背景技術(shù)：

1、合成生物學(xué)和代謝工程改造已成為跨多學(xué)科的重要工具(keasling,2010)。然而，哺乳動物系統(tǒng)中的廣泛使用發(fā)展緩慢，并且在這些系統(tǒng)內(nèi)的進(jìn)展在很大程度上局限于例如治療性蛋白生產(chǎn)(例如單克隆抗體)或疾病的研究和治療(例如代謝重編程)的應(yīng)用(davy等人，2017；schukur和fussenegger,2016)。在這些工作中，除基因工具，如病毒或細(xì)菌編輯或調(diào)節(jié)系統(tǒng)以外，很少有人關(guān)注使用來自其它分類單元(即細(xì)菌或植物)的基因的哺乳動物細(xì)胞異源工程改造(mojica和montoliu,2016；zhang等人，2006)。相比之下，細(xì)菌、酵母或植物的代謝工程改造工作已經(jīng)采用了多種分類的轉(zhuǎn)基因以用于從醫(yī)藥和化妝品到能源和農(nóng)業(yè)的應(yīng)用(heider和wendisch,2015；nielsen,2015；sack等人，2015)。組織工程改造中的最近進(jìn)展已經(jīng)拓展了人們關(guān)于動物細(xì)胞培養(yǎng)在食品和營養(yǎng)、機(jī)器人和生物傳感器的可能應(yīng)用的看法(banerjee和bhunia,2009；rubio等人，2019)。這一轉(zhuǎn)變提供了機(jī)會，以重新審視哺乳動物代謝工程改造，和努力拓展包括跨分類的工程改造用于廣泛應(yīng)用。

2、一種所述應(yīng)用為通過細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)肉類(以各種術(shù)語已知，此文將使用“培養(yǎng)肉”)，其已被提議作為解決畜牧業(yè)的環(huán)境、倫理和公共衛(wèi)生問題的一種手段(mattick等人，2015；post,2012)。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、在第一方面中，本文提供一種工程改造細(xì)胞，其內(nèi)源性合成八氫番茄紅素且包含編碼八氫番茄紅素合成酶的異源多核苷酸。在一些實施方式中，所述八氫番茄紅素合成酶具有與seq?id?no:1或seq?id?no:_至少90％相同的序列。在一些實施方式中，所述細(xì)胞內(nèi)源性合成番茄紅素且包含編碼八氫番茄紅素去飽和酶的異源多核苷酸。在一些實施方式中，所述八氫番茄紅素去飽和酶具有與seq?id?no:3至少90％相同的序列。在一些實施方式中，所述細(xì)胞內(nèi)源性合成β-胡蘿卜素且包含編碼番茄紅素環(huán)化酶的異源多核苷酸。在一些實施方式中，所述番茄紅素環(huán)化酶具有與seq?id?no:5或seq?id?no:_至少90％相同的序列。在一些實施方式中，所述細(xì)胞是哺乳動物細(xì)胞。在一些實施方式中，細(xì)胞是pax7+哺乳動物肌肉前體細(xì)胞。在一些實施方式中，所述細(xì)胞是肌動蛋白+肌球蛋白重鏈(mhc)+哺乳動物多核肌管。在一些實施方式中，所述工程改造細(xì)胞中的總類胡蘿卜素產(chǎn)量比沒有編碼八氫番茄紅素合成酶、八氫番茄紅素去飽和酶和番茄紅素環(huán)化酶的所述異源多核苷酸的所述細(xì)胞中的總類胡蘿卜素產(chǎn)量高至少5倍。

2、在第二方面中，本文提供一種制造如本文所描述的工程改造細(xì)胞的方法，其包括向天然合成香葉基香葉基焦磷酸的細(xì)胞中引入(i)編碼八氫番茄紅素合成酶的異源多核苷酸；(ii)編碼八氫番茄紅素去飽和酶的異源多核苷酸；(iii)編碼番茄紅素環(huán)化酶的異源多核苷酸；或(iv)其組合。在一些實施方式中，所述細(xì)胞是pax7+哺乳動物肌肉前體細(xì)胞。

3、在第三方面中，本文提供一種工程改造細(xì)胞，其內(nèi)源性合成維生素c且包含一種或多種編碼udp-葡萄糖6-脫氫酶(ugdh)、udp葡萄糖醛酸基轉(zhuǎn)移酶1(ugt1a1)、醛-酮還原酶家族1(akr1a1)、鈣調(diào)素(rgn)和l-古洛糖酸-γ-內(nèi)酯氧化酶(gulo)的外源多核苷酸。

4、在第四方面中，本文提供一種工程改造細(xì)胞，其內(nèi)源性合成姜黃素且包含一種或多種編碼酪氨酸氨裂解酶(ptal)、4-香豆酸-coa連接酶(4cl)、苯基丙?；?二酮-coa合成酶(dcs)和姜黃素合成酶(curs3)的異源多核苷酸。

5、在第五方面中，本文提供一種工程改造細(xì)胞，其內(nèi)源性合成大麻二酚(cbd)且包含一種或多種編碼3,5,7-三氧代十二?；?coa合成酶(ols)、橄欖醇酸環(huán)化酶(oac)、大麻萜酚酸合成酶(cbgas)和大麻二酚酸合成酶(cbdas)的異源多核苷酸。

6、在第六方面中，本文提供一種工程改造細(xì)胞，其包含編碼具有與seq?id?no:7至少95％相同的序列的納米抗體v565的異源多核苷酸。在一些實施方式中，所述多核苷酸編碼通過可裂解多肽連接子與腫瘤壞死因子α(tnfα)共價連接的所述v565納米抗體。在一些實施方式中，所述可裂解多肽連接子包含seq?id?no:9。

7、在第七方面中，本文提供一種工程改造細(xì)胞，其包含編碼具有與seq?id?no:8至少95％相同的序列的抗微生物肽16(amp16)的異源多核苷酸。在一些實施方式中，所述多核苷酸編碼至少2個、至少3個、至少4個、至少5個、至少6個、至少7個、至少8個、至少9個或至少10個amp16的重復(fù)序列，每個重復(fù)序列由包含asn-pro-val重復(fù)序列的連接子多肽間隔開。

8、在第八方面中，本文提供一種培養(yǎng)肉產(chǎn)品，其包含匯合的無血清培養(yǎng)物，所述培養(yǎng)物包含在食品安全基質(zhì)上接種的如本文所描述的工程改造細(xì)胞。在一些實施方式中，所述基質(zhì)是膜。在一些實施方式中，所述基質(zhì)是海綿或三維基質(zhì)。在一些實施方式中，所述基質(zhì)是殼聚糖基質(zhì)。在一些實施方式中，所述細(xì)胞培養(yǎng)物包含衍生自pax7+哺乳動物衛(wèi)星細(xì)胞的多核肌管。在一些實施方式中，所述多核肌管表達(dá)肌球蛋白重鏈(mhc)和肌動蛋白。

9、本技術(shù)還包含以下的實施方式：

10、1.一種工程改造細(xì)胞，其內(nèi)源性合成八氫番茄紅素且包含編碼八氫番茄紅素合成酶的異源多核苷酸。

11、2.根據(jù)實施方式1所述的工程改造細(xì)胞，其中所述八氫番茄紅素合成酶具有與seqid?no:1或seq?id?no:10至少90％相同的序列。

12、3.根據(jù)實施方式1或2所述的工程改造細(xì)胞，其中所述細(xì)胞內(nèi)源性合成番茄紅素且包含編碼八氫番茄紅素去飽和酶的異源多核苷酸。

13、4.根據(jù)實施方式3所述的工程改造細(xì)胞，其中所述八氫番茄紅素去飽和酶具有與seq?id?no:3至少90％相同的序列。

14、5.根據(jù)實施方式3或4所述的工程改造細(xì)胞，其中所述細(xì)胞內(nèi)源性合成β-胡蘿卜素且包含編碼番茄紅素環(huán)化酶的異源多核苷酸。

15、6.根據(jù)實施方式5所述的工程改造細(xì)胞，其中所述番茄紅素環(huán)化酶具有與seq?idno:5或seq?id?no:11至少90％相同的序列。

16、7.根據(jù)實施方式1-6中任一項所述的工程改造細(xì)胞，其中所述細(xì)胞是哺乳動物細(xì)胞。

17、8.根據(jù)實施方式1-7中任一項所述的工程改造細(xì)胞，其中細(xì)胞是pax7+哺乳動物肌肉前體細(xì)胞。

18、9.根據(jù)實施方式1-7中任一項所述的工程改造細(xì)胞，其中所述細(xì)胞是肌動蛋白+肌球蛋白重鏈(mhc)+哺乳動物多核肌管。

19、10.根據(jù)實施方式5或6所述的細(xì)胞，其中所述工程改造細(xì)胞中的總類胡蘿卜素產(chǎn)量比沒有編碼八氫番茄紅素合成酶、八氫番茄紅素去飽和酶和番茄紅素環(huán)化酶的所述異源多核苷酸的所述細(xì)胞中的總類胡蘿卜素產(chǎn)量高至少5倍。

20、11.一種制造根據(jù)實施方式1-10中任一項所述的細(xì)胞的方法，其包括向天然合成香葉基香葉基焦磷酸的細(xì)胞中引入(i)編碼八氫番茄紅素合成酶的異源多核苷酸；(ii)編碼八氫番茄紅素去飽和酶的異源多核苷酸；(iii)編碼番茄紅素環(huán)化酶的異源多核苷酸；或(iv)其組合。

21、12.根據(jù)實施方式11所述的方法，其中所述細(xì)胞是pax7+哺乳動物肌肉前體細(xì)胞。

22、13.一種工程改造細(xì)胞，其內(nèi)源性合成維生素c且包含一種或多種編碼udp-葡萄糖6-脫氫酶(ugdh)、udp葡萄糖醛酸基轉(zhuǎn)移酶1(ugt1a1)、醛-酮還原酶家族1(akr1a1)、鈣調(diào)素(rgn)和l-古洛糖酸-γ-內(nèi)酯氧化酶(gulo)的外源多核苷酸。

23、14.一種工程改造細(xì)胞，其內(nèi)源性合成姜黃素且包含一種或多種編碼酪氨酸氨裂解酶(ptal)、4-香豆酸-coa連接酶(4cl)、苯基丙?；?二酮-coa合成酶(dcs)和姜黃素合成酶(curs3)的異源多核苷酸。

24、15.一種工程改造細(xì)胞，其內(nèi)源性合成大麻二酚(cbd)且包含一種或多種編碼3,5,7-三氧代十二酰基-coa合成酶(ols)、橄欖醇酸環(huán)化酶(oac)、大麻萜酚酸合成酶(cbgas)和大麻二酚酸合成酶(cbdas)的異源多核苷酸。

25、16.一種工程改造細(xì)胞，其包含編碼具有與seq?id?no:7至少95％相同的序列的納米抗體v565的異源多核苷酸。

26、17.根據(jù)實施方式16所述的工程改造細(xì)胞，其中所述多核苷酸編碼通過可裂解多肽連接子與腫瘤壞死因子α(tnfα)共價連接的所述v565納米抗體。

27、18.根據(jù)實施方式17所述的工程改造細(xì)胞，其中所述可裂解多肽連接子包含seqid?no:9。

28、19.一種工程改造細(xì)胞，其包含編碼具有與seq?id?no:8至少95％相同的序列的抗微生物肽16(amp16)的異源多核苷酸。

29、20.根據(jù)實施方式19所述的工程改造細(xì)胞，其中所述多核苷酸編碼至少2個、至少3個、至少4個、至少5個、至少6個、至少7個、至少8個、至少9個或至少10個amp16的重復(fù)序列，每個重復(fù)序列由包含asn-pro-val重復(fù)序列的連接子多肽間隔開。

30、21.一種培養(yǎng)肉產(chǎn)品，其包含匯合的無血清培養(yǎng)物，所述培養(yǎng)物包含在食品安全基質(zhì)上接種的根據(jù)實施方式1-10和13-20中任一項所述的細(xì)胞。

31、22.根據(jù)實施方式21所述的培養(yǎng)肉產(chǎn)品，其中所述基質(zhì)是膜。

32、23.根據(jù)實施方式21所述的培養(yǎng)肉產(chǎn)品，其中所述基質(zhì)是海綿或三維基質(zhì)。

33、24.根據(jù)實施方式21-23中任一項所述的培養(yǎng)肉產(chǎn)品，其中所述基質(zhì)是殼聚糖基質(zhì)。

34、25.根據(jù)實施方式21-24中任一項所述的培養(yǎng)肉產(chǎn)品，其中所述細(xì)胞培養(yǎng)物包含衍生自pax7+哺乳動物衛(wèi)星細(xì)胞的多核肌管。

35、26.根據(jù)實施方式25所述的培養(yǎng)肉產(chǎn)品，其中所述多核肌管表達(dá)肌球蛋白重鏈(mhc)和肌動蛋白。