥指數(shù)為9.8??捎糜诎螂装┠退帣C制研究、評價藥物抗腫瘤活性、制備腫瘤細胞模型或制備腫瘤動物模型,為尋找逆轉(zhuǎn)膀胱癌耐藥的有效藥物及方法提供了細胞研究模型,具有良好的應用前景。