本發(fā)明涉及基因編輯，還涉及魚類性別控制和育性控制育種領(lǐng)域，尤其涉及一種構(gòu)建xx/xy性別決定全雌不育魚類的育種方法及應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、基因編輯技術(shù)在水產(chǎn)養(yǎng)殖相關(guān)領(lǐng)域開展了廣泛的研究，對于提高水產(chǎn)養(yǎng)殖品種的產(chǎn)量、增強(qiáng)抗病能力、提高水產(chǎn)品的品質(zhì)具有重要意義。但遺傳操作的水產(chǎn)養(yǎng)殖材料一旦釋放或逃逸到自然水體中，則有可能與野生型群體發(fā)生自然繁殖，導(dǎo)致遺傳操作位點漸滲至自然界野生型群體中，從而破壞了天然的種群遺傳結(jié)構(gòu)和遺傳多樣性，造成人工遺傳操作位點對野生物種的“基因污染”，產(chǎn)生難以預(yù)見和難以消除的生態(tài)安全風(fēng)險，這阻礙著基于遺傳操作的新型育種技術(shù)和遺傳操作的水產(chǎn)養(yǎng)殖品種在水產(chǎn)養(yǎng)殖行業(yè)中的應(yīng)用及推廣。因此，開發(fā)魚類育性控制技術(shù)尤為重要。

2、水產(chǎn)魚類中廣泛存在個體大小和外部形態(tài)、顏色特征的兩性差異，稱為魚類的兩性異形或者性別二態(tài)性。許多魚類在個體大小等重要生產(chǎn)性狀上表現(xiàn)出顯著的兩性異形，如黃河鯉雌性生長顯著快于雄性，而這種生產(chǎn)性狀的經(jīng)濟(jì)價值與性別密切相關(guān)。因此，開發(fā)魚類的單性育種技術(shù)在魚類養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)上具有重要意義。例如：專利號為zl202110274642.0的發(fā)明專利，通過利用crispr/cas9系統(tǒng)特異性切割魚類的cyp17a1，阻斷魚類的性類固醇激素合成通路，獲得有效突變的f1代cyp17a1雜合子魚(cyp17a1+/-)，并進(jìn)行自交，通過性別標(biāo)記篩選出xx性別遺傳型的f2代cyp17a1純合子(cyp17a1-/-xx)的偽雄魚，并將其與野生型雌魚(cyp17a1+/+xx)進(jìn)行雜交，獲得100％雌性魚群體(cyp17a1+/-xx)，從而獲得全雌養(yǎng)殖魚的群體養(yǎng)殖，實現(xiàn)性別控制育種的效果和養(yǎng)殖產(chǎn)量的提升。但是，此單性魚類基因型為cyp17a1+/-xx，攜帶了基因編輯位點，可能存在逃逸到自然水體中與野生群體交配繁殖，造成基因污染，存在生態(tài)風(fēng)險。因此，對于攜帶基因編輯位點魚類實現(xiàn)育性控制尤為重要。

3、三倍體為非偶數(shù)染色體組，染色體在減數(shù)分裂過程中不能正常聯(lián)會配對，無法產(chǎn)生正常的配子，結(jié)果常常導(dǎo)致性腺不能發(fā)育，可用于育性控制技術(shù)的開發(fā)。不育的三倍體經(jīng)濟(jì)魚類因為沒有性成熟階段性腺發(fā)育的能量損耗，在生長能力方面具有潛在益處，但也存在孵化率低的問題。如果能將基因編輯技術(shù)、性別控制技術(shù)以及育性控制技術(shù)有機(jī)結(jié)合，并在水產(chǎn)遺傳育種領(lǐng)域進(jìn)行研發(fā)和應(yīng)用，將有效促進(jìn)水產(chǎn)養(yǎng)殖行業(yè)可持續(xù)發(fā)展。

4、有鑒于此，有必要研發(fā)針對xx/xy性別決定的水產(chǎn)養(yǎng)殖魚類研發(fā)可高效獲得全雌不育群體的技術(shù)，這對水產(chǎn)魚類的性別控制育種和單性群體的養(yǎng)殖以及育性控制育種有著重要的價值和生產(chǎn)意義。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、針對上述現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，本發(fā)明的目的在于提供一種構(gòu)建xx/xy性別決定全雌不育魚類的育種方法及應(yīng)用。

2、為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供了一種構(gòu)建xx/xy性別決定全雌不育魚類的育種方法，采用基因編輯技術(shù)敲除魚類的性類固醇激素合成通路的催化酶編碼基因，用以阻斷魚類的性類固醇激素合成通路，并篩選獲得有效突變的純合子xx性別遺傳型的偽雄魚，再將所述偽雄魚與改良異源四倍體鯽鯉雌魚進(jìn)行雜交，由此得到異源三倍體群體，該群體全部發(fā)育為雌魚，且性腺發(fā)育障礙而不育，從而獲得全雌不育群體。

3、作為本發(fā)明的進(jìn)一步改進(jìn)，所述性類固醇激素合成通路的催化酶編碼基因包括cyp17a1催化酶編碼基因、cyp19a1a催化酶編碼基因中的一種。

4、作為本發(fā)明的進(jìn)一步改進(jìn)，所述方法包括如下步驟：

5、s1、利用基因編輯技術(shù)敲除魚類中的cyp17a1基因，獲得cyp17a1缺失純合子魚；

6、s2、從所述cyp17a1缺失純合子魚中，篩選出無雄性性別標(biāo)記、xx性別遺傳型的cyp17a1缺失純合子魚，其表現(xiàn)為生理雄性，記為偽雄魚；

7、s3、將所述偽雄魚(cyp17a1-/-xx，2n＝100)與改良異源四倍體鯽鯉雌魚(cyp17a1+/+/+/+xxxx，4n＝200)進(jìn)行雜交，經(jīng)過人工催產(chǎn)和授精后獲得異源三倍體鯽鯉群體(cyp17a1+/+/-xxx，3n＝150)，該群體全部是基因型為cyp17a1+/+/-的雌魚，且不育，由此獲得全雌不育群體。

8、作為本發(fā)明的進(jìn)一步改進(jìn)，在步驟s1中，獲得所述cyp17a1缺失純合子魚包括如下步驟：

9、s11、利用基因編輯技術(shù)敲除魚類中的cyp17a1基因，獲得f0代；

10、s12、將f0代雄魚與野生型雌魚進(jìn)行雜交，并對獲得的f1代的基因組進(jìn)行目的檢測片段擴(kuò)增和測序，檢測f1代突變情況，獲得有效突變的f1代cyp17a1雜合子魚；

11、s13、將所述f1代cyp17a1雜合子魚進(jìn)行自交，篩選獲得f2代cyp17a1缺失純合子魚。

12、作為本發(fā)明的進(jìn)一步改進(jìn)，在步驟s11中，所述基因編輯技術(shù)為采用crispr/cas9系統(tǒng)特異性切割魚類的cyp17a1基因，實現(xiàn)魚類cyp17a1基因的編輯，具體過程為：

13、p1、基于crispr/cas9系統(tǒng)，設(shè)計魚類cyp17a1基因編輯靶位點；

14、p2、根據(jù)所述魚類cyp17a1基因編輯靶位點設(shè)計相應(yīng)的引物，并合成含有所述魚類cyp17a1基因編輯靶位點的擴(kuò)增片段的rna，記為grna；

15、p3、按預(yù)定比例配制grna、cas9?mrna的注射混合物，得到cyp17a1基因編輯的注射混合物，并將所述cyp17a1基因編輯的注射混合物進(jìn)行魚類受精卵的顯微注射(此步驟操作也可能由于靶向編輯效率的提升，而直接獲得s3所述的cyp17a1缺失純合子魚，而省略s12和s13所述的獲得cyp17a1+/-雜合子并自交的步驟)；

16、p4、將注射后的魚類受精卵養(yǎng)至性成熟，得到f0代。

17、作為本發(fā)明的進(jìn)一步改進(jìn)，在步驟p2中，所述魚類cyp17a1基因編輯靶位點位于cyp17a1基因1號外顯子上，包括第一靶位點和第二靶位點。

18、作為本發(fā)明的進(jìn)一步改進(jìn)，在步驟s13中，通過酶切鑒定篩選出在靶位點處缺失預(yù)定數(shù)量的堿基對的f2代cyp17a1缺失純合子魚。

19、作為本發(fā)明的進(jìn)一步改進(jìn)，在步驟s2中，所述偽雄魚為具有正常精巢結(jié)構(gòu)和精子發(fā)生的雄魚，但無雄性的第二性征(鰓蓋的珠星和胸鰭的生殖結(jié)節(jié))；所述偽雄魚的篩選過程為：通過性別標(biāo)記的方式篩選出xx性別遺傳型的cyp17a1缺失純合子魚。

20、作為本發(fā)明的進(jìn)一步改進(jìn)，所述魚類為鯉科魚類。

21、為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明還提供了上述構(gòu)建xx/xy性別決定全雌不育魚類的育種方法在水產(chǎn)養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)魚類性別控制育種以及育性控制領(lǐng)域中的應(yīng)用。

22、本發(fā)明的有益效果是：

23、1、本發(fā)明提供的構(gòu)建xx/xy性別決定全雌不育魚類的育種方法，提出了將基因編輯育種的偽雄魚與改良異源四倍體鯽鯉雌魚雜交以獲得全雌不育魚類的發(fā)明構(gòu)思。本發(fā)明通過利用crispr/cas9系統(tǒng)特異性切割魚類的cyp17a1基因(重要的性類固醇激素合成通路的催化酶編碼基因)，阻斷魚類的性類固醇激素合成通路，可顯著降低雌激素和雄激素的水平，無論其性別遺傳型為xx還是xy，cyp17a1缺失純合子均可發(fā)育為具有正常精巢結(jié)構(gòu)和精子發(fā)生的雄魚，但無雄性的第二性征。在此基礎(chǔ)上，本發(fā)明使用性別標(biāo)記篩選出xx性別遺傳型的cyp17a1缺失純合子魚，將其與改良異源四倍體鯽鯉進(jìn)行雜交即可獲得異源三倍體鯽鯉，該群體是全雌不育群體。該方法不需要使用激素處理即可獲得偽雄魚，避免了藥物對環(huán)境的污染；也不需要使用冷休克、靜水壓等操作繁瑣的方法獲得三倍體，具有安全、高效的優(yōu)點。

24、2、本發(fā)明提供的構(gòu)建xx/xy性別決定全雌不育魚類的育種方法，能夠高效的獲得全雌不育群體，該群體是雌性單性群體，會較雌雄混合群體具有明顯的生長優(yōu)勢。同時，該群體也是三倍體群體，由于三倍體具有非偶數(shù)倍染色體組，在減數(shù)分裂過程中，染色體會發(fā)生聯(lián)會紊亂，無法生產(chǎn)正常的配子而不育，能夠有效的防止人工遺傳操作位點在野生群體中發(fā)生漂移造成的“基因污染”，以此保障天然種群的生態(tài)安全。且本發(fā)明提供的方法相較于常規(guī)的三倍體誘導(dǎo)方式具有更高的孵化率。

25、3、本發(fā)明提供的構(gòu)建xx/xy性別決定全雌不育魚類的育種方法，在水產(chǎn)養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)魚類中有廣泛的適應(yīng)性和擴(kuò)展性，大大擴(kuò)展了本發(fā)明提供的方法在水產(chǎn)養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)魚類性別控制育種領(lǐng)域以及育性控制領(lǐng)域中的應(yīng)用范圍。