本公開涉及抗體領(lǐng)域，更具體而言涉及一種分別靶向免疫細胞例如b細胞表面抗原(例如cd20)的抗體，且該抗體能夠同時結(jié)合fcrn的雙功能抗體。

背景技術(shù)：

1、自身免疫性疾病(下文中有時簡稱自免疾病)是指機體對自身抗原發(fā)生免疫反應(yīng)而導(dǎo)致自身組織損害的疾病，多種自身免疫性疾病往往會涉及攻擊自身抗原的致病性igg抗體的產(chǎn)生。例如：重癥肌無力、天皰瘡、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、多發(fā)性硬化癥、溫?zé)嶙陨砻庖咝匀苎载氀㈥嚢l(fā)性睡眠性血紅蛋白尿、格雷夫斯眼病、自身免疫性溶血性貧血、血小板減少癥、特發(fā)性血小板減少性紫癜、慢性炎癥性脫髓鞘性多發(fā)性神經(jīng)病、原發(fā)性干燥綜合征、新生兒溶血病、格林-巴利綜合征、膜性腎小球腎炎、狼瘡性腎炎、體位性心動過速綜合癥、脫髓鞘疾病、視神經(jīng)脊髓炎、抗髓鞘少突膠質(zhì)細胞糖蛋白免疫球蛋白g抗體相關(guān)疾病等。

2、對于內(nèi)源性致病igg抗體導(dǎo)致的自身免疫性疾病，傳統(tǒng)的治療方法，例如免疫抑制劑、血清置換、靜脈滴注免疫球蛋白、手術(shù)介入等存在療效欠佳、副作用強、過程復(fù)雜和價格昂貴等缺點。

3、b細胞在自身免疫性疾病的發(fā)生和發(fā)展中扮演了重要的角色：首先b細胞會分泌大量的自體抗體，這些抗體可以直接與受體結(jié)合從而激活或者抑制受體的功能，也可以與自體抗原結(jié)合形成免疫復(fù)合物并激活補體系統(tǒng)或效應(yīng)細胞攻擊健康組織；其次，b細胞能夠作為抗原遞呈細胞激活致病性t細胞；再次，b細胞還通過分泌多種細胞因子引起或者加重炎癥反應(yīng)；最后，b細胞能夠促進并維持靶器官內(nèi)異位生發(fā)中心的形成，持續(xù)的釋放高親和力的自體抗體。

4、已有多種靶向b細胞的藥物在自身免疫性疾病中取得了一定的效果。例如利妥昔單抗(rituximab，rtx)，是一種靶向b細胞表面抗原cd20的抗體，可以通過抗體介導(dǎo)的細胞毒效應(yīng)(antibody-dependent?cell-mediated?cytotoxicity,adcc)、補體依賴的細胞毒效應(yīng)(complement?dependent?cytotoxicity，cdc)和抗體依賴性細胞吞噬作用(antibody-dependent?cellular?phagocytosis，adcp)等途徑特異性地清除表達cd20的b細胞，已經(jīng)被美國fda批準用于對于一種或多種腫瘤壞死因子(tumor?necrosis?factor，tnf)拮抗劑無反應(yīng)的類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的治療。此外，rtx在重癥肌無力和系統(tǒng)性紅斑狼瘡治療中，也有許多成功案例。

5、新生兒片段受體(fcrn)是一種mhci(主要組織相容性復(fù)合體i)類分子，由一條α鏈和一條β2-微球蛋白以非共價結(jié)合的方式形成的異源二聚體。在整個生命周期的多種組織細胞都能夠被檢測到，例如內(nèi)皮細胞、上皮細胞，干細胞、角質(zhì)細胞和多種血液細胞等。主要功能是維持著血清中igg和血清白蛋白的水平、調(diào)節(jié)igg在組織中的分布。fcrn以ph依賴性的方式介導(dǎo)再循環(huán)機制實現(xiàn)igg轉(zhuǎn)運，即在酸性條件下(ph6.0-6.5)，fcrn結(jié)合igg的fc片段，在中性及弱堿性條件下(ph7.0-7.5)發(fā)生解離。

6、近年來研究表明，通過阻斷fcrn，在生理中性和酸性ph的條件下均抑制內(nèi)源性igg與fcrn的結(jié)合，可加速igg和致病性自身抗體的降解，從而達到緩解或治療自身免疫性疾病的效果。目前已經(jīng)批準上市抗體藥物艾加莫德(efgartigimod)，其本質(zhì)是人igg1的fc片段以增加與fcrn的親和力，從而抑制內(nèi)源性致病igg抗體對fcrn的結(jié)合。洛利昔珠(rozanolixizumab)，是另一款上市的靶向fcrn的藥物，是一款經(jīng)人源化改造的單克隆抗體。這兩款藥物在臨床試驗中展現(xiàn)出了對重癥肌無力等自身免疫性疾病的較好的治療效果。

7、但是，上述藥物在臨床上仍存在以下不足：首先，僅能針對igg亞型的抗體清除，無法針對由其他亞型的自體抗體引起的自身免疫性疾病產(chǎn)生療效；其次，在某些情況下會產(chǎn)生“反彈效應(yīng)”，即機體為了彌補體內(nèi)驟降的igg抗體反而生產(chǎn)了更多自體抗體。

8、此外，目前還沒有報道既能靶向b細胞的表面抗原，又能同時特異性結(jié)合fcrn從而阻斷fcrn功能的藥物。目前治療自身免疫性疾病的藥物均為靶向單一靶點或單一作用機制，因此在治療效果上尚有很大的提升空間。例如利妥昔單抗(rituximab，rtx)僅能靶向b細胞表面抗原cd20的抗體，但不能與fcrn同時結(jié)合。艾加莫德(efgartigimod)和洛利昔珠(rozanolixizumab)僅能與fcrn結(jié)合，但不能靶向b細胞。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、針對上述諸問題，本公開提供了抗體、其制備方法、組合物等。本公開提供的益處廣泛地適用于抗體治療和診斷領(lǐng)域，并且能夠與各種靶標反應(yīng)的抗體聯(lián)合使用。本發(fā)明提供了能夠特異性結(jié)合b細胞表面抗原(例如，特異性結(jié)合cd19、cd20)的抗體，優(yōu)選嵌合單克隆抗體或人源化單克隆抗體，且優(yōu)選地還能夠同時結(jié)合fcrn，從而抑制/阻斷致病性抗體與fcrn結(jié)合。

2、一方面，本公開提供了一種分離的抗體或其抗原結(jié)合片段，其為雙功能抗體，其中，該抗體或其抗原結(jié)合片段的fab端特異性結(jié)合b細胞表面抗原(例如，特異性結(jié)合cd19、cd20)，該抗體或其抗原結(jié)合片段的fc端能特異性結(jié)合fcrn蛋白。

3、在上述抗體中，所述fab端包含重鏈可變區(qū)(hcdr)和輕鏈可變區(qū)(lcdr)，

4、所述重鏈可變區(qū)包含：

5、(i)hcdr1，其包含與seq?id?no：39具有至少80％、至少85％、至少95％、或100％序列同一性的序列或seq?id?no：39組成；

6、(ii)hcdr2，其包含與seq?id?no：40或seq?id?no：42具有至少80％、至少85％、至少95％、或100％序列同一性的序列或由seq?id?no：40或seq?id?no：42組成；和

7、(iii)hcdr3，其包含與seq?id?no：41具有至少80％、至少85％、至少95％、或100％序列同一性的序列或由seq?id?no：41組成，

8、所述輕鏈可變區(qū)包含：

9、(i)lcdr1，其包含與seq?id?no：36具有至少80％、至少85％、至少95％、或100％序列同一性的序列或由seq?id?no：36組成；

10、(ii)lcdr2，其包含與seq?id?no：37(ats)具有至少60％、至少65％、至少75％、至少95％、或100％序列同一性的序列或由seq?id?no：37(ats)組成；和

11、(iii)lcdr3，其包含與seq?id?no：38具有至少80％、至少85％、至少95％、或100％序列同一性的序列或由seq?id?no：40組成，

12、其中所述fc端包含重鏈恒定區(qū)，該重鏈恒定區(qū)包含與seq?id?no：27具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的序列，且相對于seq?id?no：27具有一個、兩個、三個、四個或者五個選自下組的取代：m252y,w,f,p；s254t,c,a,l；t256e,q,n；h433k,r；n434f,y,w,p,l(eu編號)。

13、在上述抗體中，優(yōu)選地所述取代選自下組：m252y,w；s254t；t256e；h433k；n434f,y,w(eu編號)。

14、在一些實施方案中，所述的抗體或片段具有一個或多個以下性質(zhì)：

15、(a)以10.77nm或更小的ec50結(jié)合人或猴b細胞上表達的cd20；

16、(b)在偏酸性條件下(例如ph5.5-6.5，例如ph6)，以不高于1.71e-08的kd值結(jié)合人的fcrn；

17、(c)在中性條件下(例如ph6.5-7.5，例如ph7、ph7.4)，以不高于2.20e-06的kd值結(jié)合人的fcrn；；

18、(d)特異性結(jié)合fcγr受體，如fcγriiia(cd16aa)、fcγriia(cd32a)和fcγri(cd64)。

19、在本發(fā)明的一些實施方案中，所述的抗體或片段可以通過抗體依賴性細胞介導(dǎo)的細胞毒性(adcc)來誘導(dǎo)殺傷和/或抑制表達人cd20的細胞(例如腫瘤細胞，如表達cd20的腫瘤細胞)；和/或，通過補體依賴的細胞毒性(cdc)來誘導(dǎo)殺傷表達人cd20的細胞(例如腫瘤細胞，如表達cd20的腫瘤細胞)。

20、在一些實施方案中，所述的分離的抗體或其抗原結(jié)合片段包含κ型、或λ型輕鏈恒定區(qū)。

21、一方面，本公開提供了一種分離的核酸分子，其包含編碼如前所述的抗體或片段的核酸序列。

22、一方面，本公開提供了一種載體，其包含如前所述的核酸分子。

23、一方面，本公開提供了一種宿主細胞，其包含如前所述的核酸分子或者如前所述的載體。

24、一方面，本公開提供一種多特異性分子，其包含如前所述的抗體或抗原結(jié)合片段。

25、在一些實施方案中，所述多特異性分子特異性結(jié)合cd20，并且額外地特異性結(jié)合一個或多個其他靶標，例如fcrn。

26、在一些實施方案中，所述多特異性分子還包含至少一種具有針對第二靶標的第二結(jié)合特異性的分子(例如第二抗體)。

27、在一些實施方案中，所述多特異性分子為雙特異性抗體。

28、另一方面，本公開提供了一種藥物組合物或試劑盒，其包含如前所述的抗體或片段、如前所述的核酸分子、如前所述的載體、如前所述的宿主細胞、如前所述的綴合物、如前所述的抗體藥物綴合物、如前所述的多特異性分子；以及藥學(xué)上可接受的載體。

29、另一方面，本公開提供一種制備如前所述的抗體或片段的方法，其包括以下步驟：

30、(i)在如前所述的宿主細胞中表達如前所述的抗體或片段；以及可選地(ii)從所述宿主細胞分離抗體或其抗原結(jié)合片段。

31、再一方面，本公開提供了一種診斷、檢測或監(jiān)測與b細胞相關(guān)疾病的方法，包括向所需要的受試者中施用有效劑量的所述抗體或其抗原結(jié)合片段、所述核酸分子、所述載體、所述宿主細胞、所述綴合物、所述抗體藥物綴合物、所述多特異性分子、或所述藥物組合物或試劑盒。

32、再一方面，本公開提供了一種用于在受試者中診斷、檢測或監(jiān)測與b細胞相關(guān)疾病的方法中的所述抗體或其抗原結(jié)合片段、所述核酸分子、所述載體、所述宿主細胞、所述綴合物、所述抗體藥物綴合物、所述多特異性分子、或所述藥物組合物或試劑盒。

33、再一方面，本公開提供了所述抗體或其抗原結(jié)合片段、所述核酸分子、所述載體、所述宿主細胞、所述綴合物、所述抗體藥物綴合物、所述多特異性分子、或所述藥物組合物或試劑盒在制備用于診斷、檢測或監(jiān)測與b細胞相關(guān)疾病的試劑中的用途。

34、再一方面，本公開提供了一種用于在受試者中治療與b細胞相關(guān)疾病或確定其預(yù)后的方法，包括向所需要的受試者中施用有效劑量的所述抗體或其抗原結(jié)合片段、所述核酸分子、所述載體、所述宿主細胞、所述綴合物、所述抗體藥物綴合物、所述多特異性分子、或所述藥物組合物或試劑盒。

35、在一些實施方案中，所述與b細胞相關(guān)疾病是自身免疫性疾病，所述自身免疫性疾病選自重癥肌無力、天皰瘡、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、多發(fā)性硬化癥、溫?zé)嶙陨砻庖咝匀苎载氀?、陣發(fā)性睡眠性血紅蛋白尿、格雷夫斯眼病、自身免疫性溶血性貧血、血小板減少癥、特發(fā)性血小板減少性紫癜、慢性炎癥性脫髓鞘性多發(fā)性神經(jīng)病、原發(fā)性干燥綜合征、新生兒溶血病、格林-巴利綜合征、膜性腎小球腎炎、狼瘡性腎炎、體位性心動過速綜合癥、脫髓鞘疾病、視神經(jīng)脊髓炎、抗髓鞘少突膠質(zhì)細胞糖蛋白免疫球蛋白g抗體相關(guān)疾病。

36、在一些實施方案中，所述與b細胞相關(guān)疾病是癌癥，所述癌癥選自b細胞淋巴瘤，包括nhl、前b細胞淋巴細胞性白血病/淋巴瘤和成熟b細胞瘤，例如b細胞慢性淋巴細胞性白血病(cll)/小淋巴細胞性淋巴瘤(sll)、b細胞幼淋巴細胞白血病、淋巴漿細胞性淋巴瘤、套細胞淋巴瘤(mcl)、濾泡性淋巴瘤(fl)，包括低級、中級和高級fl，皮膚濾泡中心淋巴瘤、邊緣區(qū)b細胞淋巴瘤(malt型、結(jié)內(nèi)和脾型)、毛細胞白血病、彌漫性大b細胞淋巴瘤、伯基特氏淋巴瘤、漿細胞瘤、漿細胞骨髓瘤、移植后淋巴增生性病癥、華氏巨球蛋白血癥和間變性大細胞淋巴瘤(alcl)。

37、在一些實施方案中，所述受試者為哺乳動物，優(yōu)選為人。