本發(fā)明涉及從蛇毒中分離純化血凝酶的方法，具體涉及的是一種從長(zhǎng)白山白眉蝮蛇蛇毒中分離純化血凝酶的方法。

背景技術(shù)：

1、1936年奧地利學(xué)者klobusitzky和konig用硫酸銨、醋酸鉛沉淀法、透析法首次從巴西矛頭蝮蛇（bothropsatnox）的毒液中分離得到一種具有促凝特性的類(lèi)凝血酶（thrombin-like?enzeme，簡(jiǎn)稱(chēng)tle)，先命名為血凝酶，后由世界衛(wèi)生組織命名為巴曲酶（batroxobin）。20年后，隨著質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)和蛋白分離技術(shù)的逐漸成熟，以血凝酶制成的用于止血研究、血液凝固、診斷和治療的注射用血凝酶問(wèn)世。由于血凝酶具有較高的應(yīng)用價(jià)值，所以很多公司都投入大量的人力物力對(duì)tle進(jìn)行開(kāi)發(fā)和研究。但是，由于蛇毒成份復(fù)雜，tle在蛇毒蛋白中含量較低，因此從蛇毒中分離純化tle是一種比較困難的工作。作為分離純化手段，一般需經(jīng)過(guò)凝膠過(guò)濾層析、離子交換層析、親和層析以及鹽析、超濾、凍干等方法，才能獲得均一的tle。不同種屬蛇毒tle分子量、等電點(diǎn)均有所差異，所以從不同種屬蛇毒分離純化tle的方法不固定，需根據(jù)各自的特點(diǎn)確定不同的純化模式。目前，國(guó)內(nèi)外已對(duì)從多種蛇毒中分離純化的tle進(jìn)行了報(bào)道。

2、現(xiàn)有技術(shù)在處理大規(guī)模蛇毒時(shí)，一次性上樣量小，分離效果差，無(wú)法滿(mǎn)足工業(yè)化生產(chǎn)的需求。其次，現(xiàn)有技術(shù)的收率低，這不僅增加了生產(chǎn)成本，也限制了其在工業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用。再次，現(xiàn)有技術(shù)難以制備高純度、單一組分目的蛋白或活性組分蛋白，這限制了血凝酶的應(yīng)用范圍和使用效果。臨床應(yīng)用中存在著一定的副作用。最后，現(xiàn)有技術(shù)在分離純化血凝酶時(shí)，往往采用陰離子交換層析和分子篩層析、親和層析方法進(jìn)行。采用這些純化工藝，存在生產(chǎn)周期長(zhǎng)、收率底、純度低等問(wèn)題。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的是提供一種從長(zhǎng)白山白眉蝮蛇蛇毒中分離純化血凝酶的方法，該方法一次層析上樣量大、收率高、純度高，有利于工業(yè)化生產(chǎn)。

2、本發(fā)明首先提供了一種從長(zhǎng)白山白眉蝮蛇蛇毒中分離純化血凝酶的方法，包括如下步驟：

3、將長(zhǎng)白山白眉蝮蛇蛇毒溶液依次采用capto?sp?impres陽(yáng)離子柱層析和source15?phe疏水柱層析，得到血凝酶。

4、上述的方法中，所述長(zhǎng)白山白眉蝮蛇蛇毒溶液的濃度為50-200g/l；

5、所述長(zhǎng)白山白眉蝮蛇蛇毒溶液的溶劑為ph7.5-8.5、濃度為0.02-0.05mol/l的tris-hcl緩沖液；具體為ph8.0、濃度為0.05mol/l的tris-hcl緩沖液。

6、上述的方法中，所述capto?sp?impres陽(yáng)離子柱層析的步驟包括如下：將所述長(zhǎng)白山白眉蝮蛇蛇毒溶液上樣于capto?sp?impres陽(yáng)離子柱；以ph7.5-8.5、濃度0.02-0.05mol/l的tris-hcl緩沖液為a相，以含nacl濃度為0.5-1mol/l的ph7.5-8.5、濃度0.02-0.05mol/l的tris-hcl緩沖液為b相，梯度洗脫，收集層析圖譜中的第ⅳ峰組分；

7、具體的，所述第ⅳ峰組分收集在4℃下進(jìn)行；

8、所述長(zhǎng)白山白眉蝮蛇蛇毒溶液上樣的流速可為150-250ml/min；

9、所述capto?sp?impres陽(yáng)離子柱層析中的流速可為150-250ml/min；

10、所述梯度洗脫的條件如下：0-15%b?2cv，15-20%b?3cv，20-100%b?2cv，100%b?1cv，100%-0%b?1cv，0%b?1cv。

11、所述capto?sp?impres陽(yáng)離子柱經(jīng)ph7.5-8.5、濃度0.02-0.05mol/l的tris-hcl緩沖液平衡；

12、在梯度洗脫之前先采用ph7.5-8.5、濃度0.02-0.05mol/l的tris-hcl緩沖液淋洗；具體的，淋洗的流速為150-250ml/min；淋洗的柱體積為1-3cv。

13、上述的方法中，所述source?15?phe疏水柱層析的步驟包括如下：在所述capto?spimpres陽(yáng)離子柱層析所得第ⅳ峰組分中加入nacl，使活性組分電導(dǎo)率達(dá)到120-140ms/cm；然后將其上樣于source?15?phe疏水柱，以nacl濃度為1-2mol/l的ph7.5-8.5、0.02-0.05mol/l的tris-hcl緩沖液為a相，以ph7.5-8.5、濃度0.02-0.05mol/l的tris-hcl緩沖液為b相，進(jìn)行梯度洗脫，收集層析圖譜中的第ii峰組分，即得到所述血凝酶；

14、具體的，所述第ii峰組分收集在4℃下進(jìn)行；

15、所述source?15?phe疏水柱層析上樣流速可為50-150?ml/min；

16、所述梯度洗脫的流速可為50-150?ml/min；

17、所述梯度洗脫的條件如下：0-100%b?20cv。

18、所述source?15?phe疏水柱經(jīng)nacl濃度為1-2mol/l的ph7.5-8.5、0.02-0.05mol/l的tris-hcl緩沖液平衡；

19、所述梯度洗脫之前先采用nacl濃度為1-2mol/l的ph7.5-8.5、0.02-0.05mol/l的tris-hcl緩沖液淋洗；具體的，淋洗的流速為50-150ml/min；淋洗的柱體積為1-5cv。

20、上述的方法中，所述方法還包括依次采用sephadex?g-25凝膠過(guò)濾柱層析和source?15?rpc反相柱層析的步驟。

21、上述的方法中，所述sephadex?g-25凝膠過(guò)濾柱層析的步驟包括如下：將上述方法制備得到的血凝酶上樣于sephadex?g-25凝膠過(guò)濾柱，用水洗脫，收集活性組分；

22、具體的，所述活性組分收集在4℃下進(jìn)行；

23、所述血凝酶的上樣流速可為150-500ml/min；

24、所述水洗脫的流速可為150-500ml/min；所述水洗脫的體積為0.8-1.5cv。

25、上述的方法中，所述source?15?rpc反相柱層析的步驟包括如下：將所述sephadexg-25凝膠過(guò)濾柱層析后所得活性組分上樣于source?15?rpc反相柱，然后以含0.1%三氟乙酸的0-20%乙腈水溶液為a相，以含0.1%三氟乙酸的80-100%乙腈水溶液為b相，梯度洗脫，按峰收集，得到血凝酶a和血凝酶b；

26、具體的，所述血凝酶a和血凝酶b在4℃下收集；

27、所述sephadex?g-25凝膠過(guò)濾柱層析后所得活性組分的上樣流速可為10-50ml/min；

28、所述梯度洗脫的流速可為10-50ml/min；

29、所述梯度洗脫的條件如下：0-30%b?5cv，30-35%b?10cv，35-100%b?5cv，100-0%b2cv。

30、所述source?15?rpc反相柱用含0.1%三氟乙酸的0-10%乙腈水溶液平衡；

31、所述梯度洗脫之前先采用含0.1%三氟乙酸的0-10%乙腈水溶液淋洗；具體的，淋洗的流速為10-50ml/min；淋洗的柱體積為1-5cv。

32、本發(fā)明還提供了上述方法制備得到的血凝酶。

33、以及上述方法制備得到的血凝酶a和血凝酶b。

34、最后，本發(fā)明提供了一種血凝酶a，其氨基酸序列如氨基酸序列1；

35、具體的，所述血凝酶a的分子量為26447da，含有3個(gè)n-糖基化位點(diǎn)；

36、本發(fā)明還提供了一種血凝酶b，其氨基酸序列如氨基酸序列2；

37、具體的，血凝酶b的分子量為26446da，含有2個(gè)n-糖基化位點(diǎn)。

38、本發(fā)明具有如下有益效果：

39、（1）本發(fā)明采用capto?sp?impres?陽(yáng)離子柱層析進(jìn)行蛇毒溶液上樣；capto?spimpres強(qiáng)陽(yáng)離子交換介質(zhì)具有高結(jié)合載量和小粒徑特點(diǎn)；

40、（2）本發(fā)明的方法通過(guò)改進(jìn)層析技術(shù)和條件，提高了血凝酶的收率，降低了生產(chǎn)成本，有利于工業(yè)化、多批次生產(chǎn)；每克蛇毒可制備約1-2mg血凝酶；

41、（3）本發(fā)明通過(guò)采用陽(yáng)離子層析和疏水層析不同純化原理純化，以去除雜蛋白殘留；解決了少量雜蛋白（堿性蛋白的神經(jīng)毒素、類(lèi)凝血激酶）殘留的問(wèn)題；

42、（4）本發(fā)明的方法通過(guò)改進(jìn)層析技術(shù)和條件，避免使用沉淀和透析等技術(shù)，通過(guò)調(diào)節(jié)電導(dǎo)率和ph值等方法進(jìn)行下一步層析，減少了活性損失、縮短了生產(chǎn)周期；

43、（5）本發(fā)明的方法中層析過(guò)程在18℃條件下進(jìn)行，樣品收集在4℃避光立式冷藏箱中完成，避免了血凝酶在室溫水溶液8-10h內(nèi)逐漸失活的問(wèn)題；

44、（6）本發(fā)明通過(guò)采用source?15?rpc反相色譜柱層析，有效分離制備高純度血凝酶；source?15?rpc具有寬ph值范圍（1-12）、卓越的選擇性、耐化學(xué)性、高載量和高流速下高分離度等特性；source?15?rpc基于單一尺寸的直徑為15μm的剛性聚苯乙烯/二乙烯基苯小球；該基質(zhì)具有卓越的選擇性；小球的單分散性可在高流速下產(chǎn)生穩(wěn)定的柱床、低背壓和出色的分離結(jié)果；source?15?rpc的物理和化學(xué)穩(wěn)定性較高且批次間可重現(xiàn)性極高，非常適合工業(yè)規(guī)模操作的所有階段-從研究和工藝開(kāi)發(fā)到規(guī)模擴(kuò)大和生產(chǎn)；

45、（7）本發(fā)明首次確定氨基酸序列。